专利名称：：脱乙酰基秋水仙素衍生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及新的脱乙酰基秋水仙素衍生物。更准确地说，本发明涉及由下式所表示的脱乙酰基秋水仙素衍生物其中R为从C3-C7糖羧酸中除去COOH所得到的残基，在该残基中的羟基可用羟基的保护基团适当地保护。已知由下式所表示的秋水仙素对肿瘤细胞、痛风等有药物活性。〔参见《在农业、医药、生物学和化学中的秋水仙素》(JowaStageCollegePressAmis，Jowa，1955)〕然而，秋水仙素具有相当高的毒性，随着后来发现的脱甲秋水仙素(脱乙酰基-N-甲基秋水仙素)的出现〔(Chem.Engng.News，37，NO.41，67(1959)〕，秋水仙素被完全忽视了。本发明人为此做了不懈地研究以寻找具有低毒性和较好的抗肿瘤活性的秋水仙素衍生物。因此，发现了由式(Ⅰ)所表示的脱乙酰基秋水仙素衍生物对抑制肿瘤细胞增生显示出高活性，并且预计将作为抗肿瘤剂使用。这一发现使本发明得以完成。由R所代表的“从C3-C7糖羧酸中除去COOH所得的残基”，包括从C3-C7单糖羧酸如甘油酸、核糖羧酸、葡糖醛酸、葡糖酸或葡庚糖酸中除去COOH所得到的单价残基(下文称为糖残基)。这些残基的例子如下所示存在于糖残基的多个羟基中的至少一部分可以用羟基的保护基团适当地保护。这些保护基团的例子为酰基，如乙酰基、丙酰基、丁酰基、新戊酰基和苯甲酰基;和用下式表示的乙缩醛和酮缩醇基本发明的化合物可以通过，例如，用下式表示的糖羧酸其中R的定义如上或它们的反应的衍生物使下式表示的脱乙酰基秋水仙素酰胺化来制备。采用肽化学领域中已知的酰胺化反应，使式(Ⅲ)表示的糖羧酸或它的反应的衍生物(如卤化物和活性酯)和脱乙酰基秋水仙素进行酰胺化反应。例如，在碱存在下，脱乙酰基秋水仙素与式(Ⅲ)的糖羧酸卤化物反应制备本发明的化合物。上述反应通常可在约0℃-30℃温度下进行，优选约0℃至室温。卤化物的量无严格限制，通常对每摩尔脱乙酰基秋水仙素为1-1.5摩尔，优选1-1.2摩尔。碱的例子为叔胺，如三乙基胺和吡啶;和碱金属(氢)碳酸盐，如碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾和碳酸氢钾。碱的量通常为，对摩尔脱乙酰基秋水仙素1-1.5摩尔，优选1-1.2摩尔。上述反应通常在惰性溶剂中进行，溶剂的例子为卤化烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烯和三氯乙烯;脂肪醚，如乙醚、甲氧基乙醇;和芳香烃，如苯和甲苯。在缩合剂如二环己基碳化二亚胺(DDC)存在下，脱乙酰基秋水仙素与糖羧酸直接反应或脱乙酰基秋水仙素与式(Ⅲ)的糖羧酸的酯(如甲酯、乙酯或丁酯)反应制备本发明的化合物。本发明所得到的化合物可用已知方法分离和纯化，如萃取、色谱、结晶或其组合。本发明的化合物，其羟基保护基团存在于由R代表的糖残基中的情况下，可通过脱保护基反应(如所需要的水解反应)把保护基脱去。在前述的反应中，作为起始物的脱乙酰基秋水仙素本身是已知化合物〔参见J.Am.Chem.Soc.，75，5292(1953)〕，可用已知方法制备，或者可由下式表示的秋水仙素与三烷基氧鎓氟硼酸盐反应，然后按本发明人另外开发的方法用水处理反应混合物而制备。秋水仙素与三烷基氧鎓氟硼酸盐的反应可在惰性有机溶剂中，在约0℃至30℃温度，优选约0℃至室温下进行。惰性有机溶剂的例子为卤化烃如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烯和三氯乙烯;脂肪醚，如乙醚和甲氧基乙醇;芳香烃，如苯和甲苯。与秋水仙素反应的三烷基氧鎓氟硼酸盐是由下式表示的化合物(R′)3O+.BF-4(Ⅴ)其中R′为烷基。实际上三乙基氧鎓氟硼酸盐作为米尔文剂是较好的。对每摩尔秋水仙素，三烷基氧鎓氟硼酸盐的量通常为1-2摩尔，优选1-1.5摩尔。推测秋水仙素与三烷基氧鎓氟硼酸盐反应生成下式表示的化合物其中R′的定义如上。如用水处理式(Ⅵ)的化合物可以形成式(Ⅱ)的脱乙酰基秋水仙素。用水处理通常在约0℃-30℃温度下，特别是在室温下，通过搅拌30分钟至3小时来完成，对每摩尔起始物秋水仙素，水的量至少1摩尔，通常为过量。因此，脱乙酰基秋水仙素是以溶于水相的状态形成的，可以从水相中分离出来并用已知方法精制。例如，用加入碱而形成的pH范围9-10的碱性水层来分离脱乙酰基秋水仙素。这些碱包括如氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠或碳酸氢钠。然后，用有机溶剂萃取，有机溶剂包括例如卤化烃，如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烯或三氯乙烯;脂肪醚，如乙醚或甲氧基乙醇;或芳烃，如苯或甲苯。这样分离出的脱乙酰基秋水仙素可被精制，例如，把它转化成酒石酸盐或苹果酸盐。本发明式(Ⅰ)的脱乙酰基秋水仙素衍生物具有极好的抗肿瘤活性。这一点在以下所描述的对肿瘤细胞的体外或体内实验结果中很明显的看出。实验例1体外抑制肿瘤细胞增生实验抗鼠白血病细胞P388/ADR的2×105亚德里亚霉素被悬浮在含有10%的牛胎儿血清的RPMI1640培养介质中，在实验化合物(该实验化合物被溶解在二甲基亚砜中，其浓度为1mg/ml，这是用磷酸盐缓冲溶液稀释的)存在下培养2天。测试对细胞增生的影响，抑制50%增生的浓度测定IC50(μg/ml)。结果列于表1中。表1试验化合物IC50化合物1a0.036化合物1b0.066化合物40.034化合物50.037＊在以下实施例中说明化合物编号的意义实验例2内肉瘤180腹水肿瘤移植至鼠体的体内实验。1×106肉瘤180细胞移植入六周大的ddy雄性鼠的腹部空腔中。每组由6只鼠组成。在植入肿瘤细胞第1天后的7天内，实验化合物(溶于丙二醇，并用磷酸盐缓冲液稀释，最后丙二醇的浓度为20%或更低)给药于鼠的腹部空腔中，每日一次。计算存活日的平均数和延长的百分数＊。结果列表2中。＊延长百分数＝((在给药组中存活日的平均数)-(在对照组中存活日的平均数))/((在对照组中存活日的平均数))×100表2</tables>实验例3移植体内的肉瘤180固体肿瘤鼠的体内实验2×106肉瘤180细胞被移植于六周大的ddy雌性鼠的背皮下，每组由6只鼠组成。在肿瘤植入后从第6天起的10天之内，每天一次，连续把实验化合物(溶于丙二醇，用磷酸盐缓冲溶液稀释，最后丙二醇的浓度为20%或更低)给药于腹空腔中。在肿瘤植入30天后，取出肿瘤，测定其重量，计算平均肿瘤重和抑制百分率，结果列表3中。＊抑制百分率＝((在对照组中的平均肿瘤重)-(在给药组中平均肿瘤重))/((在对照组中平均肿瘤重))×100表3实验化合物剂量(μg/kgi.p)平均肿瘤重抑制百分率(平均值±SD，g)(%)化合物1a5.00.60±0.5257.42.50.63±0.5155.31.250.88±0.7847.60.6250.71±0.3849.6对照(20%丙二醇)1.41±0.58-实验例4急性毒性实验实验化合物给药于每只5周大的ddy雄性鼠体内，观察一周的死亡率。根据每组中鼠的死亡数目，采用Litchfield-wilcoxon方法来计算50%的致死量(LD50)。实验化合物(化合物(a))溶在10%的丙二醇中。从最大浓度80mg/kg，比率为1.2来制备十份稀释梯度溶液。然后进行实验。表4给药方法LD50(mg/kg)腹膜内的42(可信范围37.0-47.7)静脉注射38(可信范围34.3-42.2)从以上实验结果，可知本发明的化合物对肿瘤细胞具有很高的抑制活性，并预计作为抗肿瘤剂使用。本发明的化合物作为抗肿瘤剂处理和治疗肿瘤时，该化合物可通过口服或非肠道(例如静脉、肌肉、皮下或直肠内的)给药。依据病情、性别、病人体重，给药途径、医生诊断等情况，化合物剂量可在较宽范围内变化，通常为1-20mg/kg。在口服情况下。适合的剂量为5-10mg/kg;在静脉注射的情况下，其量为2-4mg/kg。本发明化合物可制成片剂、颗粒、粉剂、胶囊、糖浆、注射剂、滴剂或栓剂。根据已知方法，把本发明的化合物与药物可接受的载体或稀释剂混合来进行配制。载体或稀释剂的例子为水、乙醇、淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇、硅石、羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、琼脂、碳酸钙、石蜡、高岭土、滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁和聚乙二醇。通过以下实施例更具体说明本发明。实施例1脱乙酰基秋水仙素的制备4g(10mmol)秋水仙素溶解在无水的二氯甲烷中并冷却至0℃，逐滴加入15mmol的三乙基氧鎓氟硼酸盐Meerwein试剂)的二氯甲烷溶液。溶液在0℃搅拌1小时，进一步在室温下搅拌5小时。往反应混合物中加入30ml水，得到的溶液搅拌1小时。搅拌后，水层用漏斗分离，用50ml的水进一步萃取二氯甲烷层五次。二氯甲烷层用硫酸镁干燥并用来回收未反应的秋水仙素。用1N的氢氧化钠来调节水层的pH至10，并用氯仿萃取。氯仿层用硫酸镁干燥，然后用蒸发器浓缩。剩余物溶解在30ml乙醇中，加入1gD-酒石酸，然后加热混合物1小时。混合物冷却到室温后，过滤沉淀。所得的酒石酸盐用干燥器干燥。(在熔点219-220℃分解)。酒石酸盐溶解在50ml水中，用1N的氢氧化钠重新调节pH至10，并用氯仿萃取。萃取物用硫酸镁干燥，在减压下用蒸发器浓缩，获得1.38g油状的脱乙酰基秋水仙素。产率为39%。未反应的秋水仙素通过原来的二氯甲烷层(1.71g)的硅胶色谱柱，从被苯-丙酮洗脱的部分中回收。去掉这部分所得脱乙酰基秋水仙素产率为61%。实施例2脱乙酰基秋水仙素-甘油酸丙酮化物酰胺(化合物1)把甘油酸钾丙酮化物(3.60g，20mmol)悬浮在30ml无水乙醚中，往悬浮液中逐滴加入2.4g(20mmol)亚硫酰氯乙醚(5ml)溶液。加完之后，混合物回流3小时。混合物被冷却到室温后，用抽吸法过滤沉淀物，在减压下浓缩滤液。往剩余物中加入无水二氯甲烷并使其溶解。其间，把2.96g(8.3mmol)脱乙酰基秋水仙素和2.02g(20mmol)三乙基胺溶解在30ml二氯甲烷中混合物冷却到0℃，逐滴加入上述的甘油酰氯的二氯甲烷溶液。在0℃搅拌3小时后，用碳酸氢钠水溶液洗涤二氯甲烷溶液。二氯甲烷层用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩，剩余物通过硅胶柱色谱分离，从苯-丙酮(5∶1)冲洗的部分中得到1.11g产物(化合物1aL-异构体)。产率为28%，m.p.251-253℃(分解)。另外，从苯-丙酮(5∶2)冲洗的部分中得到第二种产物(化合物1bD-异构体)0.58g，产率为14%。化合物1aIR(KBr)3250cm-1(NH)，1670cm-1(C＝O)，1250cm-1(-O-);NMR(DCDl3)＝1.40(3H，s)，1.60(3H，s)，1.69-2.67(4H，m)，3.62(3H，s)，3.87(3H，s)，3.91(3H，s)，3.93(3H，s)，4.00-4.50(4H，s)，6.49-7.29(4H，m).化合物1bIR(KBr)3250cm-1(NH)，1670cm-1(C＝O)，1250cm-1(-O-);NMR(DCDl3)＝1.37(3H，s)，1.46(3H，s)，1.69-2.67(4H，m)，3.62(3H，s)，3.86(3H，s)，3.91(3H，s)，3.97(3H，s)，4.00-4.50(4H，s)，6.49-7.29(4H，m).实施例3脱乙酰基秋水仙素-甘油酸酰胺〔N-(5，6，7，9-四氢-1，2，3，10-四甲氧基-4-氧代苯并〔a〕庚间三烯并庚间三烯-7-基)甘油酰胺〕(化合物2)10ml5%的盐酸加入0.94g(2mmol)实施例2中得到的脱乙酰基秋水仙素甘油酸丙酮酰胺(化合物1)的30ml甲醇溶液中，在室温下搅拌5小时。搅拌后，加入200ml氯仿，混合物用碳酸氢钠水溶液和饱和Nacl水溶液洗涤。氯仿层用硫酸镁干燥，然后在减压下浓缩。剩余物用硅胶柱色谱分离，用苯-丙酮(1∶2)溶剂洗脱，得到0.45g上述标题化合物(化合物2;D，L-混合物)。产率为52%，m.p.48-50℃。IR(KBr)3350cm-1(OH)，1660cm-1(C＝O)，1280cm-1(-O-);NMR(DCDl3)＝1.87-2.64(4H，m)，3.62(3H，s)，3.87(3H，s)，3.91(3H，s)，3.96(3H，s)，3.56-4.84(6H，m)，6.51-7.58(4H，m)，7.9(1H，brs).实施例4脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸四-乙酰基酰胺(化合物3)把亚硫酰氯(1.19g，10mmol)加入1.81g(5mmol)的葡糖醛酸四乙酸酯的30ml氯仿溶液中，混合物回流3小时。待混合物冷却到室温后，在减压下除去溶剂和过量的亚硫酰氯。剩余的酰基氯溶解在10ml二氯甲烷中。其间，1.78g(5mmol)的脱乙酰基秋水仙素和0.60g(6mmol)的三乙胺溶解在30ml的二氯甲烷中并冷却到0℃。上述酰基氯加入混合物中，在0℃搅拌1.5小时，并在室温下搅拌1.5小时。反应混合物用碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。溶剂浓缩后，剩余物用硅胶柱色谱分离。用苯-丙酮(11∶3)溶剂洗脱，得到1.30g上述标题化合物(化合物3)，产率为37%，m.p.145-147℃(分解)IR(KBr)1750cm-1(OH)，1680cm-1(C＝O);NMR(DCDl3)＝1.91(3H，s)，1.96(3H，s)，2.00(2H，s)，2.09(3H，s)，2.10-2.64(4H，m)，3.58(3H，s)，3.87(3H，s)，3.89(6H，s)，4.00-4.22(1H，m)，5.00-5.38(4H，m)，5.80-5.89(1H，m)，6.47-7.53(4H，m).实施例5脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸二乙酰基酰胺(化合物4)(可能的结构式)上述标题化合物按实施例4方法制备，只是使用3.62g(13mmol)的葡糖醛酸二乙酸酯，1.71g(15mmol)亚硫酰氯，2.89(8mmol)脱乙酰基秋水仙素，和1.52g(15mmol)三乙胺。产量为1.67g，产率为35%。NMR(DCDl3)＝2.15(6H，s)，2.26-2.71(4H，m)，3.64(3H，s)，3.89(6H，s)，3.98(3H，s)，3.37-4.48(8H，m)，6.53-7.81(4H，m).实施例6脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸酰胺〔N-(5，6，7，9-四氢-1，2，3，10-四甲氧基-9-氧代苯并〔a〕庚间三烯并庚间三烯-7-基)葡糖醛酸酰胺〕(化合物5)在实施例5中得到的脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸二乙酰基酰胺(化合物4)(1.52g，2.5mmol)溶解在30mmol甲醇中并冷却到0℃。逐滴加入5ml1N氢氧化钠，混合物在0℃搅拌1小时。用稀盐酸调节混合物pH为至7，并在减压下浓缩。往剩余物中加入氯仿，过滤沉淀，然后，用硅胶柱色谱分离滤液。结果从被苯-甲醇(5∶1)洗脱的部分中得到0.93克上述标题化合物(化合物5)。产率为73%，m.p.53-57℃。NMR(DCDl3)＝2.22-2.67(4H，m)，2.96-3.27(4H，m)，3.62(3H，s)，3.87(6H，s)，3.93(3H，s)，3.50-4.22(6H，m)，6.48-7.78(4H，m).实施例7脱乙酰基秋水仙素-葡糖酸五乙酰基酰胺(化合物6)把亚硫酰氯(1.50g，13mmol)加入含有2.57g(6.3mmol)葡糖酸五乙酸酯的30ml氯仿溶液中，回流3小时。待混合物冷却到室温后，在减压下除去溶剂和过量亚硫酰氯。剩余的酰基氯溶解在10ml二氯甲烷。其间，1.53g(4.3mmol)脱乙酰基秋水仙素和1.00g(10mmol)三乙胺溶解在40ml二氯甲烷中并冷却到0℃。上述的酰基氯逐滴加入混合物中，在0℃搅拌1.5小时并在室温搅拌1.5小时，反应混合物用碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。待溶剂浓缩后，剩余物用硅胶柱色谱分离。用苯-丙酮溶剂(11∶3)洗脱，得到1.83g上述标题化合物(化合物6)。产率为57%。实施例8脱乙酰基秋水仙素-葡糖酸酰胺(化合物7)把实施例7中得到的脱乙酰基秋水仙素-葡糖酸五乙酰基酰胺(化合物6)(3.73g，5mmol)溶解在30ml甲醇中并冷却到0℃，逐滴加入5ml1N氢氧化钠，在0℃搅拌1小时，用稀盐酸调节混合物pH至7，在减压下浓缩。往剩余物中加入氯仿，过滤沉淀物。浓缩滤液，剩余物用硅胶柱色谱分离。结果，从苯-甲醇(5∶1)洗脱的部分中得到1.12g上述标题化合物(化合物7)7)。产率为42%。权利要求1.由下式表示的脱乙酰基秋水仙素衍生物，其中R为从C3-C7糖羧酸中除去COOH后得到的残基，在该残基中存在的羟基可用羟基保护基团适当保护。2.权利要求1的脱乙酰基秋水仙素衍生物，其中R为存在于这些基中的羟基可用酰基、乙缩醛基或酮缩醇基保护。3.权利要求1的脱乙酰基秋水仙素衍生物，选自脱乙酰基秋水仙素-甘油酸丙酮化物酰胺、脱乙酰基秋水仙素-甘油酸酰胺、脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸四乙酰基酰胺、脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸二乙酰基酰胺、脱乙酰基秋水仙素-葡糖醛酸酰胺、脱乙酰基秋水仙素-葡糖酸五乙酰基酰胺和脱乙酰基秋水仙素-葡糖酸酰胺。4.制备权利要求1所述的式(Ⅰ)脱乙酰基秋水仙素衍生物的方法，包括使式(Ⅱ)表示的脱乙酰基秋水仙素与下式表示的糖羧酸或它们的反应衍生物酰胺化其中R定义同权利要求1。5.含有权利要求1中所述的式(Ⅰ)的脱乙酰基秋水仙素衍生物的药剂。6.含有权利要求1中所述的式(Ⅰ)的脱乙酰基秋水仙素衍生物的抗肿瘤剂。7.药物制剂，包括权利要求1中所述的式(Ⅰ)的脱乙酰基秋水仙素衍生物和药物可接受的载体或稀释剂。8.制备由式(Ⅱ)表示的脱乙酰基秋水仙素衍生物的方法，包括由下式表示的秋水仙素与三烷基氧鎓氟硼酸盐反应，然后用水处理反应混合物。全文摘要由式(I)表示的脱乙酰基秋水仙素衍生物文档编号A61K31/704GK1063486SQ9111282公开日1992年8月12日申请日期1991年12月24日优先权日1990年12月25日发明者秋山澄申请人:有限会社尾源研究所