专利名称：降钙素类似物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及降钙素类似物多肽及其应用。
本发明的多肽可用于防止和/或治疗钙代谢性疾病，例如减轻骨质疏松症的疼痛，防止骨形成不全骨质疏松症的骨折，治疗高钙血和Paget氏病。
降钙素作为一种肽激素由D.H.Copp等人于1961年在颈静脉血中首次发现，它显示出了降低血钙浓度的活性。
现在已经由具有如下所示序列(实质上相应于SEQ IDNO1)的32个氨基酸残基构建了降钙素5 10 15Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-20 25 30Phe-Asn-Lys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro·NH2在上列氨基酸序列中，Pro.NH2表示脯氨酸酰胺残基，第1和第7位上的两个Cys残基由一个二硫键相连。
此后，具有类似于降钙素生物活性的肽激素已由多种动物如鲑、鳗鲡、鸡、猪、大鼠、兔、羊、牛和Stingray中提取出来，这类天然降钙素的氨基酸序列已被测定。
降钙素的结构特点包括32个氨基酸的恒定链长，第1和第7位半胱氨酸残基间的二硫桥，在N末端由7个氨基酸残基形成的环，以及羧基末端的脯氨酸酰胺。然而，普遍存在于所有降钙素中的氨基酸残基仅是第1、第4—7、第28和第32位的氨基酸(共7个)。据认为，普遍存在于所有降钙素(末端的脯氨酸酰胺是展现其生物活性所必不可少的〔J.T.Potts，Jr.et al.，“Calcium，ParathyroidHormone and the Calcitonins”，page 121 printed byExcerpta Medica，Amsterdam(1971)P.Sieber，“Calcitonin1969”，page 28，Proc.2nd Symp.，printed by MedicalBooks，London(1970)；and W.Rittel et al.，“Experientia”，Vo.，32，page＝246(1976)〕。
已经知道降钙素显出降低血钙浓度〔P.F.Hirsch et al.，“Science”，Vol，146，page 412(1063)〕、抑制进食〔W.J.Freed etal.，“Science”，Vol.206，page 850(1979)〕和抑制胃分泌〔R.D.Hesch et al.，“Horm.Metab.Res.”，Vol.3，page 140(1971)〕的生物活性。
为了获得降钙素，首先尝试了从哺乳动物血及组织样品中提取，然后才应用化学合成法。前者的局限性来自原材料的可得性和纯化操作过程的麻烦；而后者也有合成操作麻烦的不足，因为所有的降钙素都由32个氨基酸残基构成，合成本身及纯化过程又需要较长的时间周期，以致于以合理的代价提供大量的降钙素是极其困难的。
近年来，遗传工程有了显著的发展，并已提出了遗传工程中的加工应用技术，包括以下步骤用DNA合成仪和单链cDNA合成编码降钙素之一的单链DNA片段；由单链cDAN制备双链DAN片段；纯化双链DNA片段；将纯化的双链DAN片段插入载体；用重组载体转化E.coli；培养转化体以表达编码降钙素的多肽；分离纯化所表达的多肽。然而，在这种情况下，具有C末端脯氨酸酰胺并表现出所需生物活性的多肽并不能由E.coli表达。因此，在分离一纯化步骤中需要进行C末端酰胺化处理，而C末端酰胺化酶非常昂贵，该酶学处理过程需要专门的技术和技巧，并且酶学过程致使目的产物的得率低。因此，考虑到试剂的成本及产物的得率，不能认为上述常规方法是一种适于工业规模生产降钙素的方法。
于是，受让人公司的研究人员努力地研究并调查了加工利用遗传重组技术，以发现勿需昂贵C末端酰胺化酶的各种降钙素类似物，每一种类似物在其氨基酸序列中不含有甲硫氨酸(Met)，C末端结构为脯氨酸33—高丝氨酸3酰胺(Pro32—Hse33—NH2)，低级烷基，1—20碳原子，高丝氨酸33酰胺，或者可任意选择的多肽链及在C末端含有高丝氨酸酰胺〔Jap.Pat.Hei4(A.D.1992)—59795(A)，相应于EP464549〕。在这些专利文献中所描述的方法有些类似于受让人公司对作为肽激素之一的胃动素类似物所提出的方法，公开于Jap.Pat.Hei3(A.D.1991)—80096(A)(相应于EP355720)。也就是说，根据上述专利文献所描述的方法，每一种降钙素的制备可以是合成单链DNA片段，该片段包括N末端的前导多肽及其C末端的Met残基，编码降钙素类似物基因的多肽及其C末端Met残基，在C末端有Met残基的间隔肽，编码降钙素类似物基因且在其C末端有Met残基的多肽(间隔肽与降钙素类似物基因以复数形式排列)；合成互补于第一条单链DNA片段的单链DNA片段；由单链DNA片段制备双链DNA片段；将双链DNA片段插入载体(如质粒)得到重组载体；用重组载体转化微生物(如E.coli)或哺乳动物细胞(如CHO细胞)；培养转化体以表达在转化体中作为包涵体或融合蛋白的多肽；用溴化氰处理包涵体以断裂每一位置上的Met，并将C末端的Met残基修饰为Hse或Hse—内酯残基；用酸处理反应液，例如，用0.1N HCl溶液于30℃处理3小时，将所有的多肽转变成在其C末端带有Hse—内酯的那种形式；冻干所得多肽；然后用氨处理，或与低级烷基胺反应。
在所说专利文献中公开的方法使得可能以合理的成本大量地制备各种降钙素类似物，但这些类似物的生物活性，如鲑I降钙素—Hse33—NH2基本上与天然鲑J降钙素的相同。
本发明的目的之一是提供一种降钙素类似物，它有如所说专利文献中的极佳产率，同时显示出较其基本天然型降钙素明显高的生物活性。
本发明另一个很重要的目的是提供防止和/或治疗钙代谢性疾病的药物组合物，它含有作为有效成分的降钙素类似物。
本发明人通过努力的研究发现，尽管普遍存在于所有天然降钙素中的C末端Pro—NH2结构被认为是展示降钙素生物活性所必需的，但用Hse32—NH2替代C末端的Pro32—NH2能显著地增强其生物活性，因此本发明是成立的。
因此，根据本发明，降钙素类似物的特征在于其氨基酸序列为(实质上相应于SEQ ID No2)5 10 15Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-20 25 30Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse·NH2
在上列氨基酸序列中，Hse·NH2表示高丝氨酸酰胺，1位和7位上的Cys残基由二硫键相连。
该氨基酸序列与鳗鲡降钙素的相同，但除了后者的C末端的氨基酸残基为Pro·NH2。
用于防止和/或治疗钙代谢性疾病的本发明药物组合物的特征在于含有作为有效成分的降钙素类似物，该类似物具有所说的氨基酸序列。
本发明的降钙素类似物的制备是通过用肽合成仪合成编码所说氨基酸序列但在32位有Hse残基的多肽，用铁氰化钾氧化1位和7位Cys中的硫羟基形成两Cys之间的二硫连接，用酸处理多肽形成C末端有Hse—内酯的多肽，用氨处理多肽以使其C末端酰胺化。
为了大量地得到降钙素类似物，应用了Jap.Pat.Hei 3(A.D.1991)—80096(A)(相应于EP355720)中所述方法。即，制备降钙素类似物通过合成单链DNA片段，该片段包括在N末端的前导多肽及其C末端Met，编码降钙素类似物基因的多肽及其32位C末端Met，C末端带Met的间隔肽，编码降钙素类似物基因且在其C末端有Met的多肽(间隔肽与降钙素类似物基因以复数形式排列)；合成互补于第一条单链DNA片段的单链DNA片段；由单链DNA片段制备双链DNA片段；将双链DNA片段插入载体(如质粒)得到重组载体；用重组载体转化微生物(如E.coli)或哺乳动物细胞(如CHO细胞)；培养转化体以表达在转化体中作为包涵体或融合蛋白的多肽；用溴化氰处理包涵体以断裂每一位置上的Met，并将C末端的Met修饰为Hse或Hse—内酯，再参考上文用铁氰化钾、酸和氨处理反应液。
下面将根据参照实施例、实施例、生物学试验实施例和药品制备实施例进一步解释本发明。参照实施例(合成天然型鳗鲡降钙素)使用肽合成仪(Model 431A，Applied Biosystems Co.)合成具有下列氨基酸序列的多肽，然后用三氟甲磺酸(TFMSA)法去除保护基和裂断多肽和树脂肽间的连接。在上述合成过程中，利用methylbenzhydrylamine树脂提供C末端酰胺肽。Cys—Ser—Asn—Leu—Ser—Thr—Cys—Val—Leu—Gly—Lys—Leu—Ser—Gln—Glu—Leu—His—Lys—Leu—Gln—Thr—Tyr—Pro—Arg—Thr—Asp—Val—Gly—Ala—Gly—Thr—Pro被合成的多肽经反相高效液相色谱(rp—HPLC)纯化，该过程用μ—bondasphere(Waters Co.)C—18柱(19×150mm)在下列条件下完成。
洗脱溶于0.012N HCl中的20—40％乙腈线性梯度(45分钟)流速7.0ml/min检测波长220nm回收主峰处的馏分，冻干。
取一部分冻干多肽(60mg)溶解于0.05％乙酸溶液中(60ml)。在用3M氨水溶液将pH值调至8.5后，加入0.1M铁氰化钾(1.8ml)，将混合物于室温下搅拌30分钟，以使1位和7位Cys残基间形成二硫桥。向反应液中加入50％乙酸溶液调pH值至5.0，再用Sephadex(Pharmacia AB)G—15柱进行凝胶过滤以除去多余的铁氰化钾，然后将肽馏分冻干。
所得的冻干多肽再一次用μ—bondasphere(Waters Co.)C—18柱(19×150mm)在上述相同条件下进行HPLC，得到所需的天然型鳗鲡降钙素。
用FAB—MS分析法鉴定多肽，以证实多肽是正确合成的。实施例(合成〔Hse32—NH2〕鳗鲡降钙素)使用肽合成仪(Model 431A，Applied Biosystems Co.)合成具有下列氨基序列的多肽，然后用TFMSA法除去保护基并裂断多肽与村脂肽间的连接。在上述合成过程中应用了氨甲基化的聚苯乙烯盐酸树脂，并利用N—Boc—O—苄基—L—高丝氨酰基—4—(甲氧基)苯乙酸作为高丝氨酸源(Boc四—丁氧羰基)。Cys—Ser—Asn—Len—Ser—Thr—Cys—Val—Leu—Gly—Lys—Leu—Ser—Gln—Glu—Leu—His—Lys—Leu—Gln—Thr—Tyr—Pro—Arg—Thr—Asp—ValGly—Ala—Gly—Thr—Hse·OHC—18柱(19×150mm)〕在下列条件下纯化，回收主峰的馏分，冻干。
洗脱溶入0.012N HCl的20—40％线性梯度的乙腈(45分钟)流速7.0ml/min检测波长220nm取一部分冻干多肽(60mg)溶解于0.05％乙酸溶液中(60ml)。在用3M氨水溶液将溶液pH值调至8.5后，加入1.8ml 0.1M铁氰化钾，将混合物于室温下搅拌30分钟，以使1位和7位Cys残基间形成二硫桥。向反应液中加入50％乙酸溶液调pH值至5.0，再用Sephadex(Pharmacia AB)G—15柱进行凝胶过滤，除去剩余的铁氰化钾，然后冻干肽馏分。
利用反相高效液相色谱在上述相同条件下纯化所得的冻干多肽。冻干具有C末端Hse残基的纯多肽，用0.1N HCl于30℃处理3小时进行内酯化，然后再冻干。
氨溶液(Adrich Co.，2.0M的甲醇溶液)以0.5ml氨溶液/1g多肽的量加入到冻干多肽中，于37℃搅拌1小时，Hse—内酯转变为相应的低级酰胺，然后于真空中干燥，得到所需的〔Hse32—NH2〕鳗鲡降钙素。
用FAB—MS分析法鉴定多肽，以证实所得多肽是正确合成的。药理学试验实施例(检测生物学活性)由实施例和参照实施例所得的多肽分别溶于含0.1％牛血清白蛋白(BSA)的1％乙酸钠缓冲液(pH4)中，经颈静脉向Wister雄性大鼠(6周龄，试验前一天禁食)给药。利用市售的检测试剂盒(“Cal-cium C—Test Wako”，Vako Pure Pharmaceuticals Co.Ltd.，Japan)经OCPC法检测给药1小时后的血清钙浓度。通过利用鳗鲡降钙素(Penisula Lab.Inc.，Lot No.015405，4500IU/mg)作标准和借助2—2平行剂量检测法得到表示为单位数的样品降钙素活性。所得的每毫克每种样品多肽的活性单位数作为比活性。
结果如下表1所示，由此可显而易见，本发明降钙素类似物(〔Hse32—NH2〕—鳗鲡降钙素)的生物活性显著高于其中的32位氨基酸为Pro—NH2的天然型鳗鲡降钙素。
表1样品 比活性(IU/mg)参照实施例4500实施例6800药品制备实施例将得自实施例并溶于精制水中的降钙素类似物水溶液(100IU)无菌装入小瓶。冻干后密封小瓶，得到干粉状药品。当需要用时，将药粉溶于盐水等进行注射。
药品中降钙素类似物的活性单位可在大约10—200IU范围内变化。
为肽类激素制剂所广泛接受的添加剂或稳定剂，如血清白蛋白或类似的肽和蛋白质可加入降钙素类似物溶液中。
序列表SEQ ID NO1序列类型氨基酸序列长度32个氨基酸链数单拓扑结构两者兼有分子类型肽假设的无反义无Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe5 10 15Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro20 25 30SEQ ID NO2序列类型氨基酸序列长度32个氨基酸链数单拓扑结构两者兼有分子类型肽假设的无反义无Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Xaa20 25 30SEQ ID NO3序列类型氨基酸序列长度32个氨基酸链数单拓扑结构线性分子类型肽假设的无反义无Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Pro20 25 30SEQ ID NO4序列类型氨基酸序列长度32个氨基酸链数单拓扑结构线性分子类型肽假设的无反义无Cys Ser Asn Leu Ser Thr Cys Val Leu Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu5 10 15His Lys Leu Gln Thr Tyr Pro Arg Thr Asp Val Gly Ala Gly Thr Xaa20 25 30
权利要求
1.一种具有下列氨基酸序列(实质上相应于SEQ IDNO2)的降钙素类似物5 10 15Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-20 25 30Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Hse·NH2其中，Hse·NH2表示高丝氨酸酰胺，1位和7位Cys残基由二硫键相连。
2.降低血钙浓度的药物组合物，包括有效量的具有权利要求1所示氨基酸序列的降钙素类似物，以及非毒性药物载体或赋形剂。
3.降低血钙浓度的方法，包括给需要这类治疗的病人施用有效量的、具有权利要求1所示氨基酸序列的降钙素类似物和非毒性药物载体或赋形剂。
全文摘要
本发明涉及降钙素类似物多肽及其应用。所说多肽具有的氨基酸序列是用高丝氨基酸残基(Hse·NH
文档编号A61P5/00GK1120549SQ9510703
公开日1996年4月17日 申请日期1995年6月20日 优先权日1994年6月21日
发明者野田伦, 吉名重亮, 石田力, 富谷升 申请人:株式会社三和化学研究所