专利名称：口蹄疫疫苗的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于动物疫苗。特别是一种口蹄疫疫苗的生产方法。
口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)所致的偶蹄动物的一种急性发热性高度传染性疾病。在其病程中，在粘膜和皮肤上，特别是口腔和蹄叉中发生特征性水泡症状。该病为国际兽医局规定的A类动物流行病的第一个病害。
FMDV属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。有7个血清型，即O、A、C、Asia-I和SAT1、SAT2、SAT3，共计60余个亚型。
FMD流行面广，发病率高，曾在世界范围内造成巨大的经济损失，现在除少数地区和国家消灭了这种疫病外，在亚洲、非洲、南美洲以及欧洲部分地区仍然相当猖獗。
在防止FMD的综合措施中，采用疫苗接种的特异性预防方法，对控制本病流行和净化疫源地在我国以及世界许多国家都证明是行之有效的。
目前，国外在细胞悬浮培养、病毒繁殖，病毒灭活方面采用了微电脑控制的先进设备，疫苗配制及乳化均采用大缸或密封管道化。这样可减少大规模生产中的污染，使制造工序标准化，从而保证了疫苗的质量。
目前，国内所生产的FMD灭活疫苗，如我们中国农科院兰州兽医研究所生产FMD灭活疫苗使用的是传统的转瓶培养单层细胞繁殖病毒。原生产规程规定，1.5万毫升容量的转瓶需病毒及维持液3000毫升，相当于每平方厘米细胞单层1.0-1.2毫升病毒液。收获病毒液每毫升含病毒不足0.8微克，没有任何浓缩手段，直接用于疫苗配制，免疫动物(猪)只能耐受20-40ID50的强毒攻击，不能耐受同居感染。
FMD疫苗的效力，关键取决于抗原含量能否达到合理水平。国外大量实验认为FMD疫苗每毫升(1头份)应含有效抗原(146s)2-10微克，每毫升配苗病毒液大于107TCID50，免疫动物(猪)可耐受100个ID50以上的强毒攻击。国内疫苗对少量病毒感染或毒力不强毒株感染，可以起到一定作用，但对大爆发则显示出效力的严重不足。
本发明的目的是研制高效力的FMD疫苗。在不增加投资情况下，利用现有设备条件，改造生产工艺中的关键环节，大幅度地提高疫苗中的有效抗原含量，使疫苗的效力达到国际水平。
实现本发明的目的的技术方案是包括提高病毒浓度，提高转瓶机速度，改变疫苗配制程序等工序，提高病毒的方式有两种a、单层细胞长满后，加入病毒培养液，种毒10%，细胞培养用水解乳蛋白90%，用7,5%NaHCO3调节PH7.6-7.8，每个转瓶中病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.2-0.3毫升(随种毒不同而异)，病毒滴度每毫升超过108TCID50，病毒含量每毫升3-4微克;
b、对a法不能达到浓度标准的要进一步减少病毒培养液的加入量并使转瓶机速度提高到12转/小时。
制苗程序是将解冻的病毒液(大于108TCID50/ml)加入二乙烯亚胺(BEI)使之终浓度为2.5/10000，再用80目铜纱网过滤除去细胞碎片，并将加灭活剂的病毒液转入一个新容器，35-38℃水浴升温，使病毒液升至30℃，置于30℃温室，作用26小时，其中每3小时摇振一次，26小时后加入硫代硫酸钠使终浓液为2.0%，于30分钟后即可配制疫苗。
疫苗的配制采用水/油/水双相油乳剂，三者比例为3/5/3，即取5份含10%司班80的白油加入乳化器不停搅拌并缓慢加入水相抗原3份，搅拌为粘绸状态均匀后，再加入3份含4%吐温80的抗原水相搅拌均匀后即可以。
现就本发明的生产方法及工序作详细说明(1)按过去常规方法培养转瓶细胞单层(转瓶转速7-8转/小时)。
(2)单层细胞长满后，加入病毒培养液(种毒10%，细胞培养用水解乳蛋白90%，用7.5%NaHCO3调节PH7.6-7.8。每个转瓶病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.2-0.3毫升，病毒滴度每毫升超过108TCID50，病毒含量每毫升约3-4微克。
(3)有的FMD病毒株需要较高的浓度才能获得最佳免疫效果，或是出于减少疫苗使用量考虑，要求进一步提高抗原含量。如果象上述那样单纯靠少加病毒培养液的方法，会使细胞处于半干旱状态，不能高效率的复制病毒。因而我们在少加病毒培养液的同时，提高转瓶机速度，使转瓶速度提高到12转/小时。这样每平方厘米细胞单层只加0.1毫升病毒培养液仍然可使细胞正常复制病毒，相应的病毒含量较目前国内方法提高了约10倍。
(4)由于FMD病毒较脆弱，制苗过程中尽量缩短时间也是提高疫苗效力的重要环节。过去配制疫苗从病毒抗原解冻开始，往往需要10天-30天时间才能制出疫苗，而我们只需48小时即可完成一批疫苗配制。其程序是将解冻的病毒液(大于108TCID50/ml)加入二乙烯亚胺(BEI)使之终浓度为2.5/10000，用80目铜纱网过滤除去细胞碎片，并将加灭活剂的病毒液转入一个新容器，35-38℃水浴升温，使病毒液升至30℃，置于30℃温室，作用26小时，其中每3小时摇振一次。26小时加入硫代硫酸钠使终浓度为2.0%，取病液样品用于安全检验。30分钟后即可配制疫苗。
(5)疫苗的配制采用“水/油/水”双相油乳剂，三者比例为“3/5/3”，取5份含10%司班80的白油加入乳化器不断搅拌，缓慢加入水相抗原3份，搅拌为粘稠状态，均匀后，加入3份含4%吐温80的抗原水相搅拌均匀后即成。这样疫苗的粘稠度较目前的疫苗降低了30%，有利于免疫注射。将疫苗保存于5℃，待检验结果出来后方可出售。
(6)疫苗检验ⅰ安全检验a、将灭活后的病毒液接种2头断奶仔猪，每头6毫升，两侧耳后肌肉注射各3毫升，14天内不发生FMD症状或任何原因的死亡为合格;b、同时接种BHK21细胞，盲传2代，不出现CPE为合格;c、将每批配制好的疫苗接种2头仔猪，每头猪为6毫升，两侧耳后肌肉注射，一侧3毫升。14天内不得出现任何FMD症状或不明原因的死亡。
ⅱ细菌检验按国家生物制品标准检验方法执行。
ⅲ效力检验方法(1)免疫4头成年猪，每头耳后肌肉注射2毫升(国内原有疫苗3毫升)，30天后攻击强毒，并另设4头非免疫猪作对照。每头猪肌肉注射200ID50的强毒，14天内对照猪必须3/4发病，免疫猪3/4以上保护，为疫苗合格。
方法(2)按方法(1)免疫4头猪，30天后将4头免疫猪与4头人工发病猪同居于12M2的猪舍，14天内免疫猪3/4以上保护认为疫苗合格。
权利要求
1.一种用于动物口蹄疫疫苗的生产方法，特别是能提高疫苗中的有效抗原含量的方法，包括提高病毒浓度，提高转瓶机速度，改变疫苗配制程序等工序。提高病毒的方式有两种，其特征在于a、单层细胞长满后，加入病毒培养液，种毒10%，细胞培养用水解乳蛋白90%，用7.5%NaHCO3调节PH7.6-7.8，每个转瓶中病毒培养液的加入量按每平方厘米细胞单层0.2-0.3毫升(随种毒不同而异)，病毒滴度每毫升超过108TCID50，病毒含量每毫升3-4微克；b、对a法不能达到浓度标准的要使转瓶机速度提高到12转/小时。
2.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的生产方法，其特征在于制苗程序是将解冻的病毒液(大于108TCID50/ml)加入二乙烯亚胺(BEI)使之终浓度为2.5/10000，再用80目铜纱网过滤除去细胞碎片，并将加灭活剂的病毒液转入一个新容器，35-38℃水浴升温，使病毒液升至30℃，置于30℃温室，作用26小时，其中每3小时摇振一次，26小时后加入硫代硫酸钠使终浓液为2.0%,于30分钟后即可配制疫苗。
3.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗生产方法，其特征在于疫苗的配制采用水/油/水双相油乳剂，三者比例为3/5/3，即取5份含10%司班80的白油加入乳化器不停搅拌并缓慢加入水相抗原3份，搅拌为粘绸状态均匀后，再加入3份含4%吐温80的抗原水相搅拌均匀后即可以。
全文摘要
本发明属于动物免疫疫苗，涉及口蹄疫疫苗的生产方法。其主要方法是提高病毒浓度。包括减少病毒培养液或进一步减少病毒培养液并提高转瓶机转速，缩短疫苗配制周期，改变乳剂比例等工序，提高了疫苗的效力。减少了注射剂量。使动物免疫能力提高，经攻击强毒和同居强毒感染检验有显著效力。
文档编号A61K39/135GK1102996SQ9311488
公开日1995年5月31日 申请日期1993年11月24日 优先权日1993年11月24日
发明者薛景山 申请人:中国农科院兰州兽医研究所