专利名称：来自曲霉属融合产物中经加工的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的表达的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及铁结合糖蛋白和相关的多肽，即乳铁蛋白。更具体地，本发明涉及曲霉属，特别是泡盛曲霉，黑曲霉及米曲霉中各种乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的重组产物。
公开内容背景在共同未决的专利申请美国专利序列号08/145,681中，公开了人乳铁蛋白的cDNA序列。另外，在相同的共同未决的专利申请美国专利序列号08/145,681中，人乳铁蛋白的cDNA序列被用于在各种不同微生物，包括各种各样的真菌如酿酒酵母、构巢曲霉和米曲霉中生产人乳铁蛋白。现有技术的描述乳铁蛋白(LF)是一种发现于牛奶和其它分泌物及体液的铁结合糖蛋白。LF参予了哺乳动物中铁结合及转运。
LF最初在牛奶中发现，它在初乳中能够以达7克/升的水平分泌出来。自从最初发现以来，LF已在人和其它哺乳动物的分泌液中检测到。这些体液包括眼泪、唾液和粘膜分泌物以及在多形核白细胞的次生颗粒。
LF是一种具有二叶结构的78千道尔顿(kDa)的糖蛋白，在C和N端半部分有高度同源性，这在氨基酸序列和三维结构水平都是明显的。这些叶的每一个能可逆地具有高度的亲和性地结合一个三价铁，和伴随结合碳酸氢盐。乳铁蛋白的生物功能包括对微生物病原体制菌和杀菌作用，铁的转运，促进细胞生长，调节免疫细胞功能和炎症反应，以及调节骨髓细胞的生成。已发现去糖基化蛋白保留了天然LF的所有生物功能。
乳铁蛋白的杀菌功能域具有广谱抗微生物作用。Bellamy，W.M.等，J.App.Bact.73，472-479(1992)。尽管Bellamy等报道从牛奶分离的牛乳铁蛋白提供胃蛋白酶消化能提供商业量的牛多肽，但用于两个研究的材料的最大纯度有95％。Bellamy等未提供大量生产合成的人或牛乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽的资料。Bellamy等也没有讨论提供生产由酶消化不能得到的多肽的方法。
丝状真菌在胞外糖蛋白的工业生产中已被用作宿主。某些工业菌株能够分泌克量的这些蛋白。另外，丝状真菌能够正确地完成真核蛋白转录后修饰并且许多蛋白已获美国食品与药品管理局的批准。而且，可以得到大规模发酵技术和下游处理经验。然而，已有报道乳铁蛋白对某些真菌有毒(Valenti，等，FEMS Microbiology Letters，33271-275(1986)；Epstein，等，Reviews of Infectious Diseases，696-106(1984)；Soukka，等，FEMS Microbiology Letters，90223-228(1992))，因而工作者未广泛应用真菌，特别地对乳铁蛋白的生产。
在丝状真菌，特别地曲霉属中生产乳铁蛋白首先由本发明者报道(Ward，等，Gene，122219-223(1992)；Ward，等，Biotechnology，10784-789(1992)；Conneely等，重组人乳铁蛋白的生产，PCT/US 93/22348，国际申请号PCT/US93/03614，有1992年4月24日的优先权日并在93年11月出版；和Conneely等，美国序列号08/250,308，5/27/94提交，它是美国序列号07/873,304，04/24/92提交的延续申请，现放弃，所有这些在此以参考文献收入)。然而，虽然这些过程是显著的突破，但是它们在有效地生产商业性大量的乳铁蛋白的能力上仍有限制。
目前，除了生产乳铁蛋白多肽外，需要更有效和经济的方法生产人、牛或猪LF。因而，也有发展一种有效和商业化的方法的需要，用于生产营养和治疗应用的人乳铁蛋白和用于进一步研究其作用机制。通过用曲霉属宿主细胞结合新的载体构建以及特别是在曲霉属宿主细胞中生产乳铁蛋白的方法，提供乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的生产，本标题发明满足了这一需要，使它们能够生产商业量的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断。
发明概述本标题发明提供了用曲霉属宿主细胞结合新的质粒构建生产乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断。更特别地，本标题发明提供了能够在曲霉属宿主细胞中生产乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的新载体构建。更特别地，本标题发明提供了适宜与曲霉属，特别是泡盛曲霉、黑曲霉和米曲霉宿主细胞一起使用的新的质粒构建，使它们能生产大量的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断。
本标题发明也提供了新的表达质粒载体构建物，它使乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断能够生产。质粒载体构建含有两个重要的成分，它提供了如此高水平的要生产的乳铁蛋白。除了启动子、编码所选蛋白的cDNA、信号序列、转录终止序列和选择性标记外，质粒载体构建物还含有(a)其产物从曲霉属细胞分泌的高表达内源性基因的5′部分，和(b)连接序列，借此连接序列有一个它的内源性蛋白酶。该新的质粒载体构建物的产物是融合蛋白，包括融合到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的高表达基因的部分(ha1f)。此后该融合蛋白被对Kex2肽酶剪切位点优选专一的内源性蛋白酶加工。例如，如果使用来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶启动子，载体也应含有泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分。产生的乳铁蛋白融合到葡糖淀粉酶基因的部分，然后被对Kex2肽酶切割位点专一的内源性泡盛曲霉蛋白酶加工。另一个例子，如果使用来自黑曲霉的葡糖淀粉酶启动子，载体也应含有黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分。由载体构建物(LF融合到葡糖淀粉酶基因的部分)产生的融合产物然后用对Kex2肽酶切割位点专一的黑曲霉内源性蛋白酶加工，释放出期望的乳铁蛋白或LF多肽片断。而且，如果使用米曲霉细胞，载体构建应含有来自α-淀粉酶基因的米曲霉启动子和部分米曲霉α-淀粉酶基因。此载体可用于转化米曲霉细胞，融合产物(LF融合到α-淀粉酶基因的部分)可通过对Kex2肽酶切割位点专一的内源性米曲霉蛋白酶加工，产生所要的LF或LF多肽片断。
因而，本标题发明提供在任何曲霉菌株中生产商品量的LF或LF多肽片断的新载体质粒构建。
本标题发明的另一个实施方案包含下列可行地从5′连接到3′的成分，以形成表达质粒载体(a)一个启动子；(b)一个信号序列；(c)其产物从米曲霉细胞分泌的高表达内源基因(即葡糖淀粉酶基因)的5′部分；(d)一个连接序列；以及(e)对应于所期望的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列。
上面的(a)-(e)的DNA序列然后克隆到一起形成质粒。得到的表达质粒用于转化曲霉属细胞，它将表达融合到高表达的内源基因如葡糖淀粉酶基因基因的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断(对应于插入表达质粒的乳铁蛋白核苷酸序列)。LF或LF多肽片断通过对Kex2肽酶裂解位点特异的内源蛋白酶进行加工。
所要求的发明的另一个实施方案为产生乳铁蛋白的方法，它包括培养含有重组质粒的转化曲霉属真菌细胞，其中所说的质粒包含编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列，其中所说的转化曲霉属真菌细胞培养在合适的营养基质中直到乳铁蛋白作为一种融合产物形成并经Kex2肽酶裂解位点特异的内源蛋白酶加工，其中所说的加工的乳铁蛋白被分泌到营养基质中，并且其中所说的乳铁蛋白从营养液中分离或回收。
本发明被进一步规定，因为上面提到的质粒载体还包含启动子，信号序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，连结序列，转录终止序列和可选择标记基因。针对本发明的目的，“连结序列”和“蛋白水解酶识别序列”可被交互使用。
此表达载体被进一步规定，其中启动子选自乙醇脱氢酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和denA的基因，而且其中启动子被进一步限定来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
上述过程被进一步规定，其中所说的启动子来自葡糖淀粉酶基因，其中所说的启动子来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因，并且其中该信号序列来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶基因。此过程被进一步规定，其中上述信号序列还含有来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶5′部分。
上述过程还可规定，其中所说的启动子来自葡糖淀粉酶基因，其中所说的启动子来自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因，并且其中该信号序列来自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因。此过程被进一步规定，其中上述信号序列还含有来自黑曲霉的葡糖淀粉酶5′部分。
上述过程还可进一步规定，其中所说的启动子来自α-淀粉酶基因，其中所说的启动子来自米曲霉的α-淀粉酶基因，并且其中对应于信号序列的cDNA序列来自米曲霉的α-淀粉酶基因。此过程被进一步规定，其中上述信号序列还含有来自米曲霉的α-淀粉酶5′部分。
上述过程被进一步规定，其中连结序列为肽酶识别序列，本发明还进一步规定其中连结序列编码Kex2肽酶识别序列。针对本发明的目的Kex2肽酶识别序列和Kex2肽酶裂解位点是相同的。
上述过程被进一步规定其中转录终止序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶和benA基因。本发明还进一步规定，因为转录终止序列来自葡糖淀粉酶基因并且其中转录终止序列来自黑曲霉的葡糖淀粉酶基因。
上述过程被进一步规定其中可选择的标记基因选自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC和福来霉素抗性基因。该过程被进一步规定，因为可选择标记来自福来霉素抗性基因。
本发明还规定其中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断为人，猪或牛乳铁蛋白。本发明还规定其中任何乳铁蛋白产物已被去糖基化。
本发明的另一个实施方案是基本上由编码人乳铁蛋白氨基酸的DNA和在细胞中表达该DNA的质粒载体组成的质粒，其中所说的质粒用于在泡盛曲霉真菌细胞中表达人乳铁蛋白的DNA。一种特别优选的质粒规定为具有ATCC登记号74290的特征并命名为Awa LF24-1的质粒，其中Awa LF24-1是用含有编码人乳铁蛋白DNA的pPLF-19表达质粒转化的泡盛曲霉，即美国系列号08/145,681的SEQ.I.D.Listing No.1，美国系列号08/145,681在此引入作为参考。本发明的另一个实施方案是含有上述质粒的泡盛曲霉真菌细胞。
本发明的具体实施方案是包含培养含有重组质粒的转化泡盛曲霉，黑曲霉和米曲霉的真菌细胞，其中所说的质粒包含一种质粒载体含有(a)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一个启动子；(b)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一个信号序列；(c)高表达内源基因的5′部分，如泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因；(d)编码Kex2肽酶裂解部位的连接序列；(e)编码人乳铁蛋白氨基酸的DNA；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择标记基因；其中所说的转化泡盛曲霉，黑曲霉和米曲霉真菌细胞培养在合适的营养液中直到乳铁蛋白作为融合产物形成，然后被对Kex2肽酶裂解位点专一的内源蛋白酶加工，其中所说的乳铁蛋白是编码人LF氨基酸序列的cDNA的产物，其中乳铁蛋白被分泌到营养液中并从中分离。针对本发明的目的，“Kex2肽酶裂解位点”和“Kex2肽酶识别序列”可交互使用。
本发明的另一个实施方案是从真菌培养液中分离乳铁蛋白的方法，包括培养含有重组质粒载体的转化曲霉属真菌细胞，其中所说的质粒载体包含启动子，信号序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，连结序列，编码人乳铁蛋白氨基酸的DNA，转录终止序列和可选择标记基因，其中所说的转化曲霉属真菌细胞培养在合适的营养液中直到乳铁蛋白作为融合产物形成，然后被内源蛋白酶加工，其中乳铁蛋白被分泌到营养液中并从中分离。
上述从真菌营养液中分离乳铁蛋白的方法被进一步规定其中质粒载体含有来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子，泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列，葡糖淀粉酶基因的5′部分，编码Kex2肽酶裂解位点的连结序列，黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列和福来霉素抗性可选择标记基因。
本发明的另一个实施方案是包含将下列成分从5′到3′连结的新的重组表达质粒载体1)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一个启动子；2)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的一个信号序列；3)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因5′部分；4)编码Kex2肽酶裂解部位的连接序列；5)编码人乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断氨基酸的核苷酸序列；6)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和7)福来霉素抗性可选择标记基因；本发明还包含人，牛或猪乳铁蛋白cDNA的完全及部分序列，替代类似物或其等位变异的产生，它编码与部分乳铁蛋白具有同源性的生物活性多肽，特别是那些不能从天然乳铁蛋白酶消化获得的，用表达部分cDNA序列制造多肽的方法和通过本发明的方法生产多肽产物。目的部分序列可通过限制酶裂解产生，如在图13，14和15中表示的裂解位点。图13到15分别显示人，牛和猪LF cDNA序列的限制性酶切位点。该部分序列还可以合成，通过PCR扩增，裂解、连结与合成的组合，或本领域技术人员已知的其它方法来获得。
猪(Lydon，J.P.，等，Biochem.biophysic.ACTA，113297-99(1992)；A1exander，L.J.，等，Animal Genetics，23251-256(1992))和牛(Mead，P.E.，等，Nucleic Acids Research，187167(1990)；Pierce，A.等，Eur.J.Biochem.，196177-184(1991))乳铁蛋白的cDNA序列已被确定并在文献中报道。含有牛和猪乳铁蛋白的cDNA序列的参考文献在此引入本专利申请作为参考。
来自乳铁蛋白的多肽片断已知为生物活性的并可以通过本发明的方法产生。人乳铁蛋白片断的N-端包括从完整hLF胃蛋白酶消化物分离的hLF杀菌结构域。Bellamy，W.M.等，Biochem.Biophys.ACTA，1121130-136(1992)。合成的23和25氨基酸多肽已被合成并发现具有与胃蛋白酶消化得到的片断相似的活性。合成细节，产率和合成肽的纯度没有报道。Bellamy等没有提供不含有由于天然产物分离所至污染的牛或人乳铁蛋白多肽大规模生产的实际路线。这些多肽片断可通过本发明的方法生产，并形成其优选实施方案。
下列公开的氨基酸序列和相应的cDNA序列在此插入作为参考(a)Powell，et al.，Nucleic Acids Research，18(13)4013(1990；mammary)；(b)Rey，et al.，Nucleic Acids Research，18(17)5288(1990；mammary)；(c)Rado，et al.，Blood，70(4)989-993(1987；neutrophil)；(d)Stowell，et al.，Biochem.J.，276349-355(1991)；(e)Panella，et al.，Cancer Research，513037-3043(1991；mammary)；and(f)Johnston，et al.，Blood，79(11)2998-3006(1992；leukemic).
这些序列的任何一个或其修饰形式可用于本发明的方法中，优选序列为具有被本发明者报告给GenBank的多肽序列并具有登记号A31000，它们全部在此引入作为参考。
附图简述因而获得上面特点，优点和本发明目的叙述的方式以及会变清楚的其它方面，并可被详细了解，上面简要概括的本发明更特别的描述可通过参考在附图中说明的某些实施方案获得。这些图构成本说明书的一部分。
然而要指出这些
本发明优选的实施方案，因此不被认为限制其范围。此发明可以承认其它等同效能的等效实施方案。
图1表示含有用于在泡盛曲霉中表达的hLF cDNA、命名为“pPLF-19”的质粒载体的构建。图中使用的缩写如下Apr氨苄青霉素抗性；hLF人乳铁蛋白；GA葡糖淀粉酶基因；pGA来自葡糖淀粉酶基因的启动子；GA 3′UTR葡糖淀粉酶基因3′非翻译区；s.s.信号序列；phleo r福来霉素基因抗性。实施例4详述此载体的构建。
图2为从含有pPLF-19的泡盛曲霉转化株培养基中纯化的重组hLF(100ng)的SDS-PAGE。
图3为从含有pPLF-19的泡盛曲霉转化株培养基中纯化的糖基化(1μg)和去糖基化重组hLF(1μg)的Western印记杂交。
图4描述泡盛曲霉中重组产生的hLF起始10个氨基酸N-末端测序的结果。
图5描述标准和重组hLF铁离子结合和饱和研究的结果。
图6描述铁离子结合于标准和重组hLF的pH稳定性的比较结果。
图7描述天然和重组hLF对大肠杆菌0111的抗菌作用。
图8描述天然和重组hLF对弗氏志贺菌抗菌作用研究得到的结果。
图9描述在杀灭时间研究中天然和重组hLF对福氏志贺菌抗菌作用的结果。
图10-A和图10-B概括通用的泡盛曲霉表达穿梭载体pPLF-26的设计，中间体和构建。注意不是所有的限制性位点在这些图中表示出来。
图11表示含有用于克隆的单一Not1和EcoRI的通用穿梭载体pPLF-26的详细说明。
图12描述用各种限制性酶消化pPLF-26和pPLF-19以确认单一Not1和EcoRI位点的存在和质粒方向性的结果。
图13表示人LF cDNA序列限制性酶切位点。
图14表示牛LF cDNA序列限制性酶切位点。
图15表示猪LF cDNA序列限制性酶切位点。
图16A表示米曲霉中产生的重组hLF的Western免疫印记分析。
图16B表示与图16A一式二份样品的银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析。
图16C表示米曲霉中产生的重组hLF N-末端氨基酸序列。
发明详述定义为了标题申请的目的下列术语被定义以更好地了解本发明。
术语“转铁蛋白家族”指铁结合蛋白家族，包括血清转铁蛋白，卵转铁蛋白(ovotransferrin)和乳铁蛋白。这些蛋白都是结构上相关的。
术语“乳铁蛋白”指转铁蛋白家族的一个成员，发现它在乳汁和其它分泌物中。乳铁蛋白是一个78kb铁结合蛋白。
此外术语“结构域”被用于限定乳铁蛋白的功能片断或包括影响如铁结合，杀菌特性，受体结合和免疫刺激等特异功能分子元件的全部或部分的乳铁蛋白多肽。
术语“多肽”指几个氨基酸连结在一起形成一个小肽或多肽。
术语“替代类似物”或“等位变异”或者“等位突变体”均指决定乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽一个或多个氨基酸的一个或多个密码子被由不同DNA序列决定相同氨基酸序列的其它密码子替代的DNA序列。这里“替代类似物”或“等位突变体”指一种蛋白或多肽，意思是少量的通常5个或更少氨基酸替代在人或其它哺乳动物蛋白中已知发生的等位变异，在此保留了该蛋白的生物活性。已报道在几个公开的hLF cDNAs序列中的氨基酸替代，它们最可能由于等位突变。见图16，和此图相关的讨论。
术语“载体”指质粒，粘粒，噬菌体或其它任何使乳铁蛋白cDNA插入，增殖和表达的载体。
术语“宿主”指允许乳铁蛋白表达的任何细胞。
术语“启动子”指控制乳铁蛋白cDNA转录的调节DNA序列。
术语“多克隆盒”指含有多种酶的单一限制性酶切位点的DNA片断，以插入各种cDNAs。
术语“转化”指允许细胞中异源DNA序列表达的插入。
术语“铁离子结合量”指结合铁的能力。完整功能的人乳铁蛋白每分子LF可结合两个铁原子。
术语“生物活性或生物学上活性的”指乳铁蛋白通过测量其结合铁离子，杀灭微生物，阻止微生物的生长，起铁转运蛋白的作用，与特异受体结合，刺激免疫应答或调节髓细胞生成的能力确定的功能学活性。
本发明中有用的启动子可以是允许调节乳铁蛋白cDNA转录的任何启动子。优选的，该启动子选自乙醇脱氢酶，α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因。因而，本领域技术人员已知许多不同的启动子，但本发明优选使用从泡盛曲霉中分离的葡糖淀粉酶启动子。
本领域技术人员已知许多不同的信号序列以及这些信号序列的来源，但本发明者优选使用泡盛曲霉葡糖淀粉酶信号序列加来自葡糖淀粉酶基因的5′部分。
在本方法中有用的信号序列可以任意含有翻译起始密码子和带有部分高表达内源基因编码区的分泌信号。
本方法中有用的连结序列含有任何蛋白水解酶的识别序列，优选Kex2肽酶识别序列。
本方法中有用的转录终止序列可以是任何稳定化和校正乳铁蛋白mRNA转录终止的序列。该转录终止序列优选来自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶或benA基因。因此本领域技术人员已知许多不同的转录终止序列，但本发明者优选使用来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非翻译区。
在本发明的方法中，有用的可选择标记基因可为任何使用乳铁蛋白cDNA质粒转化的细胞分离的基因。该可选择标记基因优选自pyr4，pyrG，argB，trpC，amdS或福来霉素抗性基因。因此本领域技术人员已知许多不同的可选择标记，但本发明者优选使用福来霉素抗性基因。
此外，在优选实施方案中已描述乳铁蛋白的重组产生。LF可在几种来源生产细胞来源如曲霉属，酿酒酵母，Kluyveromyces lactis，或Pichia pastorsis；昆虫细胞如SF9；和哺乳动物细胞如Cos细胞。
本发明中有用的细胞，优选真核细胞是任何允许整合载体的细胞，优选包含乳铁蛋白cDNA的质粒并表达乳铁蛋白cDNA。真核细胞优选丝状真菌细胞或昆虫细胞。昆虫细胞例如SF9在本发明的方法中是有用的。该细胞更优选真菌曲霉属细胞。本发明中有用的真核细胞最优选曲霉属菌株，如米曲霉，黑曲霉，构巢曲霉和泡盛曲霉。
编码hLF cDNA序列的确定和推导的氨基酸以被多种确认方法证明。
它们是1.多重序列分析2.从用抗hLF抗体确切鉴定的cDNA转录和翻译hLF蛋白。
编码hLF的cDNA序列可用于准备重组人乳铁蛋白，因而可以得到用于治疗和营养用途的蛋白来源。确认的cDNA序列可用于合适的克隆载体以复制该cDNA序列。该cDNA也可以插入用于人乳铁蛋白生产的载体系统。其它乳铁蛋白DNA序列可替换人乳铁蛋白cDNA序列以提供牛，猪，马或其它乳铁蛋白。部分cDNA序列还可用来得到所期望的来自乳铁蛋白的多肽。本发明的表达系统可用于提供来自乳铁蛋白的多肽，它们不能通过用酶消化天然产生乳铁蛋白得到。本标题发明还提供在曲霉属细胞中产生乳铁蛋白和乳铁蛋白相关多肽的表达系统。本发明允许乳铁蛋白的生产，它不含有乳过氧化物酶，溶菌酶或其它从牛奶或其它天然来源分离的乳铁蛋白污染物的其它蛋白质。本发明不限于人cDNA序列的任何具体用途或从合适的DNA序列产生其它种类乳铁蛋白。
从重组技术得到的重组LF蛋白可用于多种用途。人类基因可被转到哺乳动物系统，如奶牛和其它农业上重要的动物并在乳汁中表达。乳铁蛋白基因的插入以及在动物乳汁中的表达可以抵抗小猪中典型的铁缺陷。带有表达的乳铁蛋白基因包含体能够改善动物抵抗细菌和病毒感染疾病。人乳铁蛋白的组织特异性表达，如在乳腺中，可以对用这种奶喂养的幼体给予表达基因的抗菌和抗病毒优点，并可能提供用于治疗的分泌蛋白生产方法。
用标题发明重组方法产生的LF可用于各种产品，包括人或动物食物，作为治疗添加剂以增强铁的运输和传递，其杀病毒和杀菌特性可作为添加剂用于眼药水，接触晶状体和眼睛护理液，局部皮肤保护产品，滴耳液，漱口剂，口香糖和牙膏。重组LF可以提供安全的天然产生的产物，它们可局部应用并且安全吸收。抗菌乳铁蛋白多肽在上述产品中作为预防药以及作为治疗的抗感染药都是有用的。结合铁的多肽对作为营养和治疗用途的铁或其它金属离子载体，以及作为抑菌剂和杀菌剂都是有用的，特别是在上述类型的产品中。每种蛋白还可用作营养补充并可作为氨基酸和金属的来源。
用于产生重组人乳铁蛋白的质粒表达载体不同成分在下面列出，并且不以任何形式作为本发明的限制。本领域技术人员已知许多不同的启动子，但发明者优选使用从泡盛曲霉中分离的葡糖淀粉酶启动子。本领域技术人员已知许多不同的信号序列和这些信号序列的来源，但发明者喜欢用来自泡盛曲霉的葡糖淀粉酶信号序列加葡糖淀粉酶基因的5′部分。本领域技术人员已知许多不同的连结序列，但发明者优选使用编码Kex2肽酶裂解位点的合成连结。本领域技术人员已知许多不同的转录终止序列，但发明者优选使用黑曲霉葡糖淀粉酶基因的3′非翻译区。本领域技术人员已知许多不同的可选择标记，但发明者优选使用福来霉素抗性基因。
本领域的一般技术人员都知道并认可各种不同的参数，它们可以改变还不影响通过权利要求发明产生的乳铁蛋白的数量或质量。下面列出可以改变但不影响产生乳铁蛋白的数量和质量的这些参数温度；pH；所需营养；扩大规模考虑；使用装置的类型；使用的氧气/空气比例；搅拌；相对于稳定系统的搅拌系统的应用；收获时间等。
不同的的生长和产生条件可用于泡盛曲霉中重组人乳铁蛋白的表达。为了解释不同的条件而给出下列描述，这些不同的条件可用于hLF在泡盛曲霉中的表达，并不意味着以任何方式限制本发明。下面给出的是发酵生产过程以及用于回收产生的乳铁蛋白过程的总的概括。本领域任何一位普通的技术人员知道该方法可以改变或稍加修改以增加目的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽的产量。
为了解释本发明的不同实施方案给出下列实施例，它们并不意味以任何方式限制本发明。
实施例1用于在泡盛曲霉中表达重组人乳铁蛋白的表达载体pPLF-19的构建本实施例说明用于在泡盛曲霉中表达重组人乳铁蛋白的表达载体的构建。
I.菌株，质粒，酶和培养基A.细菌和真菌菌株泡盛曲霉菌株ATCC 22342被用作对人乳铁蛋白异源表达的宿主菌株。大肠杆菌菌株DH5α用于人乳铁蛋白表达载体，pPLF-19的构建。
B.质粒质粒pUC19和pGEM4(Promega，Madison，WI)用于各种导致最终人乳铁蛋白表达质粒pPLF-19构建的克隆步骤。
由质粒pUT713(CAYLA，Toulouse-Cedex，FR)衍生含有偶联到酵母细胞色素C1终止子上的福来霉素抗性基因(一种链异壁菌的福来霉素结合蛋白基因)的福来霉素抗性载体，pLO-3，。它在真菌中通过黑曲霉的β-微管蛋白启动子表达。
C.酶限制酶从新英格兰Biolabs(Beverly，MA)获得。T4连接酶，T4激酶，以及大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片断购自Bethesda研究实验室(BRL，Gaithersburg，MD)。绿豆核酸酶从Stratagene(La Jolla，CA)获得。Taq聚合酶从Promega公司(Madison，WI)获得。质粒构建的DNA序列用序列酶版本2.0 T7 DNA聚合酶及试剂盒(美国生物化学，Cleveland，OH)完成。Novozym 234，一种原生质球酶购自NovoBioLabs(Bagsvaerd，Denmark)。
D.普通培养基大肠杆菌菌株在L-肉汤(Difco，Detroit，MI)中培养。细菌转化体在含有1.5％琼脂和125μg/ml氨苄青霉素的L-肉汤平板上培养。用于泡盛曲霉在溶液中培养的完全培养基(CM)含有50ml20×Clutterbuck盐(120g Na2NO3，10.4g KCl，10.4g MgSO4·H2O，30.4g KH2PO4)，2.0mlVogel微量元素(0.3M柠檬酸，0.2M ZnSO4，25mMFe(NH4)2(SO4)2·6H2O，10mM CuSO4，3mMSO42-，8mM硼酸，2mMNa2MoO4·2H2O)，5.0g胰化蛋白胨，5.0g酵母提取液，10g葡萄糖溶于一升蒸馏水中。对CM斜面加入1.5％琼脂。PDA斜面含有39.0g/L溶于水的马铃薯葡萄糖琼脂(Difco，Detroit，MI)，10.0g/L葡萄糖，10.0g/L琼脂，0.1g/L MgSO4·H2O，0.12g/L KH2PO4，0.25g/LNH4H2PO4。
泡盛曲霉产生乳铁蛋白的转化株培养于KT-4培养基150g/L麦芽糖，60g/L soyfine豆奶LF，79.8g/L C6H5O7Na3·H2O，15g/L(NH4)2SO4，1.0g/L NaH2PO4，2.05g/L MgSO4·H2O，1.0ml/L吐温80，2.0ml/L消泡204；Dunn-Coleman等，1991，Bio/technology9976-981。
E.ATCC细胞保藏按照专利程序的关于微生物保藏国际认可的布达佩斯协议条款，下列转化菌株由申请人在1994年7月8日保藏于美国典型培养物保藏中心(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD.20852)。“Awa LF 24-1”是用含有编码人乳铁蛋白cDNA的表达质粒pPLF-19转化的泡盛曲霉。其ATCC保藏号是74290。申请者还同意使这种保藏物为公众可得，当这一申请在美国得到专利批准时，对于负责任的第三者不加限制，并遵守相关法律和法规，除了就坚持本申请产生的专利权利要求所描述的申请人的权利的第三者之外，不加限制。
II.方法A.人乳铁蛋白表达质粒的构建下列质粒作为最终表达质粒pPLF-19的前身构建。pPLF-19构建图显示于图1。在此图中使用的缩写为Apr氨苄青霉素抗性；hlf人乳铁蛋白；GA葡糖淀粉酶；pGA来自葡糖淀粉酶的启动子；GA 3′UTR葡糖淀粉酶3′非翻译区；s.s.信号序列；phleo r福来霉素抗性载体。
pPLF-1hlF cDNA从pGEM4hlFc中以2.3kb Sacl/HindIII片断取出并亚克隆到载体pUC-19中。制备此亚克隆是为了从含有不所期望的NgoMI位点的pGEM4骨架中取出cDNA。
pPLF-2修饰hlF的5′末端以引入单一NgoMI位点，它可以用于无缝加入葡糖淀粉酶(GA)启动子和信号序列。通过跨越成熟乳铁蛋白编码序列的5′末端到单一AccI位点的270bp片断的PCR扩增来进行修饰。引物列于下面并分别示于SEQ.ID.No.1和2。
KpnI NgoMI5hLFFW 5′-G GGG TAC CGC GCC GGC CGT AGG AGA AGG AGT GGly Arg Arg Arg Arg Ser(成熟hLF N-端)AccI5hLFRV 5′-TTCGGTCCCGTAGACTTCCGCCGCT此270bp片断用Promega的Taq聚合酶按下列条件扩增1.25到5mM MgCl2；每种引物(5hlFFW和5hlFRV)0.5μM；10ng pGEM4hlFc作为模板。在Perkin Elmwr 9600热循环仪上循环1@2分钟，96℃；30@20秒，96℃/20秒，55℃/20秒72℃；1@5分钟，72℃。
片断从琼脂糖分离，用酶钝端化，磷酸化并亚克隆到用SmaI剪切的pUC19中给出pPUC270。扩增产物的序列用M13通用正向和反向引物来证实。该片断然后从pPUC270作为kpnIAccI取出并用于取代pPLF-1的kpn/AccI片断。生成的质粒指定为pPLF-2。
pPLF-6携带hLF最后的17bp和GA 3′非翻译区(UTR)160bp的280bpEcoRI/PstI片断从载体pAhLFG(+1)亚克隆进EcoRI/PstI剪切的pUC19。
pPLF-7pPLF-2修饰的hLF基因作为EcoRI片断亚克隆进载体pPLF-6。正确取向的质粒(pPLF-7)含有紧靠上游单一NgoMI位点和紧靠下游GA3′UTR的160bp的全长成熟hLF序列。GA启动子和信号序列(见下面)将加入到此载体中。
GA启动子和信号序列从由泡盛曲霉菌株ATCCC22342分离的基因组DNA通过PCR扩增获得。正向引物跨越GA信号序列的大约1.1kb上游的SacI位点。该引物序列根据ATCC 10864(GenBank登记号X56442)公布的序列设计并分别示于SEQ.ID.No.3和4中。15 GAFW5′-TATGCAGAGGAGCTCTCCCCTGACSacI反向引物插入一个NgoMI位点用于连接到hLF上。
NgoMIGARV5′-GAT TCC GCC GGC CAA CCC TGT GCA GAC GAG GC← Ala Leu Gly Thr Cys Val Leu ←正确大小的片断(1.1kb)从ATCC 22342基因组DNA扩增，采用下列条件2.5mM MgCl2；每个引物0.5μM(GAFW和GARV)以及100ng基因组DNA。循环参数设定在1@2分钟，95℃；30@30秒，95℃/30秒，60℃/45秒，72℃；和1@5分钟，72℃。
扩增产物被钝端化，磷酸化并亚克隆到用SmaI剪切的pUC-19中。DNA序列从扩增片断的3′端产生以检查跨越GA信号序列区扩增的保真性。带有核实序列的克隆用作GA启动子和s.s.片断的储备源。
pPLF-9PCR扩增的GA启动子和信号序列作为SacI/NgoMI片断被连接到载体pPLF-7上给出载体pPLF-9。在一个方向由连接产生的序列实现了净连接。
pPLF-18最终GA表达质粒含有GA启动子、信号序列以及编码融合到hLF的葡糖淀粉酶原498aa的序列。在GA和hLF序列之间对终止于双碱性KEX-2识别序列Lys-Arg的葡糖淀粉酶的六肽原改造。嵌合蛋白大概会被内源性GA分泌通路更好地识别导致高分泌滴度的hLF。KEX-2连接臂应允许从GA中准确的加工hLF。
pPLF9首先用NgoMI剪切。采用Klenow片断用dCTP添平末端。然后用绿豆核酸酶除去残留5′突出端，给出平头以准备进行符合读框的蛋白融合。载体然后用NsiI切割以接受如下所述PCR扩增的GA序列。
从菌株ATCC 22342PCR扩增编码期望的GA片断的片断，其中分别用显示于SEQ.ID.No.5，6和7的下述引物组合。GA-15′-GAATTCAAGCTAGATGCT该正向引物跨越公布的ATCC 22343(NRRL 3112)GA上游序列(Nunberg等，Mol.Cell.Bio.1984，p2306-2315)的碱基1-18。此序列位于用于构建的单一NstI位点的上游区大约50bp处。
Ser Val Thr Ser Thr Ser Lys Asn Val Ile Ser5′-AGC GTG ACC TCG ACC AGC AAG AAT GTG ATT TCCAAG CGCLys ArgKX2GA 3′-TCG CAC TGG AGC TGG TCG TTC TTA CAC TAA AGGTTC GCG-5′
此反向引物序列与插入的六肽原(下划线者)编码序列互补，紧接着编码为492-498的GA原序列的互补序列。
2.0kb片断用Taq聚合酶PCR扩增。根据经验确定2.5mMMgCl2给出最好的扩增。片断经酶用Klenow钝端化以除掉潜在从扩增剩余的不规则末端。该平头片断然后用NsiI剪切，并作为NsiI/平头片断亚克隆到处理的载体pPLF-18(见上面)给出质粒pPLF-18。序列通过GA/KEX-2/hLF连接用双脱氧测序来检验。
pPLF-19来自CAYLA载体pUT713(链异壁菌ble基因)并从黑曲霉微管蛋白启动子(pPLO-3)表达的福来霉素抗性标记作为2.3kb HindIII片断被加入到pPLF-18中给出最终表达质粒pPLF-19。
B. 盛曲霉菌株ATCC 22342的DNA转化用Tilburn等，1983，Gene 26205-221修饰的方法对泡盛曲霉菌株ATCC 22342原生质球化和转化。30℃在完全培养基(CM)斜面上培养4到7天的泡盛曲霉ATCC 22342的Conidating培养物用2mlsNP40水(0.005％Nonidet-40)刮下，获得芽孢悬浮液。1ml此芽孢悬浮液(约1×108芽孢)加入到50mlsCM中并在30℃，200rpm培养22小时。通过双层干酪包布过滤收集菌丝，并加入到含有5mg/ml Novozym 234(Novo Biolabs，bagsvaerd，Denmark)的50mlsKCM缓冲液(Cantoral等，1987，Biotechnology 5494-497；KCM0.7M KCl，10mM MOPS，pH5.8)中，30℃，90rpm温育过夜使原生质球生成。
通过填有miracloth(Calbiochem；La jolla，GA)的漏斗过滤收获原生质球，并用干酪包布覆盖装入四个15ml圆锥性离心管，然后在台式离心机上1800rpm旋转10分钟。粒状沉淀小心地重悬于总体积15mls的KCM缓冲液中再离心。粒状沉淀再在15mlsKCM缓冲液中洗涤，然后重悬在KCMC(KCM+50mM CaCl2)缓冲液中至最终密度5×107细胞/ml。
20μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中的5μgspPLF19加入到200μl原生质球中，50μl PCM(Cantoral等；PCM40％PEG 8000，10mM MOPS，pH5.8，50mM CaCl2[CaCl2用前加入])小心地移入DNA-原生质球混合液中并在冰上温育30分钟。
1ml新鲜准备的PCM加入到转化混合液中，该混合液移入到50mls冷至50℃并分成5块培养板的再生琼脂(CM+1.3M甘露糖醇，3％琼脂)上。用等量的OL+120μg/ml福来霉素(OL1％胨，1％琼脂；福来霉素[CAYLA；Toulouse，FR])覆盖前，让原生质球在30℃再生3到5小时。推定的转化体转移到含125-150μg/ml福来霉素的PDA斜面上。
C.在泡盛曲霉中人乳铁蛋白表达的发酵条件来自推定的产生HLF转化体的芽孢从选择性PDA斜面转移到CM斜面上，并在30℃培养4天。用1.5ml NP40水刮此斜面收获分生孢子，等份的1×108芽孢加入到250ml培养瓶中的30ml KT-4中。培养物在30℃200rpm发酵6天。在3000rpm离心1ml的发酵肉汤15分钟，收集乳铁蛋白样品并测定保留的上清液。
D.人乳铁蛋白测定通过修饰由Vilja等，1985，J.of Imm.Methods 7673-83发展的非竞争性亲和素-生物素免疫测定，定量乳铁蛋白。96孔微量滴定板(U型Microtest III；Baxter，Chicago，IL)用在涂层缓冲液(0.1M碳酸钠/碳酸氢钠，pH9.6)中的100μg/ml兔抗人乳铁蛋白抗体(Sigma，St.Louis，MO.)涂层，并在4℃振荡过夜。
第二天，除去涂层溶液，平板用洗涤缓冲液(1×PBS pH7.4，0.5％吐温20)洗三次，之后用250μl稀释缓冲液(1×PBS pH7.4，1％BSA[组分V，RIA级，美国Biochemicals，Cleveland，OH]，0.05％吐温20)在室温封闭至少1小时。弃去稀释缓冲液，加入平板100μl稀释的发酵样品和已知的乳铁蛋白标准，然后在37℃温育1小时。在加入到微量滴定板之前，从发酵样品收集的上清液用稀释缓冲液1∶1000稀释。含有人乳铁蛋白(Sigma，St.Louis，MO.)的乳铁蛋白标准在稀释缓冲液中以1到1000ng/ml稀释。
在37℃反应后，样品被弃去，平板用洗涤缓冲液洗三次。在稀释缓冲液中从1mg/ml储备液按1∶7500稀释的100μl生物素化的抗HLF抗体(生物素-SR-兔抗HLF IgG，Jackson Immuno-Research Labs)加入到每一个孔中并在37℃温育1小时。
弃去该溶液，在加入100μlABC试剂(Vectastain ABC试剂盒，Vector Labs，Burlingame，GA)前用洗涤缓冲液洗三次平板并在37℃温育平板1小时。Vectastain试剂在混合两种溶液前用稀释缓冲液按A1∶200稀释，试剂B1∶400稀释，使用前让它们在室温预温育1小时。
弃去该ABC溶液，用洗涤缓冲液洗平板5次。加入100μl OPD底物溶液(10ml底物缓冲液[25mM柠檬酸，50mM Na2HPO47H2O，pH5.0]，8mg邻苯二胺[Bethesda Research Labs，Gaithersburg，MD]，100μl 30％H2O2[Sigma，St.Louis，MO])，平板在暗处室温温和搅动温育20分钟。至颜色出现后，加入100μl 2M H2SO4停止反应。然后在490nm读取平板，通过与已知标准比较，测定乳铁蛋白的浓度。
实施例2hLF(pPLF-19)在泡盛曲霉中的表达和加工人乳铁蛋白表达盒pPLF-19转化进入泡盛曲霉22342时，在培养基中分泌的乳铁蛋白通过ELISA试验及Western blot分析测定。一个转化体，#19-254，产生大约250mg/ml的人乳铁蛋白(hLF)。更优选的转化体，Awa LF 24-1(ATCC登记号74290；#19-24.1)产生大约500mg/ml的人乳铁蛋白。改善产量的实验以及菌株的研制正在进行，以增加泡盛曲霉中重组体hLF的总产量。至今，本发明者在含有菌株Awa LF 24-1的泡盛曲霉转化体中已经获得滴定度＞900mg/l的hLF。结果示于在下面比较的总产量表中。
由于pPLF-19表达产物是嵌合蛋白，由葡糖淀粉酶的498个氨基酸组成并且hLF的完全编码区域被KEX-2断裂切割位点分开，所以进行SDS-PAGE，银染色法，Western blot分析和N-末端测序以确定该蛋白是否正确地加工。
A.从泡盛曲霉转化体纯化的重组体人乳铁蛋白银染色SDS-聚丙烯酰胺凝胶分析重组体人乳铁蛋白从泡盛曲霉转化体的生长培养基中用CM-Sephadex C50(Stowell，K.M.等，Biochem.J.，276349-355)离子交换色谱纯化。标准人乳奶LF(Std hLF)和纯化的重组体hLF(Rec hLF)在7.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离并银染色。此分析结果示于图2。重组hLF蛋白以已加工hLF(泳道2)的预期大小迁移，而且与标准hLF(泳道1)的大小相同。分子量标记的位置在左边指示。
B.从泡盛曲霉转化体纯化的糖基化和去糖基化重组体人乳铁蛋白的Western BIot分析从泡盛曲霉转化体生长培养基中纯化的重组体人乳铁蛋白，未用N-糖基化酶F处理和用N-糖基化酶F处理，都用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转移到硝基纤维素膜上并用对人乳铁蛋白特异的IgG(Sigma)探测。此分析结果示于图3。比较未处理的转化体hLF和未处理的标准乳奶说明这两个蛋白共迁移(图3，分别为泳道3和1)。N-糖基化酶F水解葡基氨连接产生小分子量的糖自由肽。比较用N-糖基化酶F处理后重组体hLF和标准hLF说明，两个蛋白同样迁移示意两个蛋白相似地N-连接到糖上(图3，分别为泳道4和2)。
实施例3N-末端序列分析证实重组体人乳铁蛋白在泡盛曲霉中是正确加工的为了证实在泡盛曲霉中产生的重组体hLF是正确加工的，测序重组产生hLF的N-末端部分。首先，重组hLF在泡盛曲霉中以黑曲霉葡糖淀粉酶基因(498AA)的催化区域的融合蛋白表达，它由编码Kex-2蛋白裂解位点的合成接头分开。其次，用CM-sephadex C50从生长培养基中纯化出重组体hLF(在先由Stowell等描述，Biochem.j.，276；349-59(1991))。为测定重组体hLF在其N-末端是否正确地被加工，用自动Edman降解方法测序纯化蛋白开始的10个N-末端氨基酸(5μg)。此分析的结果概括于图4。重组体蛋白的序列与人乳奶乳铁蛋白中相应的氨基酸相同。所以，重组体hLF在泡盛曲霉的KEX-2蛋白酶剪切位点正确地被加工。
实施例4在泡盛曲霉中产生的人乳铁蛋白的功能分析A.标准和重组体hLF的铁结合及饱和乳铁蛋白是一种具有每摩尔LF结合两摩尔铁能力的铁构建糖蛋白。为测定铁被重组体乳铁蛋白的结合是可饱和的，进行了铁结合测定。为了产生脱铁-乳铁蛋白，纯化的Rec hLF和人乳奶用0.1M柠檬酸，pH2.0透析，随后用水彻底透析。用5mM磷酸钠把溶液的pH慢慢升至pH7.6。增加浓度(从过量0.5到4.0摩尔)的FeCl3∶59FeCl3∶NTA(400∶1∶8)加入到hLF(500μg)的1ml结合缓冲液(0.025M Tris，pH7.8；0.01M碳酸氢钠；0.1M NaCl)中。样品在室温温育30分钟。过一先用15ml结合缓冲液平衡的NAP-10柱把铁结合hLF从未结合的铁和NTA中分出来。用液体闪烁计数定量铁结合到LF上的量。该分析结果概括于图5中。重组体和标准hLF以相似的方式结合铁。铁的这种结合是剂量依赖的。此外，铁被标准和重组体hLF的结合在铁与乳铁蛋白2∶1摩尔比时可饱和。典型地，饱和水平达92.5％最大结合。这表示最初的7.5％铁透析后仍结合到乳铁蛋白上。为了本发明的目的，“标准hLF”或“天然hLF”是从人乳奶分离或从Sigma购买的人乳铁蛋白。
B.结合到标准和重组体hLF铁的pH稳定性为了测定结合到标准和重组体hLF铁的pH稳定性，59Fe-饱和的标准和重组体hLF(500μg)用从pH7.0到pH2.0范围的缓冲液在4℃透析48小时，除去为结合的铁(Stowell等；biochem.J.，276；349-59(1991))。透析后，结合到hLF样品上的铁用液体闪烁计数定量。此分析结果示于图6。铁从标准和重组体hLF的pH依赖的释放都相同。标准和重组体hLF在pH7-4的范围保留大多数铁，在pH2.0基本上无铁。
C.天然和重组体hLF对大肠杆菌0111的抗微生物作用用体外微量滴定板分析(Nonnecker和Smith，J.Dairy Sci.，67；606-613(1984))测定天然(标准)和重组体hLF对大肠杆菌0111的抗微生物活性。简要地，对数期细胞的标准接种(1×106CFU/ml)培养在基本细菌培养用胨培养基(100μl)中，存在或不存在浓度增加的Apo-Std或Apo-Rec hLF。该样品在37℃/200 RPM培养4小时。等份取出，连续稀释并在MacConkey琼脂平板上铺板过夜用于计数。该分析结果示于图7。对大肠杆菌0111，天然和重组体hLF在所有测试浓度产生相似的剂量依赖的抗微生物作用。
D.天然和重组体hLF对弗氏志贺菌的抗微生物作用按实施例4(C)所述测定天然(标准)和重组体hLF对弗氏志贺菌的抗微生物作用。该分析结果示于图8。天然和重组体hLF在所有测试浓度产生相似剂量依赖的弗氏志贺菌抑制作用作用。
E.天然和重组体hLF对弗氏志贺菌的抗微生物作用(杀灭时间研究)进行天然和重组体hLF抗微生物活性的时程。简要地，对数期弗氏志贺菌细胞的标准接种(1×106CFU/ml)培养在基本细菌培养用胨培养基(100μl)中，存在或不存在浓度增加的Apo-Std或Apo-Rec hLF。该样品在37℃/200 RPM培养4小时。在各个时间段(0，1，4和20小时)等份取出，连续稀释并在MacConkey琼脂平板上铺板过夜用于计数。该分析结果示于图9。重组天然的和重组体hLF对弗氏志贺菌以时间依赖的方式产生相似的抗微生物作用，4小时后无可测的弗氏志贺菌CFUs存在。
实施例5允许任何cDNA框内亚克隆的通用穿梭载体pPLF-26的构建该实施例描述能够表达曲霉属颗粒中hLF的突变形式的人乳铁蛋白穿梭载体的设计和构建。为了促进改变形式的乳铁蛋白克隆进载体，造成单一NotI和EcoRI位点。蛋白在葡糖淀粉酶启动子和作为葡糖淀粉酶hLF嵌合体信号序列的方向表达，它在体内通过KEX-2剪切位点的识别来加工。两种载体也含有增加mRNA稳定性的葡糖淀粉酶3′非翻译区和福来霉素抗性基因用于曲霉属中的选择作用。
I.人乳铁蛋白表达载体构建A.pPLF-26的构建为了造成能够接受乳铁蛋白突变形式的表达载体，改变几个限制位点以容许单一克隆位点。代替进入质粒的乳铁蛋白突变形式，设计在hLF基因的5′末端加入NOTI位点。选择EcoRI位点作为在hLF基因3′末端的单一克隆位点；以及，其它存在的EcoRI位点需要删除以使此位点单一。
除了单一克隆位点，pPLF-26含有泡盛曲霉葡糖淀粉酶(GA)启动子、信号序列、以及通过KEX-2识别位点与hLF分隔开的葡糖淀粉酶蛋白的498个氨基酸。该载体还含有黑曲霉GA3′非翻译区(UTR)，以及来自链异壁菌(CAYLAZ载体pUT713)被黑曲霉β-微管蛋白启动子表达的福来霉素抗性基因。为了在大肠杆菌中选择和复制，质粒含有ColEI复制起点和氨苄青霉素抗性基因。hLF表达载体pPLF-26的构建概括于图10-A和图10-B，构建中期的描述如下。
pPLF18Sp.Alt含有启动子，信号序列和通过KEX-2识别位点与hLF分隔开的葡糖淀粉酶的部分蛋白序列的质粒pPLF-18被选作起始质粒，用于期望位点修饰。pPLF-18用SphI消化分离两个片断；含有hLFd 3.3 kb片断以正确的取向被亚克隆到体外诱变载体pALTER给出pPLF18Sp.Alt。
pR18.2出自pPLF-18的4.4kb Sph片断重新连结得到pR18.2。
-pNot.9通过载体pPLF18Sp.Alt的体外诱变造成跨越KEX-2剪切位点和hLF起始位点的NotI限制位点。把“T”核苷酸改变为“C”核苷酸造成的NotI位点是符合读框的，并未改变任何氨基酸。下列21碱基核苷酸(如SEQ.ID.No.8所示)被用于诱变，其中小写字母指一个碱基改变寡聚HLF NotINotI5′AG CGC GGC Ccc AGG AGA AGG A 3′...... Lys ArgGlv Arc Arc ArcArc......
成熟的HLF诱变寡聚HLF NotI用于与氨苄青霉素修复寡核苷酸(Promega)偶联退火成单链pPLF18Sp.AltDNA，然后用T4DNA聚合酶和T4DNA连接酶补平。修复负菌株BMH71-18muts和JM109的转化后，选择的转化体的50％包含在新的NotI位点，其中之一指定为pNot.9。
pΔE12质粒pR18.2yong EcoRI消化，两个片断用凝胶电泳分离。两个片断都单独用Klenow补平，并且较大的3.6kb片断用牛小肠磷酸酶(CIP)在50℃作用1小时去磷酸化。酚抽提和乙醇沉淀后，两个补平的片断相互平端连接。转化前，连接混合液用EcoRI消化以使任何仍含有EcoRI位点的载体线性化。16个克隆中的三个均具有线性化仍含有一个EcoR1位点的任何载体的EcoR1。其中之一指定为pΔE12。
pPLF-25pΔE12用SphI消化并用CIP去磷酸化。从pNot.9分离含有新的NotI位点的3.3kb SphI片断并连接到pΔE12/Sph。带有正确取向SphI片断的克隆指定为pPLF-25，它含有两个单一的EcoRI和NotI位点，并且hLF融合到被GA启动子表达的葡糖淀粉酶序列。
pLO3ΔRI为了使pPLF-25对在曲霉属中选择有用，加入了福来霉素抗性盒。在质粒pLO3中的盒含有两个EcoRI位点，它们在该盒加入前必须除去。质粒pLO3用EcoRI消化，分离两个4.3和0.9kb片断，并分别用Klenow补平。补平反应后，4.3kb片断用CIP处理，然后纯化和沉淀。两个补平的片断相互连接过夜。细菌转化后选择的克隆显示24个中的5个具有补平的两个EcoRI位点并正确取向，给出pLO3ΔRI。
pPLF-26来自pLO3ΔRI，含有被B-微管蛋白启动子转录的福来霉素抗性基因的2.3kb HindIII片断，连接到用HindIII消化和用CIP去磷酸化的pPLF-25上。16个克隆有9个在两个取向有HindIII片断。指定为“pPLF-26”的质粒具有在如hLF基因的相同方向转录的福来霉素抗性基因。
图11表示含有用于克隆的单一NotI和EcoRI位点的通用穿梭载体pPLF-26的详细描述。在葡糖淀粉酶(GA)启动子区域已存在的EcoRI位点通过补平除去。该载体也含有GA非翻译区、Kex-2切割位点、以及用于在泡盛曲霉选择的福来霉素抗性。注意所有已知限制位点示于该图。
图12表示用各种限制性酶消化pPLF-26和pPLF-19以证实单一NotI和EcoRI位点的存在、质粒的取向的结果。1μg pPLF-26或pPLF-19DNA以20μl体积用指出的限制酶在37℃消化1小时。泳道1，1μgλ-HindIII标准。泳道2，用EcoRI消化的pPLF-26。泳道3，pPLF-19/EcoRI.。泳道4，pPLF-26/EcoRI和NotI。泳道5，pPLF-19/EcoRI和NotI。泳道6，pPLF-26/BamHI。泳道7，pPLF-19/BamHI。泳道8，pPLF-26/HindIII。泳道9，pPLF-19/HindIII。泳道10，pPLF-26/SphI。泳道11，pPLF-19/SphI。泳道12，pPLF-26/Xba(注意未完全消化)。泳道13，pPLF-19/Xba。
此通用载体能容易地适应表达各种不同的期望蛋白。例如，公布的hLF的序列可以插入到此载体并从其表达和分离。
实施例6牛和猪乳铁蛋白在泡盛曲霉中的表达在实施例5中构建的通用泡盛曲霉表达载体能用来允许任何感兴趣cDNA的符合读框亚克隆。此载体pPLF-26与利用来在泡盛曲霉表达人乳铁蛋白的pPLF-19相似。使用聚合酶链反应(PCR)扩增它们的已知DNA序列，5′和3′寡核苷酸引物可以设计成分别含有Not1和EcoR1末端并用于获得编码成熟猪和牛乳铁蛋白的全长cDNA序列。PCR片断可以用Not1消化，用绿豆核酸酶(Stratagene)修复，所有用EcoRI消化的可以允许符合读框的亚克隆到经Not1酶切、修复、EcoR1消化的pPLF-26。该质粒然后转化到泡盛曲霉中以获得前面描述的人乳铁蛋白非DNA的表达和分泌。
实施例7人乳铁蛋白在不同曲霉菌株中的表达比较研究本实施例比较了用不同载体构建得到的不同曲霉菌株，特别是米曲霉和构巢曲霉中hLF表达的不同水平。这些数据将与上面列出的泡盛曲霉中hLF表达的数据进行比较。
A.米曲霉中人乳铁蛋白的表达表达质粒pAhLFG设计含有编码人乳铁蛋白的完整cDNA序列并用于在米曲霉中的相同表达。设计、构建和pAhLFG图示的详细情况见共同未决的专利申请，94年5月27日提交的US序列号08/250,308，它是92年4月24日提交现已放弃的申请序列号07/873,304的部分延续。共同未决的专利申请US序列号08/250,308的公开在此插入作为参考。
表达质粒pAhLFG含有编码α淀粉酶启动子，分泌信号序列和成熟α淀粉酶首密码子的米曲霉AMYII基因的5′-旁侧序列。编码成熟人乳铁蛋白的cDNA亚克隆到这些序列的下游框内，通过向培养基中加入淀粉来产生重组蛋白。黑曲霉葡糖淀粉酶3′非翻译区提供转录终止子和聚腺苷酸化信号。该质粒还含有粗糙链孢霉pyr4选择性标记和一个氨苄青霉素抗性基因。
Southern印记分析在转化的米曲霉菌株中进行，该数据先前存在于94年5月27日提交的共同未决的专利申请美国系列号08/250,308中，它是92年4月24日提交现已放弃的申请系列号07/873,304的部分延续。简要地说，各转化株的基因组DNA和对照A07与放射标记的hLFcDNA探针(2.1kb)杂交。结果证明放射性标记片断(2.8kb)产生自表达质粒的EcoR1酶切，它存在于所有转化株(#1-9)中，但在对照未转化的A07中不存在。
进行Northern分析以确定在表达质粒调控元件下乳铁蛋白mRNA是否在米曲霉中正确和有效的转录。该数据先前存在于94年5月27日提交的共同未决的专利申请美国系列号08/250,308中，它是92年4月24日提交现已放弃的申请系列号07/873,304的部分延续。简要地说，结果证明用32P标记的人LF cDNA(2.0kb)探针可检测人乳铁蛋白mRNA。用人LF放射性标记的cDNA探针杂交检测转化株中而不是对照的未转化株中特异的对乳铁蛋白mRNA(2.3kb)正确大小的放射性标记带。用点杂交进行的mRNA水平等量显示对照A07和被试转化株(#1)之间内源性α淀粉酶mRNA表达的可比水平。
为了检测重组LF在米曲霉表达和分泌的水平，转化株(#1)在3％淀粉存在下、30℃培养72小时。收集培养物，菌丝体在pH10洗涤以释放与细胞壁松散结合的蛋白质(Huge-Jensen等，Lipids，24781-785(1989))。结果见图16。用直接抗人乳铁蛋白的特异IgG进行Western免疫印记分析检测到在转化株中对应于乳铁蛋白大小的78kd蛋白，它在对照A07中不存在。(图16A，2、3泳道)。
图16A泳道1含有乳奶hLF标准品(500ng)；泳道2和3分别含有来自诱导的对照A07和#1转化株的培养物样品(40μg蛋白)；泳道4到6含有来自培养物的重组hLF经CM-葡聚糖纯化后收集的各20μl等体积洗脱组分(分别是#35，40和45)。双银染的SDS-PAGE凝胶分析还显示转化株中存在78kd蛋白，它在A07对照中不存在(图16B，泳道2和3)。用抗hLF的特异性生物素化的IgG进行ELISA分析(Vilja等，J.Immunol.Methods 7673-83(1985))表明重组hLF在5-25mg/l水平分泌，并代表来自诱导的培养物中大约5％的总培养物蛋白。在整合的拷贝数和重组蛋白分泌的水平间无相关性。载体设计和生产水平见下表。
用CM-葡聚糖C5026通过离子交换层析从#1转化株的培养物中纯化重组乳铁蛋白(Stowell等，Biochem.J.276349-355(1991))。人乳铁蛋白用线性盐梯度从柱上洗脱。用直接对hLF的特异性IgG通过Western免疫印记杂交在组分35到45中检测到相应于hLF大小的免疫反应区带(图16A，泳道4到6)。用银染SDS-PAGE的双重样品分析显示该免疫反应hLF对应于这些组分中的主要蛋白区带(图16B，泳道4到6)。这些结果表明这种单离子交换层析步骤可达重组hLF约95％纯化。图16B对图16A描述的双重样品的SDS聚丙烯酰胺凝胶分析的银染。
为了确定hLF是否在其N-末端被正确加工，该重组蛋白用自动的Edman降解步骤从N-端对10个残基进行测序。除了在N-末端附加的丙氨酸残基(图16C)，它被导入我们的质粒构建以准确模拟信号肽与成熟α-淀粉酶的连接，此材料的大部分与天然人乳LF相应的氨基酸相同(Metz-Boutigue等，Eur J.Biochem.145659-676(1984))。小部分失去了N-末端Ala-Gly-Arg三肽或Ala-gly-Arg-Arg四肽。天然hLF先前的分析提示这种加工形式对hLF蛋白本身可能是固有的(Hutchens等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.882994-2998(1991))，或可能由于米曲霉信号肽酶N-末端加工能力的异质性(Christensen等，Bio/Technology 61419-1422(1988)；Huge-Jensen等，Lipids 24781-783(1989))。
B.人乳铁蛋白在构巢曲霉中的表达设计和构建用于hLF cDNA在构巢曲霉中表达的质粒。该载体的设计和构建(包括所有中间载体)的细节先前在1993年10月28日提交，美国系列号08/145,681的共同未决专利申请中描述。
简要地，构巢曲霉表达质粒pAL3hLFT，含有构巢曲霉alcA基因5′旁侧序列的300bp，含有控制基因表达所必须的所有调节元件，该载体包含来自构巢曲霉的乙醇脱氢酶启动子，天然hLF信号序列，编码hLF的cDNA，构巢曲霉的BenA3′非翻译序列和粗糙链孢霉pyr4选择性标记。
转化的构巢曲霉菌株进行Southern印记分析，数据先前在1993年10月28日提交，美国系列号08/145,681的共同未决专利申请中描述，并在此插入作为参考。简要地，进行Southern印记分析以确认转化体含有带有hLF cDNA的整合质粒。在泳道1到10而非对照芽孢的DNA中检测到预期大小(2.3kb)的hLF特异的放射性标记区带。这些结果证明hLF cDNA被整合的所有被试构巢曲霉转化体的基因组中，每个细胞随意的从一个拷贝到20个拷贝有所不同。质粒整合的构巢曲霉基因组的位置由于没有对靶载体进入特殊位点的同源序列是随机的。
hLF在构巢曲霉中产生的具体细节先前在1993年10月28日提交，美国系列号08/145,681的共同未决专利申请中描述。简要地，分子孢子(1×106ml)与乙酸钠为碳源，加入或不加入1.2％乙醇，在基本培养基中培养以诱导hLF cDNA的转录。用Miracloth(Calbiochem，San Diego，CA)收集并分离培养物和菌丝体。菌丝体(200mg)冷冻干燥过夜。在特氟龙玻璃匀浆器中用磷酸缓冲液在苯甲基氟磺酸存在下通过匀浆准备总细胞提取物。离心该匀浆，并回收含有可溶组分的上清液。通过冷冻干燥浓缩培养基并重悬于PDS中。用Bradford试剂根据制造者的说明(Biorad，Richmond，CA)测定蛋白浓度。含有40μg蛋白和可溶性提取物(50μg蛋白)的浓缩培养基样品进行SDS-PAGE。纯化的乳铁蛋白用作标准(hLF std)溶解蛋白用Western印记方法电转移到硝酸纤维素滤膜上。该滤膜用含有2％干牛奶的Tris缓冲液封闭，然后再加入1μg/ml抗hLF的特异性多克隆IgG(Sigma，St.Louis，MO)的相同缓冲液中温育。滤膜用TBS/0.05％NP-40洗涤，然后与125碘蛋白A保温，该滤膜然后洗涤干燥并在-70℃对柯达XAR5胶片曝光过夜。该胶片然后进行放射自显影。放射自显影证明hLF的产生。
进行Western分析以确定hLF cDNA是否在构巢曲霉转化体中，在alcA启动子控制下是否表达。来自一个转化体(No.5)的分子孢子(1×106ml)，含有整合hLF cDNAs的最高拷贝数。培养物收集洗涤后再接种到补充乙醇的基本培养基中，在收集培养物之前，再生长12或24小时，细胞提取物和培养基样品通过SDS-PAGE分离，转到硝酸纤维素膜上并用对hLF特异的多克隆IgG免疫印记。与天然hLF无区别的免疫反应区带在来自5号转化体加入乙醇诱导仅12和24小时后在细胞和培养基中是明显的。这些结果证明hLF在转化的泡盛曲霉中，在alcA启动子控制下表达。
Western分析揭示hLF在所有剩余的转化体细胞中(未给出数据)。一般地，在质粒拷贝数和得到的表达水平之间存在相关性。在培养基中，仅用含有整合表达质粒(1，5，7和10号)的多拷贝的转化体来检测hLF。
进行5号转化体的预发酵以测定产生hLF的大约数量。用直接对hLF的特异生物素化IgG进行ELISA分析，说明产生的重组hLF的总水平是5mg/l，有大约30％(1.5-2.0μg/ml)的此原料分泌到培养基中。见下表载体设计和产量水平。
所以，该实施例表明本申请者通过修饰表达载体质粒构建的设计和改变所有的宿主细胞，已改善并增加了人乳铁蛋白的表达。如在下表指明的，几个不同的载体构建已用于在至少四个不同的曲霉属菌株中生产人乳铁蛋白。产生的人乳铁蛋白的量用每毫升hLF毫克数表示。
为了方便，每个载体成分以从左到右的方向出现于载体构建中的顺序列表。包括在表达质粒载体的元件包括启动子和启动子源，信号序列和信号序列源，连接臂序列，编码人乳铁蛋白的DNA，转录终止序列，印记可选择的标记物。
>
实施例8用含有等位基因变异的公开DNA序列生产乳铁蛋白可以使用编码乳铁蛋白的几个已知DNA序列中的任一个，如在上面参考的发表文献和专利申请中确定的，在此引入作为参考。另外，可以使用保持了乳铁蛋白性质的编码乳铁蛋白多肽片断的DNA序列。普通的技术人员会明白和知道本发明的范围，还包括不同的被公开和显然来自人、猪或牛乳铁蛋白的等位基因变异的产物。一些等位基因变异在文献中已有报道，它们试图作为可能通过本发明方法产生的乳铁蛋白类型而被包括。
实施例9发酵方案不同的生长和生产条件可以用于泡盛曲霉中重组人乳铁蛋白的表达。下列描述存在目的是为了解释各种条件，它能用于hLF在泡盛曲霉中的表达并不意味着是本发明任何形式的限制。下面提供的是发酵生产过程和用于回收生产的乳铁蛋白的过程的一般概要。为了增加期望的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽的产量，普通的技术人员会明白方案可以改变或以稍加以修饰。
以下是通过使用发酵过程生产乳铁蛋白的简要概括。
I.发酵工艺A.培养基成分1)种子培养基Roquette Corn Steep Power 100g/L葡萄糖10g/LMgSO4-7H2O 1g/LNaH2PO4-2H2O 1g/L高压灭菌前调pH到5.8并高压灭菌15分钟。
2)生产培养基(浓度指接种后)Amaizo Lodex-5部分水解的玉米淀粉 175g/LRoquette Corn Steep Power(SolulysAST) 60g/L柠檬酸三钠80g/LMgSO4-7H2O 1g/LNaH2PO4-2H2O 1g/L硫酸铵15g/L消泡剂204 2ml/L高压灭菌前调pH到5.8并高压灭菌15分钟。
本发明人已发现当部分水解的淀粉用于发酵工艺时，可以获得增加的乳铁蛋白产量。然而，未处理的玉米淀粉和葡萄糖配合产生了合理产量的乳铁蛋白。通过常规实验，可以使用较少量的淀粉产物或代替更贵的淀粉产物以优化乳铁蛋白的产量。
B.发酵工艺至今，发酵是以分批工艺进行的。最大产物浓度在5-6天达到。
1)接种阶段1a)2L锥形瓶中的450mls接种培养基b)用每毫升1×106芽孢的接种培养基接种c)在33℃，70％相对湿度，240rpm(50mm throw shaker)下接种24小时。
2)接种阶段2a)20L接种培养物在具有两个12cm六片rushton推动器的NBSMicros 30发酵罐中。
b)消毒30分钟用2％阶段1的种子接种。
500rpm搅拌空气流速 0.75VVM
压力 300mbarpH 未控制DO 未控制3)生产中试容器是具有3∶1纵横比的B.Braun Biotech UD 100。两个16cm六浆Rushton高速搅拌机用于搅拌。发酵在接种后80L进行。
搅拌 450rpm能量输入未加检查温度 33℃通气 0.75VVM 此可变因素未加检查压力 300mbarpH 未控制DO 未控制此可变因素未加检查消泡剂 不需要容器条件如上描述。容器装有80L的培养基成分并brought to aVolume of 72L withdeionized water。消毒30分钟。生长36-48小时时转移8升(10％CV)阶段2种子。目前正研究优化的接种工艺。
到24小时可见乳铁蛋白产物，在5-6天产物积累有最大值。
II.下游加工A.过滤发酵达30-40％非成球形态的收集细胞体积。假如使用过滤来澄清肉汤，则需要助滤剂。由于加工体积小，可以在3,000cm2支撑物上直接真空过滤。用聚丙烯垫作为底板。
最初使用硅藻土作为助滤剂。然而，直接煅烧或融化煅烧的硅藻土因为结合乳铁蛋白而不能用作助滤剂。只有酸洗的硅藻土不结合乳铁蛋白。酸洗硅藻土(DE)比未处理硅藻土购买价格贵40-50倍。另外的选择是在生产现场酸洗DE。初步实验测定，硅藻土可以用3N HCl搅成泥浆，混合45分钟，然后用去离子水洗至pH4.0。乳铁蛋白不与这样处理的材料结合。处理的DE与总肉汤以1∶5W/V比例使用。在与肉汤混合前，DE与去离子水搅成泥浆。发现l∶l0的比例不利于过滤。
一种可供选择的产物是纤维素纤维。发明者发现Solkafloc 10IND(Protein Technologies International in Urbana，IL；1-800-258-0351)很奏效且不结合乳铁蛋白。发明者用Solkafloc作为装填物来帮助过滤。对100L的发酵肉汤，20kg的Solkafloc与100L去离子水搅成浆状物。肉汤混合到浆状物中。混合物可以容易地过滤。在此步获得的澄清液使进一步下游加工(超滤和柱层析)成为可能，而不需要附加过滤。对单一一批过滤，Solkafloc与肉汤和去离子水的比例正在优化过程中。如果洗滤器滤渣，乳铁蛋白的回收应该几乎是定量的。用连续的过滤处理装置，以Solkafloc为助滤剂的方法要改变。
可以使用具有改善的流变学和过滤特性的已存在菌株或改进菌株。例如，在搅拌箱发酵中成球的突变株在加工过程中可允许较厚的滤渣并且不需要助滤剂除非作为滤料层。
B.超滤澄清的肉汤用超滤方法浓缩。两个具有30,000 MW膜的AmiconS10Y30(各0.93m2)螺旋柱体用于Amicon DC-30系统。该膜是一种低蛋白质结合的纤维素材料。流动速度为1-1.8rpm，取决于处理的阶段。一旦达到最小的操作处理体积，浓缩的溶液就连续用5倍体积的含有0.1M NaCl，1mM EDAT和25mM Tris pH7.5的缓冲液连续透析。该缓冲液然后冷至4℃，透析的溶液浓缩至可能的最小体积并回收。此过程的产率已接近100％。
最后的超滤(UF)浓缩物为5-8mg/ml总蛋白，乳铁蛋白占总蛋白的10％。在开发新菌株时会优化回收速率。对于一个80升发酵量，用此系统浓缩和透析约需2小时。
C.层析分离使用Pharmacia CM琼脂糖快流速凝胶。此树脂对澄清肉汤中乳铁蛋白的结合容量约为20mg/ml。
将UF浓缩物上柱。加样的柱开始用0.1M NaCl/25mM Tris pH7.5冲洗，然后用0.2M NaCl/25mM Tris pH7.5冲洗。除非该柱超载，乳铁蛋白不会释放出来。该乳铁蛋白用0.5M NaCl/25mM Tris pH7.5洗脱。含有乳铁蛋白的洗脱组分体积通常为树脂长体积的2倍。
D.转化为脱铁蛋白混合含有乳铁蛋白的0.5M NaCl组分。加入1M柠檬酸铵使终浓度为0.1M柠檬酸铵。pH用10N盐酸缓慢调至2.0。该溶液转至合适大小的使用3,000MW膜的超滤装置，浓缩至合适的体积，然后连续用5倍体积的0.5M NaCl/0.1M柠檬酸铵pH2.0透析。完成铁的释放和透析后，pH调至中性以防止在下一步中的沉淀。如果存在残留的铁，它将在中性pH再与乳铁蛋白结合。透析液变为50mM碳酸氢铵(pH7.8)，溶液连续用5倍体积的缓冲液透析。该溶液然后浓缩至最小体积，回收并冷冻干燥。
该步骤现在已被优化。特异因子被认为依赖于使用的菌株。一些因子包括(1)pH限制，(2)装置的预处理以消除铁，和(3)缓冲液用Chelex树脂预处理以除去痕量的铁。可能有必要通过一种中间缓冲液，如0.2MNaCl 50mM碳酸氢铵以避免乳铁蛋白沉淀以及残留铁的重新结合。
实施例10在米曲霉或黑曲霉细胞中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为一种融合产物的产生A.米曲霉中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的表达与前面描述相似的表达载体可被构建用于乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为一种融合蛋白产物在米曲霉中的表达。米曲霉表达载体可含有下列从5′到3′可操作连结的成分(a)来自米曲霉α-淀粉酶基因启动子的启动子；
(b)米曲霉α-淀粉酶基因的信号序列；(c)米曲霉α-淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶裂解部位的连接序列，在那有一个对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；(f)福来霉素抗性可选择标记基因；其中所述载体能产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并与加工的蛋白表达相同。
该载体然后用来转化米曲霉细胞；这种新质粒载体构建的产物是一种融合蛋白，包含部分融合到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的高表达米曲霉α-淀粉酶基因，对应于上面(e)步骤的核苷酸序列。乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断融合产物然后可以被对Kex2肽酶位点特异的内源性米曲霉蛋白酶加工。
B.黑曲霉中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的表达与前面描述相似的表达载体可被构建用于乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为一种融合蛋白产物在黑曲霉中的表达。黑曲霉表达载体可含有下列从5′到3′可操作连结的成分(a)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶裂解部位的连接序列，在那有一个对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；(f)福来霉素抗性可选择标记基因；其中所述载体能产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并与加工的蛋白表达相同。
该载体然后用来转化黑曲霉细胞；这种新质粒载体构建的产物是一种融合蛋白，包含一半融合到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的高表达黑曲霉葡糖淀粉酶基因，对应于上面(e)步骤的核苷酸序列。乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断融合产物然后可以被对Kex2肽酶位点特异的内源性黑曲霉蛋白酶加工。
总之，可见本发明和这里公开的实施方案很好地适合完成目标，并得到本申请的最终阐述。在方法和设备中会做某些改变而不背离本发明的精神和范围。意识到改变是可能的，并进一步认为负责任何提交的权利要求的每个元素或步骤将被理解为指以基本相同或等效的方法完成基本相同的结果的所有等效的元素或步骤。试图以任何使其原理可被应用的形式广泛地覆盖本发明。因此本发明很好的适合完成目标并获得提及的结果和优点以及其中固有的其它方面。
序列列表(1)总说明(i)申请人Conneely，Orla M.，等。
(ii)发明题目来自曲霉属融合产物中经加工的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断的表达(iii)序列数8(iv)通信地址(A)收信人Pennie & Edmonds(B)街道1155 Avenue of the Americas(C)城市纽约(E)国家美国(F)邮政编码10036-2711(v)计算机可读方式(A)介质类型磁带(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，#1.25版(vi)目前申请资料(A)申请号将指定(B)提交日期在此同时给出(C)分类(viii)律师/代理人资料(A)姓名Albert P.Halluin(B)登记号25,227(C)查询/案号8206-101(ix)电信(A)电话415/854-3660(B)传真415/854-3694(C)电报66141 PENNIE(2)SEQ ID NO1的说明(i)序列特征(A)长度32个碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO1GGGGTACCGC GCCGGCCGTA GGAGAAGGAG TG 32(2)SEQ ID NO2的说明(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO2TTCGGTCCCG TAGACTTCCG CCGCT 25(2)SEQ ID NO3说明(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO3TATGCAGAGG AGCTCTCCCC TGAC 24(2)SEQ ID NO4说明(i)序列特征
(A)长度32碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTCCGCCG GCCAACCCTG TGCAGACGAG GC 32(2)SEQ ID NO5说明(i)序列特征(A)长度18碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO5GAATTCAAGC TAGATGCT 19(2)SEQ ID NO6说明(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO6AGCGTGACCT CGACCAGCAA GAATGTGATT TCCAAGCGC39(2)SEQ ID NO7说明(i)序列特征(A)长度39碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO7TCGCACTGGA GCTGGTCGTT CTTACACTAA AGGTTCGCG39(2)SEQ ID NO8说明(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(iii)假设的非(iv)反义非(xi)序列描述SEQ ID NO8AGCGCGGCCG CAGGAGA AGG A 2权利要求
1.新的重组表达载体质粒，其中包括下列可行地从5′到3′连结的组成部分(a)启动子；(b)信号序列；(c)其产物从曲霉属细胞分泌的高表达内源性基因的5′部分；(d)连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白水解酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；其中所述载体能够产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并表达与加工后蛋白相同的产物。
2.权利要求1的载体，其中启动子选自乙醇脱氢酶，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，和benA基因。
3.权利要求2的载体，其中启动子来自葡糖淀粉酶基因。
4.权利要求3的载体，其中葡糖淀粉酶基因来自泡盛曲霉或黑曲霉。
5.权利要求2的载体，其中启动子来自α-淀粉酶基因。
6.权利要求5的载体，其中α-淀粉酶基因来自米曲霉。
7.权利要求1的载体，其中信号序列选自葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因。
8.权利要求7的载体，其中信号序列选自泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
9.权利要求7的载体，其中信号序列选自米曲霉α-淀粉酶基因。
10.权利要求1的载体，其中高表达内源性基因选自α-淀粉酶基因和葡糖淀粉酶基因。
11.权利要求10的载体，其中高表达内源性基因是米曲霉α-淀粉酶基因。
12.权利要求10的载体，其中高表达内源性基因是泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
13.权利要求1的载体，其中连结序列是肽酶裂解位点。
14.权利要求13的载体，其中连结序列编码Kex2肽酶裂解位点。
15.权利要求1的载体，进一步含有转录终止序列和可选择标记。
16.权利要求15的载体，其中转录终止序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶和benA基因。
17.权利要求16的载体，其中转录终止序列来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
18.权利要求15的载体，其中可选择标记基因选自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC，和福来霉素抗性基因。
19.权利要求18的载体，其中可选择的标记选自福来霉素抗性基因。
20.权利要求1的载体，其中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断从人，牛或猪得到。
21.当权利要求1的载体用于转化曲霉属真菌细胞时产生的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断。
22.新的重组表达质粒载体，其中包括下列可行地从5′到3′连结的组成部分(a)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述载体能够产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并表达与加工后蛋白相同的产物。
23.当权利要求22的载体用于转化泡盛曲霉真菌细胞时产生和加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断。
24.新的重组表达质粒载体，其中包括下列可行地从5′到3′连结的组成部分(a)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述载体能够产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并在将所述载体转化入黑曲霉细胞后表达与加工后蛋白相同的产物。
25.新的重组表达质粒载体，其中包括下列可行地从5′到3′连结的组成部分(a)来自米曲霉α-淀粉酶基因的启动子；(b)来自米曲霉α-淀粉酶基因的信号序列；(c)米曲霉α-淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述载体能够产生作为融合蛋白的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，并表达与加工后蛋白相同的产物。
26.当权利要求25的载体用于转化米曲霉真菌细胞时产生和加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断。
27.产生乳铁蛋白的方法，其中包括培养含有重组质粒的转化的曲霉属真菌细胞，此处所述质粒包括下列可行地从5′到3′连结的组成部分(a)启动子；(b)信号序列；(c)其产物从曲霉属细胞分泌的高表达内源性基因的5′部分；(d)连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；其中所述转化的曲霉属真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
28.权利要求27的方法，其中所述质粒进一步含有转录终止序列和可选择的标记基因。
29.权利要求27的方法，其中所述启动子选自乙醇脱氢酶，α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，和benA基因。
30.权利要求29的方法，其中所述启动子来自葡糖淀粉酶基因。
31.权利要求30的方法，其中葡糖淀粉酶基因来自泡盛曲霉或黑曲霉。
32.权利要求29的方法，其中所述启动子来自α-淀粉酶基因。
33.权利要求32的方法，其中α-淀粉酶基因来自米曲霉。
34.权利要求27的方法，其中所述信号序列选自葡糖淀粉酶和α-淀粉酶基因。
35.权利要求34的方法，其中信号序列来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
36.权利要求34的方法，其中信号序列来自米曲霉α-淀粉酶基因。
37.权利要求27的方法，其中高表达内源性基因选自α-淀粉酶和葡糖淀粉酶基因。
38.权利要求37的方法，其中高表达内源性基因为米曲霉α-淀粉酶基因。
39.权利要求37的方法，其中高表达内源性基因为泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因。
40.权利要求27的方法，其中连结序列为肽酶剪切位点。
41.权利要求40的方法，其中连结序列编码Kex2肽酶剪切位点。
42.权利要求28的方法，其中转录终止序列选自α-淀粉酶，葡糖淀粉酶，乙醇脱氢酶和benA基因。
43.权利要求42的方法，其中转录终止序列来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因。
44.权利要求28的方法，其中可选择的标记基因选自pyr4，pyrG，amdS，argB，trpC，和福来霉素抗性基因。
45.权利要求44的方法，其中可选择标记来自福来霉素抗性基因。
46.通过权利要求27的方法产生的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断。
47.权利要求46的乳铁蛋白，其中乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断为人，猪或牛乳铁蛋白。
48.权利要求47的乳铁蛋白，其中乳铁蛋白已去糖基化。
49.权利要求47的乳铁蛋白，其中人乳铁蛋白产物已去糖基化。
50.权利要求27的方法，其中曲霉属真菌细胞表达乳铁蛋白。
51.含有下列可操作地从5′到3′连结的组成部分的表达质粒载体(a)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码人乳铁蛋白或人乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述载体被用于在曲霉属真菌细胞中表达人乳铁蛋白或人乳铁蛋白多肽片断。
52.权利要求51的质粒，进一步定义为具有ATCC保藏号74290并命名为Awa LF 24-1。
53.含有权利要求51质粒的泡盛曲霉真菌细胞。
54.产生乳铁蛋白的方法，其中包括培养含有重组质粒的转化的泡盛曲霉真菌细胞，此处所述质粒包括下列可操作地从5′到3′连结的组成部分(a)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码人乳铁蛋白或人乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述转化的泡盛曲霉真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对该连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
55.产生乳铁蛋白的方法，其中包括培养含有重组质粒的转化的米曲霉真菌细胞，此处所述质粒包括下列可操作地从5′到3′连结的组成部分(a)来自米曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自米曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)米曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码人乳铁蛋白或人乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述转化的米曲霉真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对该连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中所述加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
56.通过产生乳铁蛋白的方法生产的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断，它包括培养含有重组质粒的转化的泡盛曲霉真菌细胞，此处所述质粒包括下列可操作地从5′到3′连结的组成部分(a)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，靠近那有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述转化的泡盛曲霉真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对该连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
57.从真菌营养培养基分离乳铁蛋白多肽片断的方法，它包括培养含有重组质粒载体的转化泡盛曲霉真菌细胞，其中所述质粒载体包含来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子，来自泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列，泡盛曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分，编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶，编码乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列，来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列，和福来霉素抗性可选择的标记基因，其中所述转化的泡盛曲霉真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对该连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
58.产生乳铁蛋白的方法，它包括培养含有重组质粒的转化的黑曲霉真菌细胞，其中所述质粒包括下列可操作地从5′到3′连结的组成部分(a)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的启动子；(b)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的信号序列；(c)黑曲霉葡糖淀粉酶基因的5′部分；(d)编码Kex2肽酶剪切位点的连结序列，借此有一种对所述连结序列特异的内源性蛋白酶；(e)编码人乳铁蛋白或人乳铁蛋白多肽片断的核苷酸序列；(f)来自黑曲霉葡糖淀粉酶基因的转录终止序列；和(g)福来霉素抗性可选择的标记基因；其中所述转化的黑曲霉真菌细胞在适当的营养培养基中培养，直到乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断作为融合产物产生并随后通过一种对该连结序列特异的内源性蛋白酶加工，其中加工的乳铁蛋白或乳铁蛋白多肽片断分泌到营养培养基中并从中分离。
全文摘要
本标题发明提供用曲霉属宿主细胞与新的质粒构建生产乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽。更确切地,本标题发明提供能在曲霉属宿主细胞内产生乳铁蛋白和乳铁蛋白片断的载体构建。更特别地,本标题发明提供对曲霉属,特别是泡盛曲霉,黑曲霉和米曲霉宿主细胞适用的质粒构建物,这使它们产生大量的重组乳铁蛋白和乳铁蛋白多肽片断。
文档编号A61K38/00GK1171815SQ95197115
公开日1998年1月28日 申请日期1995年11月1日 优先权日1994年11月2日
发明者O·M·康尼利, D·R·黑登, B·W·奥梅利 申请人:贝勒医学院