专利名称：抗神经节苷酯单克隆抗体及其在恶性肿瘤特异性免疫治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明与免疫学领域相关，特别是和选出抗神经节苷脂单克隆抗体(Ab1′s)，此抗体具有特异性，有再发的独特表位并且具有对这些抗原的免疫反应作为免疫调节因子的价值。本专利进一步与获得用上述抗神经节苷脂单克隆抗体免疫而产生抗独特型单克隆抗体(Ab2s)有关。
神经节苷脂是含唾液酸的糖神经鞘脂，它可在大部分哺乳动物细胞表面表达。虽然这些抗原存在于正常组织当中，但在大量存在时，它们才能被发现，并且在恶性细胞表面以不同的组织结构形式表达(Hakomori，s.(1985)，Cancer Res.45，2405-2414；Miraldi，F.(1989)Seminars in Nuclear Medicine XIX，282-294；Hamil-ton，et al(1993)Int，J.Cancer 53，1-8)。
正常成熟的组织仅含有NeuAc，但不含有带有神经节苷脂NeuGc。
已经报道一些人类肿瘤包括黑色素瘤，结直肠癌，视网膜神经胶质瘤和非精胚产生的细胞瘤都有带有神经节苷脂的N-羟乙酰基神经氨酸，但是组成当中的唾液酸含量不足0.05％(Higachi，H.etal(1984)JPn J Cancer Res(Gann)75，1025-1029；Higachi，H.et al(1985)Cancer Res(Gann)78.1614-1620；Higachi.H.et al(1988)Jpn J Cancer Res(Gann)79，952-956；Miyake，M.et al(1990)Cancer 65.499-505)。
其他作者已经证明对于这些抗原的人单克隆抗体不识别任何结直肠癌或已研究的黑色素瘤(Furukawa K.et al(1988)J Biol.Chem.265，18507-18512)。
在乳腺癌中神经节苷脂的含量研究已证明，含有神经节苷脂的NeuGc大约占整个神经节苷脂总量的5-11％(专利申请131-93)。
神经节苷脂不是很好的免疫原，为了引发免疫反应，它们必须结合到蛋白上，或与质脂体或minnesota沙门氏R595菌株混合。对这些抗原反应的抗体特征之一是所产生的免疫球蛋白主要是IgM类。
虽然在人和鼠当中，也能发现IgG类抗神经节苷脂抗体，但是与T细胞的协同反应似乎是非特异性的并且需要有佐剂的诱导。所以每次免疫后而引起的抗体反应是短周期的，并有较低的效价(Liv-ing ston.P.o.(1991)Immunologz and Alergy Clinics of NorthAmeriCan 11，401-425；Portoukalian.J.et al(1991)Int.J.Cancer49，893-899)，也是一个典型的T细胞非依赖性抗原反应(Liv-in-gston.)P.O.et al(1982)Proc.Natl.Acad.Sci USA 84 J911-2915；Tai.J.et al(1985)Int J.Cancer 35.607-612；Livingston.P.O.etal(1989)Cancer Res，49，7045-7050)。
已经获得不同种类的鼠抗神经节苷脂单克隆抗体及人抗GD3，GM2和GD2单克隆抗体，大部分属于IgM类和IgG3亚类抗体(Pukel，C.S.et al(1982)J.EXP.Med.155，11133-1147；Cahan，L.D.et al(1982)Proc.Natl Acad.Sci.USA.79，7629-7633；Irie.R.F.et al(1982)79，5666-5670；Tai.T.et al(1983)Proc，NatL.A-cad.Sci.USA 80 5392-5396；Hiraba-Yashi.Y.et al(1985)，J.Biol Chem260，13328-13333；Cheung，N.K.V.et al(1985)CancerRes 45，2642；Natoli，E.J.et al(1986)Cancer Res，46，4116-4120；Reisfeld，R.and Shulz，G.(1986)Wo 86/00909；Miyake，M.et al(1988)Cancer Res 486154-6160；Kawashima，I.et al(1988)Int.J.Cancer41，267-274；Tai，T.et al(1988)Biochimica et BiophuysicaActa 958，134-138；Tai，T.et al(1988)J.Biochem.103，682-687；Yamamoto S.et al(1990)J.NatL Cancer Inst.82.1757-1760；Ya-masaki M(1990)专利号4,965,198；Kawashima，I.et al(1992)Molecular Immuuwlogz 29，625-632；Kotani，M.et al(1992)Biochimca et Biophysica Acta 1117，97-103)。
目前，已选择出鼠抗神经节苷脂单克隆抗体，用于被动肿瘤免疫治疗，及观察它们的特异性和亚类。
IgG3鼠抗GD3和GD2神经节苷脂单克隆抗体已被用于临床试验中，分别治疗黑色素瘤和成神经细胞瘤病人，虽然结果是有希望的，但仅在少量的病人群中，部分或全部病症获得缓解(Houghton，A.N.et al(1985)proc.NatL Acad sci USA82,1242；Dippold W.G.et al(1988)Eur.J.Cancer Clin oncol 24，865；Vadban-Raj.S.et al(1988).J.Clin oncol.6，1636；Saleh，M.N.et al(1992)Cancer Res52，4332-4347)。
特异性抗神经节苷脂单克隆抗体(自身T细胞非依赖性抗原)的免疫调节特性一直没有研究，因而当选择用于肿瘤免疫治疗的抗体时，这个事实不被考虑。
自身识别发生涉及调节免疫反应机制，大部分自身识别的发生是通过抗体识别和淋巴细胞的独特型介导。
因而，自身抗原的识别受到独特型网络动力平衡的调节(Katz.D.H.(1978)In Cell-Cell Recogniton A.S.G.Curtis.ed.Cam-bridge university press.Cambridge，P.4111；Zenetti，M.(1985)Im-munology Today 6.299；Martinez-A.C.et al(1988)Immunologi-cal Reviews101，191-215)。
研究自然抗体和它们的相互作用已导致了解到存在一个高度相联和广泛分布可变的区域性网络，这个网络是不同于抗原控制的“抗独特型级联反应”(Kazatchkine，M.D.Y Coutinho.A.(1993))，此级联反应构成了古典β-抗独特型疫苗概念的基础(内部影像)。
β-抗神经节苷脂单克隆抗体的抗独特型单克隆抗体已被产生(Yamamoto et al(1990)J.of the National Cancer Instituted 82.1757-1760；Chapman.P.B.and Houghton.A.N(1991)J.clin In-vest.88.186-192)，并用于主动肿瘤免疫治疗。
然而，已经报道仅根据抗原内部影像特征选出的抗独特型抗体是不适合于免疫治疗的，依靠一个独特型，其水平与疾病的进行或消退相关，而选择抗独特型用于设计一个相应的抗独特型免疫治疗是很重要的。
已经证明，在不同的抗原模型中，存在于直接对半抗原和自身抗原抗体上的某些独特型具有调节作用，在缺乏特型性抗原的情况下，这些独特型具有激活B细胞和T细胞网络的特征，并且还能作为它们激活的T细胞群依赖性的抗原反应的免疫抑制因子或激活因子(Teitel-baum，D.et al(1984)J.Immunologz 132，1282-1285；Zanetti M.et al(1988)J.Immunology 137，3140-3146；Powell，T.J.et al(1988)J.Immunology137，3140-3146；Powell，T.J.et al(1988)J.Immunology 140，3266-3272；Baskin，J.G(1990)J.Im-munology 145，202-208；Curuya A.et al(1992)Anticancer Res.1227-32)。
本发明的新颖性在于所产生和选择出的特异性抗神经节苷脂抗体，其抗体带有能激发对这些抗原(再发性独特表型)免疫反应的独特表型，它们能被用于表达所说的神经节苷脂肿瘤病人的主动免疫治疗，并可产生对神经节苷脂单克隆抗体的抗独特型单克隆抗体，并且有以上提到的特性。
抗神经节苷脂单克隆抗体及其在恶性肿瘤特异性主动免疫治疗中的应用本发明与免疫学领域相关、特别是产生和筛选出抗神经节苷脂单克隆抗体(mAbs)，此抗体具有特异性，有再发性独特表位，还具有对这些抗原的免疫反应起免疫调节因子的作用，并且用所说的抗神经节苷脂mAbs免疫，获得抗独特型mAbs。
据此，本发明的目的是提供抗神经节苷脂mAbs，其带有的独特型在抗原缺乏的情况下，也能诱导一个抗原特异性反应。本发明也提供了产生此抗体的方法。
本发明的另一个目的是提供由抗神经节苷脂mAbs免疫产生的抗独特型mAbs，此独特型mAbs具有以上提到的特性并且还能产生一个抗原特异性反应。
本发明更深远的目的在于产生特异性的抗神经节苷脂单克隆抗体，用所说的抗体免疫鼠和其他种类动物，筛选出能产生抗原特异性反应的抗体；用上述的抗神经节苷脂mAbs免疫鼠或其他种类动物而产生抗独特型mAbs。
要说明的是这里应用的抗体范围应包括片段，衍生物及有相似抗原结合特征的类似物。在技术中知道许多得到衍生物和/或片段的方法。
产生衍生物和/或片段的方法不仅局限于化学裂解和/或(再)装配，还包括单链抗体和/或分子识别单位(MRU′S)，CDR移植物，类型转化等形式重组产物。神经节苷脂的分离应用一个改进Hakomori′s技术方法，从已知的自然来源获得神经节苷脂(Hakomori，s et al(1974)Methods in Enzymology，Vol.32，Part B.P.350)。脂质体颗粒的制备含有神经节苷脂的脂质结构是用DPPC和胆固醇制备而成的。
已知份数的DDPC和胆固醇溶解在三氟甲烷溶液中，然后加到圆底的瓶中，保证磷酸脂胆固醇克分子比例在1∶1.5和1∶2之间。
神经节苷脂溶解在三氯甲烷∶甲醇∶水(60∶30∶4.5)中，与上述液体混合，在玻璃珠存在情况下，旋转蒸发脂质混合液。
去除大量溶剂后，微细的脂质膜置真空条件下持续约30分钟。
脂质的水化作用在PBS液中完成，一个容积允许的脂质浓度在2和10mg/mol之间。
最终制备DDPC和胆固醇与神经节苷脂比例维持在40∶1和20∶1摩尔比之间。
脂质体制备物含有破伤风类毒素，其最终浓度维持在0.5-1mg/ml之间。
悬浮液放在超声室中超声处理5至10分钟，并带有一分钟的间隔。
脂质体制备物放置45℃条件下，持续搅动30至60分钟。
当需要时，用1×65cm CL-4B sepharose柱，流速约20cm/h，凝胶过滤去除非包裹的蛋白。
用PBS洗脱，收集1.5ml洗脱液部分。质脂体制备物的特征a.-评估固定在质脂体颗粒中的神经节苷脂用0.5-1ml质脂体悬液估计在脂质体膜中的神经节苷脂含量，制备过程如前描述的，含有碳14(1-2μci)标记的神经节苷脂，并且用一个1.5×50cm，流速为7cm/h，Sepharose 4B柱，完成亲和层析凝胶过滤，用PBS洗脱，收集1mL洗脱液部分。
把吸收变异度控制在350和500nm之间，允许测定在亲和层析切面中的质脂体和微粒。无论怎样，测定在每部分洗脱液中cpm，可用于做计结合在质脂体制备物中神经节苷脂的百分数，结合率在20-80％之间。b.-测定包裹在质脂体结构中蛋白的百分数用0.5-1ml含有I125(1-2μci)标记的蛋白非离心质脂体制备物，通过1.5×50cm，流速约为7cm/h，G-50 Sephadex柱，进行凝胶过滤亲和层析。用PBS洗脱，并收集1mL洗脱液部分。
估价在60nm比浊度和每部分洗脱液中cpm可用于进一步测定质脂体微粒的存在，并用于估价在质脂体结构中包裹蛋白大约百分率。包裹蛋白的量总是在10％以下。产生抗神经节苷脂抗体反应的免疫过程用剂量为20至50μg神经节苷脂质脂体制备物免疫鼠和其他哺乳动物。制备物中也含有蛋白，所加的蛋白量为5-10μg/剂量。
在免疫前和免疫动物期间，采动物血清标本用于检测动物产生的抗神经节苷脂抗体的效价，用神经节苷脂作为抗原，通过任何已知的免疫学方法测定抗原-抗体反应。
第一次剂量免疫三天前，用低剂量的环磷酰胺(15mg/kg)注射给动物，以便减弱抑制细胞的活性(Livingston，p.p.et al(1987)J.Immunol 131.2601；Hoo，D. S.B.et al(1990)Cancer Res.50.5358-5354)。
用多种剂量的质脂体制备物在间隔3-4天和一周期间，免疫动物。可用0.1-0.2ml体积质脂体制备物皮下注射，其它可能的免疫途径包括静脉内和腹膜内注射。
在短的时间间隔内获得5-9次质脂体制备物剂量免疫动物，发生对神经节苷脂作为抗原的抗体反应。特异性抗神经节苷脂单克隆抗体制备对神经节苷脂有血清抗体滴度的鼠，在获得抗体产生细胞三天前，再用质脂体制备物免疫一次。虽然脾细胞将被优先采用，其他抗体产生细胞也可被选用。
这些细胞与杂交瘤细胞融合，形成杂交细胞或杂交瘤，其具有在体外、体内繁殖的特征。细胞融合可用任何已知的方法完成。
通过免疫检测方法，优先选用酶联免疫学方法检测杂交瘤产生的抗体，在酶联免疫反应中，杂交瘤上清液与神经节苷脂反应，并用在相应条件下能结合抗体的酶标第二抗体测定抗原-抗体结合。
一旦理想的杂交瘤被选出和克隆(即有限稀释法)至少两次，在体外适宜的培养液中，目的mAbs能被产生。在一个相应的期间，可从上清液中连续获得理想的抗体。
已经知道或容易测定所选择培养基和相适应的培养时期。
其它产生抗体的方法包括注射杂交瘤在动物体内(即同系鼠)。杂交瘤将引起非固体瘤的形成，此瘤在宿主动物血液中和腹膜渗出液(腹水)中产生高浓度的理想抗体。
所获得mAbs对不同的神经节苷脂有不同的特异性。
获得对抗神经节苷脂mAbs抗独特型(Ab2)和抗-抗独特型(Ab1′)抗体反应的免疫程序。
用25-200μg剂量纯化抗神经节苷脂mAbs，用或不用佐剂，随机结合到转运蛋白上，来免疫鼠或其他哺乳类动物。
在15-30天的免疫间隔，动物获得3-6个剂量的抗神经节苷脂免疫，可能的免疫途径是腹膜内、皮下，静脉内免疫，或者这些途径的结合。
免疫动物前和免疫动物期间，采动物血清，通过已知免疫检测方法，测定Ab2和Ab1′抗体反应水平，动物血清稀释液与作为免疫原的抗神经节苷脂mAbs，或其他不在免疫过程应用的或神经节苷脂进行反应。
实验还用于确定被免疫动物的血清具有阻断作为免疫原抗神经节苷脂mAb结合其抗原的能力。
尽而，这些特异的抗神经节苷脂mAbs能与产生抗独特型反应(Ab2)的独特型网络联系在一起，并在抗原缺乏的情况下，选择出产生的抗-抗独特型抗体反应(Ab1′)。也就是可选出抗神经节苷脂mAbs，带有能引发一个抗神经节苷脂免疫反应(再发性表型)的独特表型。抗具有再发生表位的抗神经节苷脂mAbs的抗独特型mAb的产生获得抗体产生细胞三天前，用作为免疫原的抗神经节苷脂mAbs再免疫具有高的抗神经节苷脂Ab2抗体滴度的鼠，按以前描述的方法与骨髓瘤细胞融合。
通过任何已知的免疫检测测定融合细胞后获得杂交瘤上清液。上清液与作为免疫原的mAb和没用于免疫的抗神经节苷脂mAbs反应。
通过相应稀释度的抗神经节苷脂mAb上清液与下列所说抗体与抗原反应物作用，发现杂交瘤的上清液能阻断用作免疫原的抗神经节苷脂mAb与其抗原的结合。
筛选出的杂交瘤至少克隆两次，正如以前描述方法，在体内、体外产生目的mAbs。
获得的抗独特型mAbs识别抗神经节苷脂mAbs并随机具有(β型)阻断抗神经节苷脂mAb结合其抗原的能力。应用a型抗独特型mAbs获得抗神经节苷脂抗体反应的免疫程序用a型抗独特型mAbs免疫鼠或其他动物。这些mAbs用作免疫原之前，能结合到转运蛋白上。
在免疫间隔15-30天之间，每个动物获得3-5次25-200μga-型抗独特型mAb免疫，免疫途径能用腹膜内、皮下，静脉注射，或几种途径的联合应用在免疫前和免疫期间，采集动物血标本，用任何已知的免疫检测方法，测定对不同的神经节苷脂的血清抗体效价。
用与独特型网络高度相关的抗神经节苷脂mAbs免疫而产生a-抗独特型mAbs，再注射给动物，能诱导出疫苗效应，产生一个抗神经节苷脂的抗体反应(Ab1′)。
实施例1应用短时间间隔和高剂量累积非典型免疫程序产生对NeuACGM2的抗体反应(Ab1)6-8周老的雌性Balb/c鼠，在腹膜内注射溶解在PBS中的环磷酰胺(15mg/kg)(Livingston P.O.et al.(1983)，J.of Immunol131，3601；Hoo，D.s.B.et al(1990)Cancer Res，50，5358)。三天后，用0.2ml含50μg NeuACGM2质脂体制备物皮下免疫小鼠。
在间隔3-4天，动物获得5次免疫，免疫间隔一周，再免疫4次，引起全部累积量达到450μg。在开始免疫前和第五次和第九次免疫后一周，取动物血清标本。
通过间接免疫酶联法检测鼠血清中的抗体水平，把NeuAcGM2固定在已活化聚氯乙烯板上，按下列方法进行操作。
把含NeuACGM2的50微升甲醇液加至每孔中，放置板37℃，一小时蒸发去除甲醇。把50μl含1％牛血清白蛋白(BSA)的TRIS-HCl液(0.05M，pH7.8)加至孔中，37℃，30分钟。50μl PBS稀释血清加到每孔中，放置板在37℃、90分钟。用200μl PBS洗孔四次，150μl相应稀释的碱性磷酸酶标记抗鼠免疫球蛋白抗血清。PBS洗涤后，每孔加100μl底物缓冲液(1mg/mL P-硝基苯酚磷酸盐稀释在ph9.8二羟乙基胺缓冲液中)，选用405nm波长，在ELISA仪上测定吸收值。
最先5次免疫后，鼠没有表现出对NeuACGM2的抗体反应。累积9次免疫后、50％免疫动物获得可测到抗体反应(
图1)。实施例2抗NeuACGM3抗体反应的产生第一次免疫雌性Balb/c 6-8周裸三天前，腹膜下注射环磷酰胺(15mg/kg)，第一次用含有50μg NeuACGM3和5μg破伤风类毒素0.2ml质脂体制备物免疫动物。间隔3-4天，剂量免疫动物5次，再加间隔一周，剂量免疫动物两次，在开始免疫前和免疫后，采动物血清，用实施例1的方法测定鼠血清中的抗体水平。
从图2可看出，用各种剂量免原免疫鼠后，总剂量累积到350μg，仍不产生对NeuGCGM3的抗体反应。实施例3含单唾液酸神经节苷脂NeuAc和NeuGc单克隆抗体的产生根据实施例1和2描述的程序，用含NeuACGM1，NeuACGM，NeuACGM3和NeuGCGM3神经节苷脂的质脂体制备物免疫Balb/c鼠，产生单克隆抗体。融合细胞三天前，用各自的质脂体制备再免疫动物一次，而后取出鼠的脾细胞通过压迫组织经过不锈钢滤网或灌注脾脏制备细胞悬浮液。用Kohler和Milstein的方法，略有改动，完成融合过程(1975，Nature(lond)256，495-497)。0.5ml含42％聚乙二醇RPMI-1640融合培养液中，10份脾细胞与1份非选择性P3/X63Ag86.5.3.骨髓瘤细胞融合。融合后的细胞培养在HAT(次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷)筛选培养液中，5％CO2、37℃，湿润条件下。融合细胞生长10-15天后，用实施例1描述的ELISA法检测杂交瘤上清液中抗体的产生。筛选出识别神经节苷脂杂交瘤细胞，用有限稀释法，在条件细胞存在情况下再克隆两次。用一组糖脂，通过间接ELISA和改进的Magnani等描述的微层免疫染色色谱法测定选筛出的杂交瘤细胞产生的抗体特异性(Anal Biochem，109，399-402，1980)。
应用高压薄层层析法分离糖脂，用氨仿/甲醇/氯化钾(0.25％)，体积比为50∶40∶10，作为层析溶剂。放板在空气中干燥，用0.5％溶于己烷中多聚异丁基甲基丙烯酸树塑化板(Aldrich Chemi-cal Co.Ltd.，Gillingham，English)。用1％BSA 0.05M，pH7.8-8.0 TRIS-HCl缓冲液封闭干燥的板，室温、30分钟。然后放抗神经节苷脂mAbs(组织培养上清液)至板中，室温下过夜。用PBS洗板4次后，与碱性磷酸酶标记抗鼠免疫球蛋白抗血清反应，室温下3小时，用1％BSA TRIS-HCl缓冲液1∶5000稀释酶标记抗体(Jack-Son Immuhoresearch Laboratories Inc)。用同样条件洗板，与底物溶液37℃培养1小时，0.1％5-溴4-氯-3-吲哚磷酸盐溶于含有1mM ZnCl2，1mM，MgCl2的0.1M pH10.4甘氨酸缓冲液中形成底物液，用水洗后，终止反应。
选筛出单克隆细胞(0.5-1×106细胞在0.2ml溶液中)腹膜内注入Balb/c鼠，再接种2.6.10.14-四甲基-五癸烷。另外，其它腹水形成因子也能被应用。从表1可看出，识别不同的单唾液酸神经节苷脂4个IgM类mAbs能被获得。A3mAb优先识别NeuACGM2和NeuACGM1并与NeuACGM3有中等的反应(产生A3抗体的杂交瘤细胞系已储存ECACC)，上述A3mAb识别物都带有N-2酰唾液酸残基。带有额外N-2酰唾液酸残基(GD1b或GD1a)或缺失N-2酰唾液酸残基(Gg4Cer)的神结节苷脂都不与A3mAb反应。
像NeuACGM3神经节苷脂，末端半乳糖胺的丢失可降低与A3抗体反应。这些结果加上末端半乳糖丢失不影响对NeuACGM2的识别证实，A3mAb识别表位将GalNACβ1-4(NeuACa2-3)。Gal三糖序列。E1mAb表现出仅在NeuACGM2测到高度局限的特异性(产E1抗体杂交瘤细胞株已存放在ECACC，)。有一个末端半乳糖胺丢失的糖脂，即NeuACGM3，或加末端半乳糖的糖脂，即NeuACCM，是不被E1mAb识别的。E1mAb能区别N-乙酰和N-羟乙酰基群，尽而连接到内部半乳糖上的末端半乳糖胺和N-乙酰神经胺酸与抗体识别有关。F6mAb主要与NeuACGM1反应，与GD1b呈中等反应，和Cg4Cer糖脂有较低的反应(产生F6抗体的杂交瘤细胞系存放在ECACC，编号)。此抗体不识别缺乏末端半乳糖神经节苷脂(GM2和GD2)，也不识别末端半乳糖上连有N-2酰神经胺酸的GD1a，这说明此外部单糖对于结合抗体是很重要的。此外，缺乏N-2酰神经氨酸连接到内部半乳糖(Gg4Cer)的糖脂与F6mAb有弱反应，而另加N-2酰唾液酸残基至这位点上(GD16与GM1比较)将呈现中等抗体反应。所有这些事实说明，Galβ1-3GalNAcβ1-4(NeuAcα2-3)Gal的四糖结构与抗原识别有关。
P3mAb与神经节苷脂内部半乳糖相连羟乙酰基神经胺酸特异性结合(产P3抗体杂交瘤细胞株存放在EACC、编号)。实施例4P3mAb对肿瘤的识别固定组织在10％甲醛液中，脱水、洗涤和石蜡包埋，H和E染色组织切片，确定组织病理特征。组织病理学估价的组织连续切片，用以前描述的生物素链球菌抗生物素蛋白过氧化物酶法免疫染色切片(Hsu.S.M和Raine L.(1981)J.Histochem.cytochem291349-1353)。
脱蜡和脱水的组织切片用3％H2O2(甲醇液)处理30分钟，以便去除内源性过氧化物酶。切片与P3mAb(组织培养上清液)在室温下反应1小时。然后，生物素标记羊抗鼠免疫球蛋白和生物素链球菌抗生素蛋白过氧化物酶复合物，(DAKO A/S)被加、分别在室温下反应30分钟。用TRIS盐缓冲液洗反应过的切片。过氧化物酶反应在含5ml TRIS盐缓冲液，5μl 30％H2O2和3mg3-3二氨基联苯胺溶液中进行。用自来水洗玻片，用Mayer′s苏木精进行负染，加含有香脂计数培养液，再放盖玻片。酶反应产生棕色，分类如下，阴性反应(-)，弱阳性(+)，阳性(++)和强阳性(+++)。在导管侵润乳腺癌，乳腺癌转移的淋巴结及乳腺病组织切片，与P3mAb呈阳性反应。抗体表现出微细的细胞浆和细胞膜颗粒反应，但没观察到与已研究的其他恶性和良性肿瘤组织反应(表2)。实施例5在同基因模型中对IgM抗神经节苷脂抗体的抗独特型反应(Ab2)用Balb/c鼠两种不同的免疫程序被完成，每15天内，鼠获得四至六次25μg mAb腹膜内免疫，A3、P3和E1mAbs单独注射或与作为载体蛋白KLH连接后免疫鼠，第一次剂量免疫加完全福氏佐剂，而以后的剂量免疫不完全福氏佐剂可被应用。在免疫前和免疫后7天，采鼠血清标本。通过ELISA检测Ab2的存在。ELISA板(高结合性CosTAR板)与溶在碳酸盐—碳酸氢盐缓冲液中(pH9.8)10μg/ml不同种类抗神经节苷脂mAbs反应、40℃、过夜。mAbs先作为免疫原。用含0.05％Tween20 PBS洗板后，用1％BSA同样缓冲液封闭，37℃，1小时。重复洗板，加50μl/孔不同种类血清稀释液作用2小时后，再洗板，加碱性磷酸酶连接的羊抗鼠IgG Fc片段抗血清洗后，加以前描述的ELISA底物液。
用E1和A3单独免疫鼠时，没有获得鼠血清中Ab2反应，而注射与KLH连接同样抗体和佐剂，引起很强的对mAb作为免疫原特异性的IgG型抗独特型抗体反应(Ab2)。同样，用P3mAb(抗-NeuGCGM2NeuGCGM3)单独免疫时，表现IgG型Ab2反应(抗体效价1∶1000)，当与KLH结合后并与佐剂一起免疫时，抗体效价升高(1∶50000)，结果见表3。对这些mAbs IgG型抗独特型反应(Ab2)表明，有辅助T细胞参加这一抗体反应。这些生理学注射IgM类Ab1抗神经节苷脂mAbs表现在同源鼠中产生Ab2反应不同能力，尽而与Balb/c鼠T细胞独特型网络连接能力不同。无论怎样，当与KLH结合，有佐剂存在时，所有mAbs都能与T细胞和B细胞独特型网络联合，产生强的Ab2反应。实施例6同基因型中产生对IgM型抗神经节苷脂mAbs的抗独特反应(Ab1′)特异性抗原依赖的抗体反应E1(抗-NeuAcGM2)和P3(抗-NeuAcGM3/NeuAcGM2)mAbs连接到KLH上，用于免疫6-8周雌鼠(Balb/c系)。在15天间隔，第一次剂量免疫有福氏佐剂存在，以后免疫不完全福氏佐剂情况下，动物获得25μg剂量连结到KLH上mAb。免疫前和免疫期间，采动物血清标本。用实施例1描述的间接ELISA法测定Ab1′抗体水平。用质脂体免疫需要至少9个剂量以获得对NeuAcGM2抗体反应。相反，当用连接到KLH E1mAb完成免疫反应，仅需要3个剂量可获得抗神经节苷脂抗体反应(图3)。同样，用连接到KLH P3mAb免疫8只动物，6只可产生抗NeuAcGM2抗体反应(Ab1′)，结果见(图4、图5)。
这些结果证明生理状态或连接到KLH的抗体能引发Ab2型反应，在同基因型中还有产生Ab1′反应的能力，证明这些抗体有再发性表位，即能产生一个特异性抗原非依赖抗体反应表位。实施例7用P3mAb免疫Balb/c鼠产生抗神经节苷脂mAbs杂交瘤的产生按实施例6描述的免疫程序，用连接到KLH上P3mAb免疫6-8周雌性Balb/c鼠。按实施例3描述的融合技术，取血清中有对NeuAcGM3Ab1′型抗体效价的鼠脾细胞与P3/X63 Ag86.5.3杂交瘤细胞系融合。从这融合细胞中，获得产生优先识别单唾液酸抗的杂交细胞克隆(图6)。相反，用含NeuGcGM3质脂体和破伤风类毒素免疫产生主要克隆，分泌的抗体识别所有用于实验的神经节苷脂(图7)。因而用P3mAb免疫产生的分泌抗神经节苷脂抗体克隆，相似或性质上优于包裹在脂质体中神经节苷脂免疫产生克隆。实施例8同基因型中抗E1mAb抗独特型抗体的产生按实施例4描述的免疫程序，用连接到KLH E1mAb(抗NeuAcGM2)免疫6-8周雌性Balb/c鼠。带有抗E1mAb Ab2抗体高血清水平的鼠脾细胞，按实施例3描述的融合方法，与P3/X63Ag86.5.3.骨髓瘤细胞融合。获得IgG2a亚类抗独特型mAb。进一步证明此抗体属于a-抗独特型mAb，因为它不能抑制E1mAb与自身抗原(NeuAcGM2)的结合(图8)。这个B7抗-idE1mAb表明是与试验用一组抗神经节苷脂抗体Ab1高度相关。它与作为免疫原E1mAb和P3(抗-NeuGCGM3/Neu GcGM2)和A3(抗-NeuGCGM2/Neu AcGM1/NeuGCGM3)mAbs反应(图9)。产生抗-idE1杂交瘤细胞系存放在EcACC，编号)。
另一IgG2a亚类抗独特型mAb也被获得。这是一个互补位(β或γ)抗独特型抗体，因为它能抑制E1mAb与自身抗原(NeuAcGM2)的结合(图10)。这一抗-idE1(F2)mAb对作为免疫原E1mAb是很特异，而不与其它抗神经节苷脂抗体，如P3和A3mAbs反应(图11)。实施例9同基因型中用B7抗-idE1mAb免疫后产生抗NeuAcGM2抗体反应B7抗-idE1mAb连接至KLH后，用于免疫6-8周雌性Balb/c鼠，21天间隔，用50μgmAb剂量免疫，动物获得三次连接到KLH抗-idE1mAb剂量免疫。第一次免疫加福氏完全佐剂，其他两次免疫加福氏不完全佐剂。免疫前和免疫后采集血清标本，按实施例1的间接ELISA法测定对NeuAcGM2抗体反应。正如图12显示的，a-B7抗-idE1mAb能在同基因型内产生对NeuAcGM2抗体反应。
图1表示用结合至质脂体上神经节苷脂免疫小鼠获得血清，用ELISA测定抗NeuAcGM2血清抗体反应。第五次和第九次免疫后，测定抗体反应。
图2表示用结合至含破伤风类毒素质脂体上神经节苷脂免疫小鼠获得血清中的抗NeuAcGM3血清抗体反应。动物获得第5次和第7次免疫原免疫后，通过ELISA测定80倍稀释血清中抗体反应。
图3表示在福氏佐剂存在条件下，用结合至KLH E1mAb免疫Balb/c鼠，产生对NeuAcGM2抗-抗独特型血清抗体反应(Ab1′)。动物获得3次剂量免疫前和免疫后，用间接ELISA测定Ab1′抗体反应。
图4和5表示在福氏佐剂存在时用结合到KLH P3mAb免疫鼠，用间接ELISA测定其血清中抗NeuAcGM3抗-抗独特型(Ab1′)反应。第5次和第6次剂量免疫动物前后，测Ab1′反应。
图6表示X63Ag86.5.3骨髓瘤细胞与P3mAb免疫鼠的脾细胞融合形成杂交瘤，所产生上清液对不同神经节苷脂的识别图型。
图7表示用NeuAcGM3结合质脂体并带有破伤风类毒素免疫鼠的脾细胞与X63Ag 86.5.3骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，所产生上清液对不同神经节苷脂识别图型。
图8表示E1mAb与抗-idE1mAb或不同稀释度鼠多克隆抗-idE1抗血清反应出现的抑制结果，而后E1mAb与NeuAcGM2的结合的抑制结果用ELISA测定并且计算出结合抑制百分率。
图9表示抗-idE1mAb与E1，A3和P3抗神经节苷脂mAbs反应。
图10表示用不同的Ab2上清液，抑制E1mAb与GM2的结合。
图11表示一些Ab2杂交瘤对其它IgM抗-糖类mAbs的特异性。
图12表示用B7抗-idE1mAb免疫鼠产生抗NeuAcGM2血清抗体反应。用与KLH相连mAb第二次和第三次免疫动物前后，测定抗体反应。
表1表示用ELISA和HPTLC免疫染色方法确定A3、E1、F6和P3mAbs对不同糖脂反应。
表2表示应用P3mAb通过免疫组化研究不同恶性和良性人类组织反应结果。
表3表示应用三个25μg剂量抗神经节苷脂mAbs(A3、E1和P3)单独或与KLH结合后，15天间隔，注射免疫Balb/c鼠时，在同基因型中获得抗独特型(Ab2)反应。
表1抗不同种类神经节苷脂mAbs反应mAb神经节苷脂A3 E1 F6 P3NeuGcGM3 - - - +++NeuGcGM2 - - - +++GM3++ - - -GM2++++++- -GM1+++- +++-GD1a - - - -GD1b - - ++ -GD3- - - -GD2- - - -GT1b - - - -Gg4Cer - - + -LacCer - - - -+++ 强++中等 +弱-阴性表2.
在不同恶性和良性肿瘤中P3MAb识别方式
表3抗神经节苷脂抗体的抗独特型反应mAb# 反应鼠特异性Ab2效价 非特异性Ab2效价A3 ALONE 0/8 00A3+KLH 0/8 1/400000 0(E1和P3)E1 ALONE 0/6 00E1+KLH 5/6 1/20000 0(A3和P3)P3 ALONE 6/8 1/1000 0(E1和P3)P3+KLH 8/8 1/50000 0(E1和P3)
权利要求
1.高度特异抗神经节苷脂IgM单克隆抗体，其特征是它具有再发性表位。
2.根据权利要求1的单克隆抗体具有结合末端四糖序列Galβ1-3GalNACβ1-4(NeuA(a2-3)Gal的能力。
3.根据权利要求2的单克隆抗体，它命名为F6。
4.根据权利要求1的单克隆抗体，它具有结合NeuACGM2和NeuACGM1神经节苷脂中三糖序列Galβ1-3GdNACβ1-4(NeuA(a2-3)Gal的能力。
5.根据权利要求4的单克隆抗体，其特征是当结合到转运蛋白上并用于免疫动物时，它具有与独立特型网络连接。
6.根据权利要求4和5的单克隆抗体，命名为A3。
7.根据权利要求1的单克隆抗体，它具有与连结到NeuACGM2神经节苷脂内部半乳糖上末端半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸结合的能力。
8.根据权利要求7的单克隆抗体，当连接到转运蛋白上并用于免疫动物时它具有与产生Abz和Ab1′型抗体反应独特型网络相连的特征。
9.根据权利要求7和8的单克隆抗体，它被命名为E1。
10.根据权利要求1的单克隆抗体，它能与连接到神经节苷脂内部半乳糖上N-羟基神经氨酸特异性结合。
11.根据权利要求10的单克隆抗体，当单独或与转运蛋白结合后免疫动物，它具有与产生Ab2和Ab1′型抗体的独特型网络相连特征。
12.根据权利要求10和11的单克隆抗体，它被命名为P3。
13.获得权利要求1-12中任一项所述的抗神经节苷脂单克隆抗体的方法，其特征是应用依赖于在短时间间隔内，反复注射以达到抗原大量积累的免疫方案。
14.产生权利要求1-12中任一项所述的单克隆抗体的杂交瘤，它是通过鼠骨髓瘤细胞与权利要求13所述免疫鼠的细胞融合而产生的。
15.产生权利要求3单克隆抗体的杂交瘤。
16.产生权利要求6单克隆抗体的杂交瘤。
17.产生权利要求9单克隆抗体的杂交瘤。
18.产生权利要求12单克隆抗体的杂交瘤。
19.测定表达神经节苷脂肿瘤细胞的免疫学方法，其特征是应用根据权利要求1至12任何一项单克隆抗体结合标记物，如酶，色基、荧光基团，辅酶、化学发光物质和放射核素。
20.根据权利要求19方法，细胞是乳腺癌细胞并且识别此细胞的单克隆抗体是根据权利要求10至12任何一项中单克隆抗体。
21.获得抗神经节苷脂抗体反应(Ab1′)和抗独特型抗体(Ab2)的方法，其特征是应用根据权利要求1至12任何一项中单克隆抗体免疫而完成的。
22.根据权利要求21而获得的抗神经节苷脂单克隆抗体。
23.产生根据权利要求22抗神经节苷脂单克隆抗体的杂交瘤。
24.根据权利要求21获得的抗独特型单克隆抗体，为IgG类。
25.产生根据权利要求24抗独特型单克隆抗体的杂交瘤。
26.通过应用根据权利要求24单克隆抗体免疫动物获得抗神经节苷脂抗体反应的方法。
27.获得根据权利要求21抗独特型单克隆抗体的方法，其特征是应用根据权利要求7至9任何一项中单克隆抗体作为免疫原。
28.根据权利要求27获得的抗独特型单克隆抗体，其特征是a-抗独特型单克隆抗体与根据权利要求4至12任何一项单克隆抗体反应。
29.根据权利要求28的抗独特型单克隆抗体，它被命名为B7抗-idE1。
30.产生根据权利要求29的单克隆抗体的杂交瘤。
31.通过用根据权利要求28和29的抗独特型单克隆抗体免疫动物而获得抗NeuAcGM2抗体反应的方法。
32.用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，它由有效量的权利要求1至12任何一项的单克隆抗体，外加转运分子，稀释剂或赋形剂组成。
33.根据权利要求32的药物组合物，其特征是应用权利要求1至12中任一项的单克隆抗体并将其用于治疗人类乳腺癌。
34.用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，其特征是它含有有效量的权利要求28和29的抗独特型单克隆抗体，附加转运蛋白，稀释剂或赋形剂。
35.如权利要求27获得的抗独特型mAb，其特征是它是一种特异性地与权利要求7至9mAb反应的互补位抗独特型mAb。
36.权利要求35的抗独特型mAb，它被命名为F2抗-idE1。
37.产生根据权利要求36mAb的杂交瘤。
38.用权利要求35和36抗独特型mAb免疫动物获得抗NeuACGM2神经节苷脂抗体反应的方法。
39.用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，其组成包括有效量的权利要求35和36抗独特型mAb，附加转运分子，稀释剂或赋形剂。
40.来源于权利要求1至12任何一项单克隆抗体的各种重链和轻链区的重组单克隆抗体。
41.具有产生Ab2和Ab1′抗体反应特征的人单克隆抗体。
42.与任何命名为A3、E1、F6、P3、B7抗-idE1和F2抗-idE1单克隆抗体各自抗原结合位点竞争的单克隆抗体。
43.权利要求41的单克隆抗体，它是人的或具有人特征的抗体。
全文摘要
本发明涉及的是具有高度特异性的抗神经节苷脂IgM单克隆抗体。
文档编号A61K39/395GK1145909SQ9511509
公开日1997年3月26日 申请日期1995年8月17日 优先权日1995年8月17日
发明者A·M·V·罗比兹, A·M·A·佛南道, R·P·劳里古, A·E·M·阿布拉哈姆, C·M·A·瓦卡瑟尔, M·E·L·鲁茨 申请人:分子免疫中心