专利名称：环状神经激肽a的拮抗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及环状肽衍生物，是神经激肽A的拮抗剂。
P物质和相关的速激肽类、神经激肽A和神经激肽B是一组天然存在的肽，在机体组织中有广泛的分布並有多种生物作用。虽然P物质和神经激肽B的激动剂和拮抗剂是已知的，而且虽然神经激肽A的激动剂也是已知的，但神经激肽A的拮抗剂尚无报导。本申请者现在发现了一组神经激肽A的拮抗剂。这样的化合物不仅从生化观点看是重要的，而且也有有价值的药理和医学用途。
下面的结构1的环状肽衍生物或它们的药用盐是神经激肽A的拮抗剂
式中A1是Gln，gln，His，his，Asn，asn或一个下式所示的基团
式中R″是被氨基取代的C1-C5烷基；A2是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，Phe(4′-cl)，Npa，npa，Phe(4 ′-NO2)，或phe(4′-NO2)；A3是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)，phe(4′-NO2)，Val或valA4是Gly，Ala，ala或β-Ala；B是下式中的一个基团
(b)-S-CH2-，(c)-O-CH2-，(d)-CH＝CH-，
(f)-CH2-CH(OH)-，和
式中R是氢原子或是C1～C4的烷基，或是一个苯基亚烷基，该亚烷基部分为直链或支链，含1～6个碳原子，苯部分基未取代或被C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、羟基或卤素单取代；R1和R2各自独立地是选自如下的基团异丙基，异丁基，仲丁基，正丁基和2-(甲硫)乙基。
这些新的环状肽衍生物是神经激肽A的拮抗剂，因而用作抗哮喘，抗炎和抗关节炎药物。
下面的氨基酸以及氨基和羧基端基的通用的缩写用于本说明书的始终Gly(或G)-甘氨酸，Ala(或A)-丙氨酸，Val(或V)-缬氨酸，Leu(或L)-亮氨酸，Ile(或I)-异亮氨酸，Fum-富马酰，Orn-鸟氨酸，Pro(或p)-脯氨酸，Phe(或F)-苯丙氨酸，Trp(或W)-色氨酸，Met(或M)-甲硫氨酸，Ser(或S)-丝氨酸，Thr(或T)-苏氨酸，Cys(或C)-半胱氨酸，Tyr(或y)-酪氨酸，Asn(或N)-天冬酰胺，Gln(或Q)-谷氨酰胺，Asp(或D)-天冬氨酸，Glu(或E)-谷氨酸，Lys(或K)-赖氨酸，Arg(或R)-精氨酸，His(或H)-组氨酸，Nle-正亮氨酸，Hyp-羟脯氨酸，Cha-环已丙氨酸，Glt-戊二酰基，Mal-马来酰基，β-Ala-β-丙氨酸，Npa-β-(2-萘)丙氨酸，3，4-dehydroPro-3，4-脱氢脯氨酸，Phg-苯基甘氨酸，NMePgl-N-甲基苯基甘氨酸，Sar-肌氨酸(N-甲基甘氨酸)，PSubPhe-对位取代的苯丙氨酸，SubPhe-邻、间、或对位-单一或二取代的苯丙氨酸，Ac-乙酰基，Suc-琥珀酰基，Phe(4′-Cl)-对-氯苯丙氨酸，Phe(4′-NO2)-对-硝基苯丙氨酸，NMeVal-N-甲基缬氨酸。
在各个事例中若氨基酸的三字母编码的第一个字母是大写的，则表示为L-构型的氨基酸；同样，若氨基酸的三字母编码的第一个字母是小写的，则表示为D-构型的氨基酸。
烷基和烷氧基中的烷基部分包括有直链、支链或环状烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、仲戊基、环戊基、己基、异己基、环己基和环戊基甲基。本发明中的苯基亚烷基的亚烷基部分可含有1到4个碳原子，可以是直链或支链，例如，亚甲基，1，2-亚乙基，1，2-亚丙基，亚丁基，异亚丙基和仲-亚丁基。本发明的苯基亚烷基中的苯基可未被取代或在邻位、间位、最好在对位被单取代。优选的是未被取代的或对羟基取代的苯基。酰基是含有2～10个碳原子的直链、支链、环状、饱和的和不饱和的每个基团有1或2个羰基部分的酰基，例如，乙酰基，苯甲酰基，琥珀酰基，马来酰基和戊二酰基。卤素是氟、氯、溴或碘。
本发明的化合物的B是
时，具有式1a的结构
本发明的化合物的B是-S-CH2-基时，具有式1b的结构。
本发明的化合物的B是-O-CH2-基时，具有式1c的结构。
本发明的化合物的B是-CH＝CH-基时，具有式1d的结构。
本发明的化合物的B是-CH2-C(O)-基时，具有式1e的结构。
本发明的化合物的B是-CH2CH(OH)-基时，具有式1f的结构。
本发明的化合物的B是-C(O)NH-基时，具有式1g的结构。
显然，本发明的环状肽衍生物是把天然存在的神经激肽A的两个C-端氨基酸的正常的肽酰胺键加以改造并经环化而连结到A1氨基酸残基上。应用肽化学家使用的常规命名法，可把式1中R1和R2各自为仲丁基、B是-NHCH2-基的化合物(即连结A4残基和A1残基的部分是由被还原了的酰氨链连结的两个亮氨酸残基构成的化合物)称作Leuψ〔CH2NH〕Leu。这种命名法指出了倒数第二个Leu的酰胺的羰基被还原成亚甲基。用来说明本发明的肽衍生物的其它命名有ψ〔CH2S〕，ψ〔CH2O〕，ψ〔CH＝CH〕，ψ〔C(O)CH2〕，ψ〔CH(OH)CH2〕，和ψ〔NHC(O)〕。
这里所用的“任何种氨基酸”一语，包括有天然存在的氨基酸以及在制备天然存在的肽的合成的类似物时在肽化学领域中常用的其它的“非蛋白质的”α-氨基酸。天然存在的氨基酸有甘氨酸，丙氨酸，β-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，甲硫氨酸，苏氨酸，苯丙氨酸，铬氨酸，色氨酸，半胱氨酸，脯氨酸，组氨酸，天冬氨酸，天冬酰胺，谷氨酸，谷氨酰胺，精氨酸，鸟氨酸和赖氨酸。“非蛋白质的”α-氨基酸的例子有正亮氨酸，正缬氨酸，别异亮氨酸，高精氨酸，硫脯氨酸，脱氢脯氨酸，羟脯氨酸(Hyp)，高丝氨酸，环已甘氨酸(Chg)，α-氨基丁酸(Aba)，环己丙氨酸(Cha)，氨苯丁氨酸(Pba)，苯丙氨酸的苯基的邻、间或对位被下面的一个或二个基团取代(C1～C4)-烷基，(C1～C4)-烷氧基，卤素或硝基，或被亚甲二氧基取代，β-2-和3-噻吩丙氨酸，β-2-和3-呋喃丙氨酸，β-2-，3-和4-吡啶丙氨酸，β-(2-和3-苯并噻吩)丙氨酸，β-(1-和2-萘)丙氨酸，丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的O-烷基化衍生物，S-烷基化的半胱氨酸，酪氨酸的O-硫酸酯，3，5-二碘酪氨酸和天然存在的氨基酸的D-异构体。
天然氨基酸除甘氨酸和β-丙氨酸外，都含有手性碳原子，除非特别指出，这里所提出的光活氨基酸都是L-构型。如同常规那样，这里书写的肽结构是氨基端在肽链的左侧，羧基端在肽链的右侧。
式I的多肽可与无毒的有机或无机酸形成药用盐。可生成适宜的盐的作为例证的无机酸有盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及酸式金属盐，如磷酸氢二钠和硫酸氢钾。可生成适宜的盐的作为例证的有机酸包括有一元、二元和三元羧酸。这些酸中例如有乙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、苯乙酸、肉桂酸、水杨酸、2-苯氧基苯甲酸和磺酸，如甲磺酸和2-羟基乙磺酸。
化合物的任何一般的基团中，某些基团是优选的。本申请者优选了式I的如下肽衍生物A1是Gln，gln，Asn或asn；A2和A3各自是Trp，trp，phe，phe，Tyr，tyr，Cha，cha，Phg或phg的那些肽衍生物；A4为Gly，Ala或ala的肽衍生物，更优选的肽衍生物是A1为Gln，A2和A3各自是Trp或Phe，A4为Gly。
本发明的肽可用对本技术熟悉的人所已知的各种方法来制备。这些方法中包括有固相顺序法，该法可用已建立好的自动化方法实施，例如用肽自动合成器。为了制备本发明的肽衍生物，连结在树脂上的氨基酸相当于A4，再顺序加上的氨基酸相当于A3，A2，A1，最后的氨基酸相当于NH2CHR1CO2H。然后形成修饰的“B”酰胺键，即加入的氨基酸相当于NH2CHR1CO2H，从树脂上脱下，环合。用于制备各个修饰的肽键的方法是本领域皆知的方法，熟练的肽化学家可容易地实施。制备式I中B为-NHCO-基的肽衍生物(即ψ〔NHCO〕化合物)的方法是Chorev和Goodman在Int.J.Pept.Protein Res，21(3)，258～68(1983)中所述的已知方法。制备式I中B为-COCH2-或-CH(OH)CH2-基的肽衍生物(即分别是ψ〔COCH2〕和ψ〔CH(OH)CH2〕化合物)的方法是Holladay和Rich在Tetrahedron Letters，24(4)，4401～04(1983)中所述的已知方法。制备式1中B为-CH2NH-基的肽衍生物(即ψ〔CH2NH〕化合物)的方法是Sa saki和Coy在Peptides，Vol.8，PP 11g-121，1987中所述的已知方法，並将在下面详细说明。制备式1中B为-CH2S-基的肽衍生物(即ψ〔CH2S〕化合物)的方法是Spatola和Darlak在Tetrahedron Letters，44(3)，821～33(1988)中所述的已知方法。制备式1中B为-CH2O-基的肽衍生物(即ψ〔CH2O〕化合物)的方法是TenBrink在J.OrgChem，1987，52，418～22中所述的已知方法。
然后从树脂上除掉线型肽，並按要求除掉所有保护基，该线型肽用常规方法进行环化，例如用三乙胺和二苯基磷酰叠氮化物在二甲基甲酰胺的混合液处理。环状肽的粗品在用常法如用层析法精制之前，将所有存在的保护基和功能基的前体除去或转变为所希望的基团。
特别要指出，本发明的B为-CH2N(R)-基的化合物的制备，是将式3的N-甲氧基-N-甲基酰胺还原成式4的醛。该还原作用可用各种皆知的方法实施，对本领域熟悉的人很容易实施，例如用氢化铝锂(LAH)还原。该还原作用可用常规法进行，即把大约1摩尔当量的LAH加到冷却的(有代表性的是大约0℃)式3的化合物在非反应活性的溶剂如醚类溶剂，像四氢呋喃(THF)或乙醚的溶液中。反应基本完全后，一般是大约30分钟后，反应混合物中加入10％的硫酸氢钾或钠，然后加入水以中止反应。然后产物用溶剂萃取水性混合物而分离出，溶剂例如用乙醚，醚相用冷的稀盐酸水溶液洗涤，干燥，蒸除乙醚。
式4的醛然后与同树脂相连的式6反应，
式中R和R2的含义如式1所定义，代表肽的树脂。起初生成的西佛碱加成物就地用例如氰基硼氰化钠还原，生成式7的树脂结合的修饰的二肽
式中R，R1和R2的含义与式1的相同，代表肽的树脂。
式3的N-甲氧基-N-甲基酰胺用常规方法由相应的N-Boc保护的酸制备。碳酰二咪唑加到N-Boc保护的氨基酸于醚类溶剂(如乙醚)的干燥溶液中。反应混合物搅拌10分钟到1小时，一般为大约15～20分钟。N，O-二甲基-羟胺盐酸盐的DMF溶液和有立体障碍的胺例如二异丙基乙胺加入到上面的混合物中，室温下搅拌大约6小时到24小时。蒸除溶剂后分出所要的化合物，粗品用例如硅胶快速层析，二氯甲烷洗脱进行纯化。
所用的树脂支持剂可以是固相制备多肽技术中常规用的各种适用的树脂，最好是用0.5～3％的二乙烯苯交联的聚苯乙烯，它或者被氯甲基化，或者羟甲基化，以便对起始引入的α-氨基被保护的氨基酸提供生成酯的位置。
羟甲基化树脂的一个实例是Bodanszky等在Chem Ind(London)38，1597～98(1966)中所叙述，氯甲基化树脂有加里福尼亚州Richmond的Bio Rad Laboratories产品市售，这一树脂的制备方法叙述于Stewart等，“固相肽合成”(Freeman & Co，旧金山1966)，第1章1～6页。被保护的氨基酸可用Gisin，Helv Chem Acta，56，1476(1973)的方法连接在树脂上。许多连接了被保护的氨基酸的树脂可买到。例如，为了制备本发明的羧基端为Thr残基的多肽，可用连接于苄基化的羟甲基化的苯乙酰胺甲基(PAM)树脂上的叔-丁氧羰基(Boc)保护的Thr，它可买到。
α-氨基被保护的氨基酸耦联到树脂支持剂上以后，用任一适宜的方法除掉保护基，例如用二氯甲烷中的三氟乙酸，单用三氟乙酸或二噁烷中的Hcl。脱保护基作用在温度为0℃到室温下进行。也可以用除掉特异的α-氨基保护基的其它的标准裂解试剂和条件，除掉α-氨基保护基后，其它的氨基保护的氨基酸以所要的次序分步耦联上。另外，在同树脂支持的氨基酸顺序耦联之前，可将多个氨基酸组成的片断先用溶液方法耦联起来。
引入到多肽序列中的每个氨基酸所用的α-氨基保护基可以是本技术领域中已知的任何一种保护基。α-氨基的保护基的分类有(1)酰基型保护基，例如甲酰基，三氟乙酰基，苯二甲酰基，甲苯磺酰基(tosyl)，苯磺酰基，硝基-苯亚磺酰基，三苯甲基亚磺酰基，邻-硝基苯氧乙酰基和α-氯丁酰基；(2)芳香氨基甲酸酯型保护基，例如苄氧羰基和取代的苄氧羰基，如对氯苄氧羰基，对硝基苄氧羰基，对溴苄氧羰基，对甲氧基苄氧羰基，1-(对-联苯基)-1-甲基乙氧羰基，α，α-二甲基-3，5-二甲氧基苄氧羰基和二苯甲氧羰基；(3)脂肪族氨基甲酸酯型保护基，例如叔-丁氧羰基(Boc)，二异丙基甲氧羰基，异丙氧羰基，乙氧羰基和烯丙氧羰基；(4)环烷基氨基甲酸酯型保护基，例如环戊氧羰基，金刚烷氧羰基和环己氧羰基；(5)硫代氨基甲酸酯型保护基，例如苯硫羰基；(6)烷基型保护基，例如三苯甲基(trityl)和苄基；(7)三烷基硅烷基，例如三甲基硅烷。α-氨基的优选的保护基是叔-丁氧羰基。
选择适宜的耦联剂是本技术领域的技巧。加入的氨基酸是Gln、Asn或Arg时，特别适用的耦联剂是N，N′-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑。这些试剂的使用可避免腈和内酰胺的生成。其它的耦联剂有(1)碳二亚胺类(例如，N，N′-二环己基碳二亚胺和N-乙基-N′-(r-二甲氨基丙基碳二亚胺)；(2)氨基氰类(如N，N-二苄基氨基氰)；(3)酮亚胺类；(4)异噁唑盐(如N-乙基-5-苯基-异噁唑-3′-磺酸鎓盐；(5)含有具有芳香性质的单环杂环酰胺，杂环酰胺的环上有1到4个氮，如咪唑、吡唑和1，2，4-三唑的酰胺。可用的特异的杂环酰胺包括有N，N′-碳酰二咪唑和N，N-碳酰-二-1，2，4-三唑；(6)烷氧基化的乙炔(如乙氧乙炔)；(7)能与要进行耦联的氨基酸的羧基生成混合酐的试剂(如氯甲酸乙酯和氯甲酸异丁酯)，或使要进行耦联的氨基酸生成对称酐的试剂(如Boc-Ala-O-Ala-Boc)；(8)含氮的杂环化合物，该化合物的环上氮连-羟基(例如，N-羟基苯二甲酰亚胺，N-羟基琥珀酰亚胺和1-羟基苯并三唑)。其它的活化试剂和它们在肽耦联作用中的应用在Kapoor，J.Pharm Sci，59，PP1～27(1970)中有记述。本申请者除Arg、Asn和Gln外的所有氨基酸都优选用对称酸酐作为耦联试剂。
加入到固相反应器中的各个保护氨基酸或氨基酸序列用大约4倍的过量，耦联反应在二甲基甲酰胺二氯甲烷(1∶1)或只在二甲基甲酰胺中、或最好只在二氯甲烷的介质中进行。若耦联反应进行得不完全，则在除去α-氨基保护基和在固相反应器中耦联下一个氨基酸之前，可重复进行耦联操作。每个阶段合成的耦联反应的成功程度用茚三酮反应监测，如E.Kaiser等在Analyt.Biochem34，595(1970)中所述。
得到了所需的氨基酸序列之后，将肽从树脂上除下。这可用水解法实现，例如用二甲硫醚、对-甲酚和硫代甲酚在无水氟氢酸的溶液处理连结多肽的树脂。
皆如，在固相肽合成的技术领域中，许多氨基酸具有功能基，在肽链制备过程中需要保护。使用和选择适宜的保护基是熟悉本领域的人的技巧，这取决于要保护的氨基酸和在肽链上的存在是否其它的被保护的氨基酸残基。选择这样的侧链保护基的关键是在裂解掉α-氨基的保护基时，它不会被除去。例如，对于赖氨酸的侧链适宜的保护基是苄氧羰基和取代的苄氧羰基该取代基选自卤素(如氯、溴和氟)和硝基，(例如2-氯苄氧羰基，对-硝基苄氧羰基，3，4-二氯苄氧羰基)，甲苯磺酰基，叔-戊氧羰基，叔丁氧羰基和二异丙基甲氧羰基。苏氨酸和丝氨酸的醇性羟基的保护，可用乙酰基，苯甲酰基，叔丁基，三苯甲基，苄基，2，6-二氯苄基或苄氧羰基。天冬氨酸和谷氨酸的羧基的羟基保护可用苄基或环己基。优选的保护基是苄基。
这些基团可用本技术领域熟知的方法除去。保护基的除去一般是在完成了肽链合成之后进行，但保护基也可以在其它任何时刻除去。
式1的肽衍生物作为神经激肽A的拮抗剂的能力，可用它们能够同化神经激肽A竞争哺乳类的神经激肽A(NK2)受体得到证明，所用的方法是BuCK等在Seience 226987-989、1984中所述的方法。也可用这些化合物能够刺激成抑制神经激肽A-诱导磷脂酰肌醇转换，所用的方法为Bristow等于Britishj.Phcrmacol90211-21、1987所述。
由于本发明的肽衍生物能够作为神经激肽A的拮抗剂起作用，这些化合物可用作免疫抑制剂和治疗关节炎，哮喘，疼痛，炎症，肿瘤生长，胃肠道运动过强，杭廷顿氏舞蹈病，精神病，神经炎，神经痛，头痛，包括有偏头痛，高血压，尿失禁，荨麻疹，类癌瘤综合症，流感和感冒。口服或非肠道用药的有效剂量很容易被熟悉本技术领域的人所确定，是引起神经激肽A(NK2)受体拮抗作用的剂量。例如，本发明的肽的有效剂量是按病人体重每天每公斤大约0.5μg到500mg。常规用的单位剂型中含活性化合物的剂量为大约1mg到大约500mg，每日用药量为1到4个或更多的单位剂型。这里所用的“病人”一语，是指哺乳类，例如包括人在内的灵长类，羊、马、牛、猪、狗、猫、大鼠和小鼠。
虽然某些肽类衍生物口服后经过肠道时可以存留，但本发明者推举非口服用药，例如皮下、静脉、肌肉、腹腔注射；贮库注射剂，植入制剂，或用于粘膜，例如鼻、喉和气管，例如本发明的肽衍生物可含在气雾剂中以喷雾或干粉的形式使用。
为了非胃肠道用药，以化合物的溶液或悬浮液的注射剂用药，将化合物与生理上可接受的稀释剂，及药用载体合用，该药用载体可以是灭菌液体，例如水和油剂，可加入或不加入表面活性剂和其它药用赋形剂。这些制剂中可用的有代表性的油剂有石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如有花生油，豆油和矿物油。水、生理盐水、葡萄糖水溶液和有关的糖溶液，乙醇和乙二醇类例如丙二醇或聚乙二醇通常被优选为液体载体，特别是用于注射液。
化合物可以贮库注射剂或植入制剂的形式用药，制成这样的制剂可使活性成分缓释。活性成分可压制成小丸或小柱状物，作为贮库注射剂或植入剂，植于皮下或肌肉内。植入剂可以使用惰性物质，例如可生物降解的聚合物或合成的硅酮，例如DOW-Corning公司制造的硅橡胶和硅酮橡胶。实施例如下的非限制性的实施例对本发明加以说明。实施例1环状GLN-TRP-PHE-GLY-LEUψ〔CH2NH〕LEU和环状GLN-TRP-PHE-GLY-LEUψ〔CH2NCH3〕LEU对神经激肽A受体的拮抗作用，是用与碘化神经激肽A对受体的竞争作用所证明将数个仓鼠的泌尿膀胱汇集切碎后，于4℃下同含有120mMNacl和5mM Kcl的50mM TRIS-Hcl(PH 7.4)匀浆后，于48000×g离心15分钟。将块状物于4℃下再悬浮到含有10mM EDTA和300mM Kcl的50mM TRIS-Hcl(PH7.4)30分钟。悬浮液同上法离心，块状物用单一的50mMTRIS-HCl(PH 7.4)洗涤两次並离心。然后把膀胱组织再悬浮到培养缓衡液中。每个试管中加入一个等分试样(约3～5mg组织)，並开始试验。试管中含有的培养缓衡液是由50mM TRIS-Hcl(PH7.4)，0.02％BSA，40μg/ml杆菌肽，4μg/ml抑凝乳蛋白酶素，4μg/ml leupeptin(乙酰-亮-亮-精氨醛)，2mM MnCl2，0.1nM125碘代组氨酰1-神经激肽A(Amersham公司)组成的，标题化合物或标准品的浓度为0.03nM到100μM。试验的进行是在室温下平衡120分钟。然后将每个试管中的内容物迅速在Whatman GF/B滤器上过滤，该滤器预先在0.5％BSA中浸泡，並迅速用冰冷却的单一的50mMTRIS-HCl(PH 7.4)洗涤二次。滤器结合的放射活性用咖玛计数器定量测定。比结合性(最大值)定义为1μM未标记的神经激肽A(NKA)存在和不存在时结合性的差异。受试化合物或标准品对碘代NKA结合的竞争作用用该最大竟争作用的百分率表示。本标题化合物的IC50值(使50％受体受到抑制时所需的浓度)证明为0.01～0.5nM(
图1)。实施例2环状GLN-TRP-PHE-GLY-LEUψ〔CH2NH〕LEU和环状GLN-TRP-PHE-GLY-LEUψ〔CH2NHCH3〕LEU对神经激肽A受体的拮抗作用，是用对磷脂酰肌醇转换的影响所证明数个仓鼠的膀胱汇集后用组织切碎机切成350μm碎块。切碎的组织在37℃与Krebs-Hepes缓衡液保温30分钟，每15分钟换成新鲜缓衡液。组织然后在含100～200μci的3H-肌醇的缓衡液中在37℃保温，洗涤，然后在Krebs-Hepes(含10mM Li+)缓衡液中37℃再保温30分钟。每15分钟换一次新鲜缓衡液。组织块分份后(每个试管大约放10～20mg)置于Li+缓衡液中，每个试管加受试化合物25μl，然后加入各种浓度的NKA 25μl，最终的体积为250μl。要评价的受试化合物的浓度范围为1nM到100μM，NKA的浓度范围是1nM到10μM。受试化合物也用上述的浓度单独作评价，以测定其激动剂的活性。室温下30分钟后，加入940μl的氯仿-甲醇(1∶2)，以中止磷脂酰肌醇的转换，然后加入310μl氯仿，再加310μl水。每个试管然后振荡15秒钟，于3000rpm离心10分钟以分开各相。上层(水相)900μl加截到0.5mlBiorad AG-1×8(甲酸酯)的离子交换柱上。从每支试管的下层(氯仿)抽出50μl放入计数管内，干燥后在闪烁液中计数。柱上的物质依次用如下洗脱1)10ml水2)5ml的5mM四硼酸二钠/60mM甲酸钠3)10ml的1M甲酸铵于0.1M的甲酸溶液中。最后的(第三个)洗脱液合并后，取1ml与6ml ACS闪烁体混合后计数。然后，每个样品的这些计数(磷酸肌醇总量)与相应的有机相中计数的比值加以计算。在有受试化合物和/或标准品存在的这种比值与对照管(即没有刺激的激动剂)的比值加以比较。绘制剂量-效应曲线。用图解分析法或用计算机程序来确定受试化合物刺激或抑制神经激肽A诱导磷脂酰肌醇的转换作用，于图2到图5说明了。实施例3环状GLN-TRP-PHE-GLY-LEUψ〔CH2NCH3〕LEU对在大鼠泌尿膀胱就地制备的神经激肽A的拮抗作用雌性Sprague-Dawley种150～200g大鼠用氯胺酮盐酸盐(腹腔注射100mg/kg)附以乌拉坦(腹腔注射1.2g/kg)使麻醉。暴露膀胱，按Dray的方法(J.pharmacolMethods 13157～165(1985))使膀胱排空。将针头插进膀胱圆弧面的顶端，将生理盐水灌入膀胱中，速度为每分钟100μl。膀胱的流出液是通过插进尿道的聚乙烯插管收集的。膀胱收缩的监测通过与灌流系统相连接的液流压力传感器。受试化合物于40～100μl生理盐水或含有最低量的DMSO的生理盐水中，放于膀胱圆弧部。用的赋形剂含DMSO高达75％时既没有直接的作用，也不会对由于后来的NKA所引起的收缩有影响。NKA引起收缩的阈浓度约为10μg，此用量作常规应用。拮抗剂同法用到膀胱上5分钟后重复使用NKA。重复使用10μg NKA不会导致使任何快速减敏。连续记录每个动物每一分钟间隔的收缩幅度(收缩力)。实例的显示于图6。实施例4I.Boc-Leu-醛的合成(Fehrentz.J.-A.和CastroB.Synthesis，1983，676～678)A.N-叔丁氧羰-亮氨酸N-甲氧基-N-甲基酰胺15.0mmole的叔丁氧羰-亮氨酸水合物溶解于30ml无水乙醚中。溶液用无水硫酸镁干燥，过滤除去固体。将16.5mmol碳酰二咪唑加到此滤液中，反应液室温下搅拌20分钟。向生成的溶液中加入22.5mmol O，N-二甲基羟胺盐酸盐于15ml二甲基甲酰胺和3.9ml二异丙基乙胺的混悬液。室温下反应混合液搅拌过夜。反应物用75ml乙酸乙酯稀释，用1N的冷Hcl溶液洗涤(3×40ml)，再用饱和NaHco3(3×40ml)和饱和NaCl(1×40ml)洗涤。有机相用MgSo4干燥，过滤后真空蒸除乙酸乙酯。分析数据Rf(硅胶F254)0.51(乙酸乙酯/己烷3/2)；′H-NMR(CDCl3)(TMS内标)δ＝0.95ppm(二重峰，6H，J＝6.6Hz)；1.42(单峰11H)；1.64～1.80(多重峰，1H)；3.20(单峰，3H)；3.80(单峰，3H)；4.72(多重峰，1H)；5.10(双重峰，1H，J＝7.5Hz)。质谱M+H+理论值275，实测值275。B.丁氧羰-亮氨酸醛将2.5mmole的丁氧羰-亮氨酸的N-甲氧基N-甲基酰胺溶解在30ml无水乙醚中。该溶液中加入3.2mmole氢化锂铝(1M的四氢呋喃溶液)。反应液室温下搅拌20分钟，然后小心加入0.6g NaHSO4于10ml水的溶液以中止反应。反应混合物加入75ml乙醚中，用冷的1N HCl(3×30ml)、饱和NaHCO3(3×30ml)和饱和NaCl(1×30ml)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤后真空蒸除溶剂。分析数据Rf(硅胶60 F254)0.68(乙酸乙酯/己烷3/2)。质谱M+H+理论值216，实测值216。II.Leu-Gln-Trp(CHO)-Phe-Gly-PAM-树脂的合成以Boc-Gly-PAM树脂(0.5mmol)开始在肽自动合成器中用标准的固相肽合成方法合成。其余的氨基酸依次加入(Phe，Trp(CHO)，Gln，Leu)。然后用三氟乙酸除掉Boc保护基，树脂用二异丙基乙胺中和，然后用二甲基甲酰胺、二氯甲烷洗涤，干燥之。III.还原的酰胺链(Leuψ〔CH2NH〕Leu)的生成将2mmole Boc-Leu醛溶解于10ml 1％的乙酸于二甲基甲酰胺的溶液中。将此溶液加到含有肽树脂(0.5mmole，见上II)的反应器中。向此混合物中加入150mg NaCNBH3于2ml二甲基甲酰胺的溶液。混合物振摇4小时。将反应器内液体排出，树脂先后用二甲基甲酰胺和二氯甲烷洗涤。IV.环状〔Leuψ〔CH2NH〕Leu-Gln-Trp-Phe-Gly〕的合成肽自树脂上切割下后，用无水HF/苯甲醚(10∶1)完全脱保护基。部分肽粗品(77mg)溶解到15ml二甲基甲酰胺中，然后加入0.2ml三乙胺和0.08ml二苯基磷酰叠氮化物，使其环化。室温搅拌12小时后，真空蒸除溶剂。将环状肽粗品溶解在1∶1乙腈∶水(V/V)(60ml)，並加入2.0ml三乙胺，使Trp(CHO)残基脱甲酰化。脱甲酰化反应是在室温下搅拌12小时后，真空蒸除溶剂。环状多肽的粗品用反相高效液相层析技术精制，得纯净化合物27.9mg，38.2μmole。分析数据氨基酸分析(Hcl水解)Glx(0.837)，Phe(0.97)，Gly(1.03)；质谱(FAB)(M+H)+理论值731；实测值731；肽含量50.7％。V.环状〔Leuψ〔CH2NCH3〕Leu-Gln-Trp-Phe-Gly〕的合成根据上面的II用Boc-N-甲基亮氨酸制备的N-甲基-Leu-Gln-Trp(CHO)-Phe-Gly-PAM树脂与2.0mmole Boc-Leu醛反应，方法如上面III中所述。然后如上面IV中所述完成该肽的合成。分析数据氨基酸分析(Hcl水解)Glx(0.72)；Gly(1.04)；Phe(0.96)。肽含量63.7％。质谱(FAB)M+H+，理论值745，实测值745。VI.环状〔Leuψ〔CH2NP〕Leu-Gln-Trp-Phe-Gly〕的合成按照上述的II和III方法制备Boc-Leu〔ψ(CH2NH)〕-Leu-Gln-Trp(CHO)-Phe-Gly-PAM-树脂。然后如上III法所述，将此树脂在NaCNBH3的存在下与2.5mmoleR-CHO于10ml的1％HOAC于二甲基甲酰胺反应。然后如上面IV中所述完成该肽的合成。图的解释图1说明了环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)和环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)对激动剂结合NKA受体的拮抗能力，如同受试化合物对仓鼠泌尿膀胱的I125-标记的NKA结合作用的竞争能力所证明的那样(实施例1)。横轴(X-轴)指出的是神经激肽A(NKA)的激动剂或拮抗剂的浓度的对数。纵轴(Y-轴)为每个受试的激动剂或拮抗剂观测的比结合性，是以最大比结合度的百分率量度的。数值是6～12次实验的均值±标准误差。IC50值是由50％抑制点从绘图上估计出的，列于图上。环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)是比环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)更强的竞争剂，並比激动剂NKA本身的作用更强。
NKA
Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)图2和图3分别说明了环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)和环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)对仓鼠泌尿膀胱的受体调节的、NKA-诱导的PI转换的剂量相关的拮抗作用的能力(实施例2)。横轴(X-轴)是NKA受体的激动剂或拮抗剂浓度的对数。纵轴(Y-轴)是观测到的PI转换百分率(与对照相比)。数值是一个实验重复三次的均值±标准误差。图中列出了每个肽的剂量-效应曲线。环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)(图2)浓度为10nM和100nM、环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)(图3)浓度为100nM、1μM和10μM时，使NKA剂量-效应曲线右移。这两个化合物于浓度到10μM单独用时，都不能对PI的转换产生任何诱导作用。图2
NKA
Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
NKA+100nM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
NKA+1μM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
NKA+10μM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
图3
NKA
Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)
NKA+100nM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)
NKA+1μM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)
NKA+10μM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)图4和图5比较了环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)和环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)对仓鼠泌尿膀胱的受体调节的、NKA-诱导的PI转换的拮抗能力(实施例2).横轴(X-轴)是NKA浓度的对数。纵轴(Y轴)是观测到的PI转换百分率(与对照相比)。数值是一个实验重复三次的均值±标准误差。图中列出了每个肽的剂量-效应曲线。这两个化合物在100nM(图4)和1μM(图5)时都能使NKA剂量-效应曲线平行右移。在每个拮抗浓度时，这两个肽相互之间都是等效价的。图4
NKA
NKA+100nM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NH-Leu)
NKA+100nM Cyclo(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)
图5
图6.当10μg NKA直接用到暴露出的麻醉大鼠的膀胱的圆弧部时，会产生持续的强力收缩，收缩频率也增加。应用25μg环状(Gln-Trp-Phe-Gly-Leu-CH2NCH3-Leu)5分钟后第二次同样给NKA时，两个不同的大鼠的NKA的作用显著地变弱或完全被阻断。每只动物表示了连续的显示。方法学如实施例3所述。
权利要求
1.一种制备下式的肽衍生物或其药用盐的方法
式中A1是Gln，gln，His，his，Asn，asn或一个下式所示的基团
式中R″是被一个氨基取代的C1～C5烷基；A2是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)或phe(4′-NO2)；A3是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)，phe(4′-NO2)，Val或val；A4是Gly，Ala，ala或β-Ala；B是下式中的一个基团
-S-CH2-，-O-CH2-，-CH＝CH-，
-CH2-CH(OH)-，和
式中R是氢原子或是C1～C4的烷基，或是一个苯基亚烷基，该亚烷基部分为直链或支链，含1～6个碳原子，苯基部分未被取代或被C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、羟基或卤素单取代；R1和R2各自独立地选自如下的基团异丙基，异丁基，仲丁基，正丁基和2-(甲硫)乙基，该制备方法的特征是，将Boc-A4，Boc-A3，Boc-A2和Boc-A1依次连接到树脂连接的，下式所示的修饰键二肽衍生物上，Boc是氨基丁氧羰保护基
式中R1，R2和B的含义如上所述，是树脂。此种连接是在增长肽链的末端氨基上，该氨基是当除去氨基保护基团的同时，暴露出来的。然后将产物自树脂上切割掉，用三乙胺和二苯基磷酰叠氮化物将线性衍生物环合。
2.一种制备下式的肽衍生物或其药用盐的方法，
式中A1为Gln，gln，His，his，Asn，asn或下式的一个基团
式中R″是被一个氨基取代的C1～C5烷基；A2是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)或phe(4′-NO2)；A3是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)，phe(4′-NO2)，Val或val；A4是Gly，Ala，ala或β-Ala；B是下式的一个基团
式中R是氢原子或C1～C4烷基，或是苯基亚烷基，该亚烷基部分为直链或支链，含1～6个碳原子，苯基部分是未被取代的或被C1～C4烷基，C1～C4烷氧基，羟基或卤素单取代；R1和R2各自独立地是选自如下基团异丙基，异丁基，仲丁基，正丁基和2-(甲硫)乙基，该制备方法的特征是a)将Boc-A3，Boc-A2，Boc-A1和下式所示的一个氨基酸依次连接到与树脂相连的，通式为A4-的氨基衍生物上，
式中Boc是氨基丁氧羰保护基，A3、A2、A1和R2的含义如前所述，是树脂，A4的含义如前所述，这种连接是在增长肽链的末端氨基上，该氨基是当除掉氨基保护基的同时被暴露出来，b)将下式的氨基醛(式中R1的含义如前所述)缩合到树脂连接的中间产
物上，是通过混合该氨基醛在乙酸和二甲基甲酰胺的溶液而进行的；c)自树脂上切割肽，并通过与三乙胺和二苯基磷酰叠氮化物反应，将线型的肽衍生物环合。
3.一种式1的肽衍生物或其药用盐作为药用活性物质，
式中A1是Gln，gln，His，his，Asn，asn或下式的一个基团
式中R″是一个氨基取代的C1～C5烷基；A2是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)或phe(4′-NO2)；A3是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)，phe(4′-NO2)，Val或val；A4是Gly，Ala，ala或β-Ala；B是如下基团之一
-S-CH2-，-O-CH2-，-CH＝CH-，
-CH2-CH(OH)-，和
式中R是氢原子或C1～C4烷基，或是苯基亚烷基，该亚烷基部分是直链或支链，含1～6个碳原子，苯基部分是未被取代或被C1～C4烷基，C1～C4烷氧基，羟基或卤素单取代；R1和R2各自独立地是选自如下基团异丙基，异丁基，仲丁基，正丁基和2-(甲硫)乙基。
4.式1的一种肽衍生物或其药用盐作为神经激肽A的拮抗剂的用途
式中A1是Gln，gln，His，his，Asn，asn或下式的一个基团
式中R″是一个氨基取代的C1～C5烷基；A2是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)或phe(4′-NO2)；A3是Trp，trp，Phe，phe，Tyr，tyr，Phg，phg，Cha，cha，Phe(4′-Cl)，phe(4′-Cl)，Npa，npa，Phe(4′-NO2)，phe(4′-NO2)，Val或val；A4是Gly，Ala，ala或β-Ala；B是下式中的一个基团
-S-CH2-，-O-CH2-，-CH＝CH-，
-CH2-CH(OH)-，和
式中R是氢原子或C1～C4烷基，或是苯基亚烷基，该亚烷部分是直链或支链，含1～6个碳原子，苯基部分是未被取代的或被C1～C4烷基、C1～C4烷氧基、羟基或卤素单取代；R1和R2各自独立地选自如下的基团异丙基，异丁基，仲丁基，正丁基和2-(甲硫)乙基。
全文摘要
本说明书叙述了神经激肽A的拮抗剂，为天然存在的神经激肽A的衍生物，该神经激肽A的羧基端上连结两个氨基酸的酰胺链被修饰了。用常规的竞争结合作用和生化测定以及常规的生理试验证明了该拮抗作用，并叙述了这些衍生物在各种与神经激肽A有关的状态下的用途。
文档编号A61P15/00GK1049353SQ9010697
公开日1991年2月20日 申请日期1990年8月9日 优先权日1989年8月10日
发明者斯考特·L·哈伯森, 史帝芬·H·布克 申请人:默里尔多药物公司