用吸入氧化氮治疗血管血栓形成和再狭窄的制作方法

专利名称：用吸入氧化氮治疗血管血栓形成和再狭窄的制作方法
背景技术：
本发明涉及治疗、抑制或预防血管血栓形成的方法和治疗、抑制或预防由内膜过度增生造成的动脉再狭窄的方法。
血栓形成，即，在血管内形成或存在血凝块，可能是由诸如经皮经腔冠状血管成形术(“PTCA”；一类气囊血管成形术)或冠状动脉分流手术的血管介入操作产生的动脉壁的物理损伤所造成。血栓形成也可由如动脉粥样硬化的天然病程造成。各种药物，包括阿司匹林、前列腺素E1、选择性的血栓素(thromboxane)A2抑制剂、选择性的凝血酶抑制剂、血小板受体GPIIb/IIIa阻滞剂、组织纤维蛋白溶酶原活化剂、链激酶、肝素和kistrin已用作抗血栓形成剂。参见，如Yasuda等(循环(Circulation)831038(1991))；和Gold等(循环(Circulation)(增刊IV)83IV26(1991))。目前市售的抗血小板药包括阿司匹林、噻氯匹啶、单克隆抗体、硝酸甘油和硝普钠。
由血管介入操作造成的动脉损伤产生的另一个不好的结果是动脉再狭窄。例如，PTCA被广泛地用来开放冠状和外周血管系统的闭塞的动脉。虽然开始有95％以上的病例得以成功。但在6个月内30-50％的病人发生了再狭窄。
血管介入操作有损伤血管壁的倾向。这样的损伤引起血管平滑肌细胞增殖，产生了内膜增生。该增殖可能部分是由于粘附于动脉损伤部位的血小板释放的血小板衍生生长因子的作用。内膜过度增生导致了再狭窄，即动脉腔的再狭窄。这样，动脉再狭窄可能严重地限制了血管介入操作长期有效。
发明综述现已发现，在关键狭窄部位溶解血栓后吸入氧化氮(NO)气体会增加血管的开放，但不会产生任何全身性的血液动力作用。在停止吸入NO后吸入的NO的抗血栓作用仍会持续。也已发现，吸入NO会抑制由内膜过度增生造成的动脉再狭窄。
因此，本发明的一个特征是通过让哺乳动物吸入治疗有效量的气态NO来治疗、抑制或预防哺乳动物血栓形成的方法。血栓形成可能与疾病或损伤有关。
本发明的另一个特征是通过给哺乳动物吸入治疗有效量的气态NO来治疗、抑制或预防动脉再狭窄。动脉再狭窄可能与疾病或损伤有关。
可以配合NO的吸入给哺乳动物施用能增加吸入NO的有益作用的第二个化合物。第二个化合物增加吸入NO有益作用的一个方法是延长吸入的NO在靶组织或能与靶组织作用的细胞中的作用时间，但不产生全身性的血管扩张和全身血压同时下降的不良作用。更具体的是，可以配合NO吸入(即吸入前、吸入期间和吸入后)通过给予磷酸二酯酶抑制剂来延长吸入的NO的抗血栓和/或内膜增生的抑制作用。较好的磷酸二酯酶抑制剂能选择性抑制cGMP-特异性磷酸二酯酶，它们同时对其它磷酸二酯酶分解对腺嘌呤核苷3’，5’-环单磷酸酯(cAMP)的的影响最小。有前述特异性的较好的磷酸二酯酶抑制剂是ZaprinastTM(M&B22948；2-邻-丙氧基苯基-8-氮杂嘌呤-6-酮，Rhone-Poulenc Rorer，英国)。另外一些cGMP特异性磷酸二酯酶抑制剂是已知的，可用来代替ZaprinastTM。
第二个化合物能增强NO吸入有益作用的另一个方法是延长体内NO的半衰期。这可通过，例如给予超氧化物歧化酶来实现。超氧化物歧化酶可除去会与NO反应的超氧化物游离基。
在另一个较好的技术方案中，可以配合NO的吸入对哺乳动物给以能增加吸入的NO抗血栓作用的第二个抗血栓剂。它的例子包括阿司匹林、噻氯匹啶、单克隆抗体、硝酸甘油和硝普钠。
这里所用的术语“急性冠状动脉缺血综合征”表示冠状动脉急性闭塞，如急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、逐渐增强型心绞痛(crescendo angine)、心绞痛、冠状介导综合征(coronary inter mediate syndrome)、血栓形成后心绞痛状态和PTCA后的心绞痛状态。
这里所用的“抗血栓剂”表示能抑制血栓形成，刺激血栓溶解或有两者作用的药物。
这里所用的“内膜增生”表示作为对动脉上皮剥露的一种反应，动脉内膜的平滑肌细胞发生增生。
这里所用的“血管再通”表示对哺乳动物部分机体血供的再建立。
这里所用的“靶细胞”表示在吸入NO后直接与NO相互作用以介导抑制、预防或治疗血栓形成或动脉再狭窄的有益作用的非肺细胞。
这里所用的“气态NO的治疗有效浓度”是在病人中诱导一种或多种下列作用的浓度减轻胸痛、减轻呼吸局促、消除局部缺血的心电图变化、以及改进冠状动脉血流(这可由血管照影术显示)。
这里所用的磷酸二酯酶抑制剂的“治疗有效”量是可增加气态NO治疗作用的持续时间(即半衰期)或大小的量。
这里所用的“血栓形成”表示血凝块在血管中形成或存在，该血凝块会导致由该血管供给的组织的梗死或局部缺血。
这里所用的“动脉再狭窄”表示由于内膜过度增生引起的动脉腔的异常狭窄。
这里所用的“血管介入操作”表示涉及对血管进行解剖破坏或机械破坏的任何外科手术方法。血管介入操作的非排除性名单包括气囊血管成形术、激光血管成形术、冠状动脉手术、动脉粥样化切除术(atherectomy)和冠状动脉斯滕特固定模。
这里揭示的方法可用来治疗、抑制或预防血栓形成，如由自然发生的疾病，如动脉粥样硬化造成的血栓形成，或由血管介入操作，如血管成形术或冠状动脉分流手术造成的血栓形成。这里揭示的方法在治疗、抑制或预防由内膜过度增生造成的动脉再狭窄中也是有用的。这类动脉再狭窄是与血管介入操作，如PTCA或冠状动脉分流手术有关的常见并发症。
根据本发明，可以这样给予NO气体(a)连续或间歇地；(b)不吸烟地；(c)浓度为0.1-300ppm，较好的浓度是1.0-200ppm，最好的浓度是20-100ppm；(d)以包括NO、氧气(O2)和氮气(N2)或其他惰性气体的混合物，较好的FiO2(O2的体积比)是0.20-0.99，空气中O2的比例为0.21，在吸入前不久(如吸入前5分钟内，较好的是在吸入前1分钟内)使NO气体与含O2的气体混合；以及(e)以这样的方法，使之监测NO2浓度并使之保持在安全的限度里(如少于1ppm)。
本发明一个重要的进步在于吸入NO不会诱发全身血管扩张和产生急性的全身高血压。全身血管扩张是不希望的、有潜在危险的副作用，它与经口服或静注给药的以前用来抑制血栓形成或抑制内膜过度增生的NO供体化合物缓慢向全身释放NO有关。
本发明的其它特征和优点可从下面较好的技术方案和权利要求的说明中得以显示。
附图简述

图1A是犬冠状动脉血栓形成模型中，在0ppmNO吸入前、吸入期间和吸入后与对照组比较动脉开放时间(作为总时间的百分数)的图。
图1B是犬冠状动脉血栓形成模型中，在20ppmNO吸入前、吸入期间和吸入后与对照组比较，动脉开放时间(作为总时间的百分数)的图。星号表示数值与基线有显著的差异(p＜0.05)。
图1C是犬冠状动脉血栓形成模型中，在80ppmNO吸入前、吸入期间和吸入后与对照组比较动脉开放时间(作为总时间的百分数)的图。星号表示数值与基线有显著的差异(p＜0.05)。
图1D是犬冠状动脉血栓形成模型中，在200ppmNO吸入前、吸入期间和吸入后与对照组比较动脉开放时间(作为总时间的百分数)的图。
图2是样品暴露于0ppmNO或400ppmNO时得出的ADP诱导的犬血小板聚集曲线。
图3是吸入NO对犬血小板聚集的作用的剂量反应数据图。
图4是将对照组大鼠；暴露于20ppmNO达两周的大鼠；暴露于80ppm NO达两周的大鼠；暴露于80ppmNO达一周，然后呼吸一周空气的大鼠的内膜/血管中层之比进行比较的图。星号表示数值与基线有显著差异(p＜0.05)。
发明详述血栓形成本发明提供了治疗、抑制或预防哺乳动物，如人体血管血栓形成的简单、迅速、具选择性且有效的方法。被治疗、抑制或预防的血栓形成可由各种导致血栓形成的原因造成。例如，血栓形成的类型可为创伤后的动脉血栓形成。血栓形成可在哺乳动物体内的任何部位。例如，血栓形成可处于动脉、静脉、冠脉、大脑、股、肾脏或胎盘。较好的是，被治疗、抑制或预防的血栓形成的部位不在肺部。
冠状血栓形成常常与急性冠状动脉局部缺血综合征有关。任何与血栓形成有关的急性冠状动脉局部缺血综合征可通过施用本发明涉及的吸入NO来治疗、抑制或预防。与血栓形成有关的急性冠状动脉局部缺血综合征可能与，如动脉闭塞疾病或血管介入操作有关。与血栓形成有关的急性冠状动脉局部缺血综合征包括，但不限于，心肌梗死、不稳定型心绞痛、冠状血管再通后的血栓形成和冠状血栓溶解后再闭塞。冠状血管再通可通过各种已知的血管介入操作，如通过PTCA、激光血管成形术、冠状动脉分流移植、冠状动脉粥样病变切除术或冠状动脉斯脱滕特固定模来进行。
根据本发明，可给被诊断患有血栓形成的哺乳动物施用NO的吸入。已知哺乳动物，特别是人，可以显示与血栓形成存在有关的各种体征和症状，从而可被诊断。这类体征和症状的识别属于医学领域的范畴。病人的血栓形成的体征和症状包括，但不限于，胸痛、呼吸局促、麻痹、肢体痛、心肌梗死、心绞痛、不稳定型心绞痛、逐渐增强型心绞痛、局部缺血性心力衰竭、心原性休克、外周血管疾病和肢体局部缺血。在本发明一个较好的技术方案中，上述的哺乳动物是发生血栓形成的人体，通过吸入NO治疗的血栓形成为心肌梗死。
另外，也可用吸入NO来抑制或预防没有血栓形成但认为有发展成血栓形成的危险的哺乳动物血栓形成的出现。已知某些病情，如动脉粥样硬化使个体有形成血栓的危险。另外，某些血管介入操作，如气囊血管成形术和冠状动脉分流手术会使个体有形成血栓的危险。因此，被诊断患有会增加血栓形成危险的疾病的个体、经受了一种或多种血管介入操作的个体，和即将进行一种或多种血管介入操作的个体，可有利地用本发明的方法进行治疗。
相似的是，上述的哺乳动物可为有出现血栓形成的危险的人体，该危险与动脉闭塞性疾病，如动脉粥样硬化是有关联的。患这类疾病的个体可由医学相关领域的医生来判定。
在本发明另一个较好的技术方案中，危险与诸如血管成形术的血管介入操作有关。在更好的技术方案中，上述的哺乳动物是经过PTCA操作造成的有血栓形成危险的人体。
动脉再狭窄本发明提供了治疗、抑制或预防由内膜过度增生造成的动脉再狭窄的简单、迅速、有选择性的有效方法。内膜过度增生和动脉再狭窄常发生在诸如任何血管(如颈动脉、股、冠状等)成形术的血管介入操作之后；或在任何冠状血管再通术，包括气囊血管成形术、激光血管成形术、冠状动脉分流移植术、动脉粥样病变切除术或冠状动脉斯滕特固定模后发生。
可施用本发明的吸入NO来治疗上述已有动脉再狭窄的哺乳动物。已知这些哺乳动物具有与动脉再狭窄存在相关的体征和症状，从而可进行诊断。这类体征和症状由医学领域的人员来识别。哺乳动物中动脉再狭窄的体征和症状包括，但不限于胸痛、呼吸局促、心电图改变和冠状血管造影所见。吸入NO来治疗已存在的动脉再狭窄的目的是降低已再狭窄的脉的内膜厚度，以增加动脉腔的直径，即减少病理性狭窄。
另外，根据本发明，可使用吸入NO以抑制或预防没有动脉再狭窄但被认为有形成动脉再狭窄危险的哺乳动物(如人)的动脉再狭窄。某些血管的介入操作，如，PTCA和冠状分流手术会导致动脉创伤。已知动脉创伤会引起内膜过度增生和动脉再狭窄。因此。这些操作会使病人有出现动脉再狭窄的危险。因此，经受了一个或多个血管介入操作的个体和即将进行一种或多种血管介入操作的个体，可有利地用本发明的方法进行治疗。
可给准备进行血管介入操作的病人吸入NO。可在血管介入操作之前吸入NO以使一般与血管介入操作相关的动脉创伤之后发生的内膜增厚的数量达到最小。在血管介入操作之前吸入NO作为预防性措施的病人可以有也可以能没有动脉再狭窄。另一个方法是，可给已进行血管介入操作的病人吸入NO。在该情况下，较好的是在血管介入操作数小时内开始吸入NO。当然，该技术领域的人员认为吸入NO可在血管介入操作之前、期间和之后进行。不论是在操作前、期间或之后，或在所有的三个阶段吸入NO，均可连续或间歇地吸入NO。
给予吸入的NO较好的是用储存的、压缩NO气源给予吸入的NO。可从市售的供应者，如Airco(美国新泽西)得到市售的压缩NO气体，典型的是在纯N2气中200-800ppmNO的混合物。NO源可为100％NO、或被N2或任何其它惰性气体(如氦)稀释。很重要的是得到及储存没有任何污染的O2或其它较高级氮氧化物的混合物，因为较高级的氮氧化物(它们可通过O2与NO反应来形成)对肺组织是潜在有害的。需要时，在给予病人前用已知的方法以化学发光分析来显示NO的纯度。化学发光NO-NOx分析器可购得(如，14A型，Thermo EnvironmentalInstruments，美国马里兰)。NO-N2混合物可通过例如先前经肺活量计校正的转子流量计与空气或O2混合。呼吸混合物中NO的最终浓度可用该技术领域公知的化学或化学发光技术来确证(如，Fontijin等，分析化学(Anal.Chem.)42575(1970))。另外的方法是，通过电化学分析器来监测NO和NO2浓度。通过暴露于NaOH溶液、baralyme或碱石灰可以分离出诸如NO2的杂质。作为另一种控制，也可分析最终气体混合物的FiO2。需要时，可以在换气机的呼气出口处加上气体捕集器以保证不会有明显数量的NO逸入邻近的环境。
在住院部或急诊室内，这样给予NO气体例如N2中的压缩NO的容器与氧气或氧气/N2混合物的第二个容器可被连接到吸入器，使之能混合来自两个气源的气体；控制每一气源的气体流量，可将病人吸入的NO浓度保持在最佳水平。NO气体也可用标准的低流量混合器(如，Bird Blender，美国加利福尼亚)与室内的空气混合。通过使用电NO生成器可从N2和O2(即空气)中产生NO。这类生成器如Zapol的美国专利申请07/850,383(已得到授权通知书)所述，这里引证供参考。另外，NO可间歇地由吸入器提供。若配合NO，口服或吸入地给予磷酸二酯酶抑制剂时，使用吸入器尤为有利。
可用空气、纯氧或另一合适的气体或气体混合物以0.1ppm-300ppm浓度的NO按需要的持续时间给予被诊断患血栓形成或动脉再狭窄的哺乳动物，或被诊断为有形成血栓或动脉再狭窄危险的哺乳动物。较好的浓度为1.0ppm-200ppm；最好的浓度为20ppm-100ppm(如，30ppm，40ppm，50ppm，60ppm或80ppm)。当需要即刻出现明显效果时，短时间里可暂时增加浓度如5分钟里浓度为300ppm NO。由于下面解释的原因，同时用磷酸二酯酶抑制剂处理可降低所需的NO的总剂量(或允许间歇给药)以产生令人满意的抗血栓或抗再狭窄作用。
为了治疗、抑制或预防动脉再狭窄，对于长期如使用数天或数周，可以通过鼻管、面罩、帷幕、气管内导管给予吸入的NO。可以在长时间里连续给予吸入的NO，另外，也可在长时间里间歇地给予。可通过自发换气或机械换气给予气态NO。
对吸入NO的作用的评价当吸入的NO被用来治疗、抑制或预防血栓形成或动脉再狭窄时，需要监测NO吸入的作用。这类的监测可用于具体的个体以证实其所需要的作用和不良的副作用。这类监测也可用来给给定的个体调节剂量水平、吸入NO的持续时间和频率。
较好的是，吸入NO对病人的作用通过下列一种或多种方法来评价临床表现，如胸痛；心电图；用超声波、冠状血管造影或其它方法对血管开放情况的一系列分析；以及血浆或血小板中cGMP水平的上升。
磷酸二酯酶抑制剂通过与分子氧反应可使NO迅速分解产生亚硝酸盐和硝酸盐。另外，NO进入血液后通过与血红蛋白紧密结合而迅速失活。由于这些原因，NO在动脉血中的半衰期很短。这表明吸入NO可有利地避免全身血管扩张，这是一种与从NO供体化合物缓慢地全身释放NO有关的不希望的有潜在危险性的副作用。
可能需要在靶细胞或与肺部靶细胞相互作用的细胞里延长吸入的NO的有益作用。在血栓形成抑制、预防和治疗中，循环的血小板是靶细胞。在动脉再狭窄抑制、预防和治疗中，循环的血小板(可能还有白细胞)是与血管中靶细胞相互作用的细胞。
为了确定如何延长吸入的NO的有益作用，有用的是考虑NO的体内作用是溶解的鸟苷酸环化酶的活化，它刺激了鸟嘌呤-3’，5’-环单磷酸酯(cGMP)的产生。NO的至少一些有益作用是由NO刺激cGMP生物合成而产生的。因此，在本发明较好的技术方案中，配合NO的吸入给予磷酸二酯酶抑制剂，以抑制由于内源性磷酸二酯酶而使cGMP分解。
磷酸二酯酶抑制剂可通过任何合适的方法，包括通过口服、透粘膜给予、静脉注射、肌注、皮下注射或腹腔内注射途径引入哺乳动物。另外的方法是，抑制剂可通过吸入给予哺乳动物。对于吸入，磷酸二酯酶抑制剂可有利地被制成干燥粉末或气溶胶化的溶液，其颗粒或液滴大小少于10微米以能最佳地沉积于肺泡中，并可任意地在含NO的气体中被吸入。
较好的磷酸二酯酶抑制剂是ZaprinastTM(M&B 22948；2-邻-丙氧基苯基-8-氮杂嘌呤-6-酮；Rhone-Poulenc Rorer，英国)。ZaprinastTM选择性地抑制cGMP水解，而对血管平滑肌细胞中cAMP的分解作用极小(Trapani等，药理学与实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)258269(1991)；Harris等，药理学与实验治疗杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther.)249394(1989)；Lugnier等，生化药理学(Biochem.Pharmacol.)351743(1986)；Souness等，英国药理学杂志(Br.J.Pharmacol.)98725(1989))。当根据本发明使用ZaprinastTM时，较好的给药途径是静注或口服。合适的剂量范围由该技术领域的人员决定。可制备在0.05NNaOH中的ZaprinastTM储备溶液。然后储备溶液可在使用前即刻用Ringer氏乳酸盐溶液稀释到所需的最终ZaprinastTM浓度。
本发明可用其它磷酸二酯酶抑制剂来实施。各种磷酸二酯酶抑制剂是该技术领域已知的，包括双嘧达莫(dipyridamole)和茶碱。像ZaprinastTM一样，给药途径和合适的剂量范围由该技术领域的人员来决定。
配合NO吸入的其它抗血栓剂可用抑制血栓形成的药物，刺激血栓溶解的药物，或两者兼有的药物来治疗血栓形成。抗血栓药物的例子是阿司匹林、链激酶、尿激酶、组织纤维蛋白溶酶原活化剂(“t-PA”)、met-t-PA(即具有N-末端甲硫氨酸残基的t-PA)、FE1X(t-PA类似物)肝素、水蛭素和HirulogTM(水蛭素的类似物)。其它抗血栓剂也可用来实施本发明。在用吸入NO的治疗前、期间和治疗后可给予一种或多种这类抗血栓剂，结果它们独立的抗血栓活性有利地增加了吸入的NO的抗血栓作用。
例如，在本发明的一个技术方案中，在吸入NO前、期间和吸入NO后即刻给予适当剂量t-PA以治疗血栓形成。虽然吸入NO可抑制或预防新血栓的形成，但t-PA可刺激下列血栓的溶解(1)在吸入NO时已经存在的血栓，或(2)在NO吸入时和刚吸入后形成的血栓(虽然其形成速度降低)。选择合适的抗血栓剂以配合吸入的NO，这些抗血栓剂的合适剂量和给药途径由该技术领域人员决定。
在本发明的较好技术方案中，在NO吸入前、期间和吸入后即刻给予阿司匹林以治疗血栓形成。较好的阿司匹林剂量范围是每天81-325毫克(口服)。
已经分别解释了本发明的两个方面(即，血栓形成和动脉再狭窄)，它也应适用于已经有或将有血栓形成和动脉再狭窄的危险的个体。在这样的条件下，本发明的两个方面可在同一个体中单独给予吸入的NO来同时实施。
实验信息血栓形成实验NO的抗血小板作用已经在认可的血栓形成后急性冠状血栓溶解的犬模型中得以评价。所用的犬模型基本如Yasuda等(美国心脏病联合会杂志(J.Am.Coll.Cardiol.)131409(1989))和Gold等(循环(增刊IV)(Circulation，suppl.IV)83IV26(1991))所述。
使25只两种性别兼有的成年杂种狗(20～25kg)用戊巴比妥(30mg/kg体重)麻醉。按需补充给予戊巴比妥以保持全身麻醉状态。给狗的支气管插管，用FiO2为21-35％的换气机(Hudson Ventronics，美国加利福尼亚)以15次呼吸/分钟和10-15毫升/kg给它们的肺部进行机械换气，调节以保持动脉血中O2在80-100mmHg。实验中用脉冲血氧计(Nellcor，Inc.，美国加利福尼亚)来连续监测氧饱和度。
股动脉和静脉用聚氯乙烯导管插入以连续地测量动脉压、取血样和输注。发生心律失常时给予利多卡因0.1mg/kg/分钟滴注。经左第五肋间进行胸廓切开术。打开心包并悬挂制成心包支架。解剖游离左前降动脉，分离出远离第一斜支的2.5cm片断。抽取1毫升血供形成血栓。将0.7毫米内径的导管插入分离的左前降冠状动脉片断的侧支，将超声流量探头(T101Transonic System，Inc.，美国纽约州)冠状放在动脉的近端以连续地监测血流。用2毫米宽的塑料线(Mass Gas andElectric Supply，美国马里兰)逐渐收缩地绕于左前降动脉正好为准备形成血栓的部位的远端，将血流量限制于50±10％的基线。以前的血管造影术研究显示这将使腔直径降低90％以上。
分离的左前降冠状动脉通过用钝的镊子在3-5秒期间进行四次连续的外压造成创伤，以损伤内皮并促进血栓粘附。在探头的远端和接近收缩部位处形成套圈式闭塞。通过侧支导管将凝血酶(0.1ml 100单位/毫升；Thrombinar，ArmourPharmaceutical，美国伊利诺斯)与0.3毫升血液的混合物注射入空的冠状动脉片断以诱导血栓形成。10分钟后，松开近端的套圈。2分钟后，松开远端的套圈。血栓形成后10分钟，静脉推注肝素(75UI/kg)，然后连续用肝素输注(50UI/kg/小时)。稳定的闭塞30分钟之后，每隔15分钟给予重组体t-PA(0.45mg/kg；ActivaseTM，Genentech Inc.，美国加利福尼亚)，直到血栓化的冠状动脉再通，或最多给予四次推注。
左降冠状动脉初次再流动之后，以该操作诱发几个交替的再通和再闭塞(定义为低于25％狭窄后流量)阶段。记录开放时间/总时间的比值作为原始的结果变量。连续记录心电图、全身动脉血压、左心房压和冠状血流。(1)没有再灌注的动物，(2)没有闭塞的再灌注动物，(3)在最初45分钟观察阶段少于3个周期的动物，或(4)在第一观察阶段结束前死亡的动物，被排除在进一步研究之外。
用标准低流量混合器(Bird Blender，美国加利福尼亚)使NO气体(在氮气中含800ppmNO，Airco，美国新泽西)与室内空气混合，然后调整NO的量，以在送入换气机之前保持FiO2恒定。吸入的NO水平用化学发光NO-NOx分析器(14A型，Thermo Environmental Instruments，美国马里兰；Fontijin等，同上)连续监测。在含NO的气体混合后，测量远离储袋处的FiO2(氧定量计5590号，Hudson，美国加利福尼亚)。呼出的气体以及从化学发光分析器排出的气体通过使用由实验室中央真空系统维持负大气压的文丘里呼气捕集器来捕集。间歇地用化学发光法测量的环境NO/NOx水平在实验期间并不增加。每次取出样品并测量正铁血红蛋白水平。监测心率、血压和冠状流量。并连续记录。
经45分钟基线研究之后(预处理阶段)，将动物分成四组组A(n＝6)给予0ppm NO吸入(即空气)达45分钟；组B(n＝6)给予20ppmNO吸入达45分钟；组C(n＝6)给予80ppmNO吸入达45分钟；组D(n＝6)给予200ppm NO吸入达45分钟。所有各组动物然后再进行第三阶段观察，以停止给予NO开始，持续45分钟(处理后阶段)。
体外测量血小板聚集来自8只狗的血液被收集在0.01M柠檬酸盐中，在室温下以370×g离心5分钟，以制备富血小板血浆(PRP)，在1200×g下离心10分钟以制备乏血小板血浆(PPP)。在试验时PRP仅暴露在塑料容器中或硅烷化的玻璃器皿中。通过用PPP稀释来调节PRP的血小板计数(Thrombocounter CTM血小板计数器，Coulter Electronics，Inc.美国弗罗里达)以达到300,000/mm3±10％。PRP然后取数分放置小杯中，同时在双通道集合度计器(440型，Chrono-Log Corp.，美国宾夕法尼亚)中于磁力搅拌下于(1000rpm)、37℃培养。在记录器(707型，Chrono-Log Corp.，美国宾夕法尼亚)上连续记录透光度。聚集的样品管用橡皮塞塞住，经过该塞子放两支19号针头(Sherwood Medical，美国密苏里)，使NO气体和氧气的混合物能送至PRP之上入口针头经流量计与气体储器连接，在气体储器中送入如上所述中调整的NO气、空气和氧气的混合物。用化学发光NO-NOx分析器连续监测NO浓度。调节针阀使通过样品的流量约为40毫升/分钟。通过将出口针头与充有5厘米水的接受烧瓶连接来保持系统具有正压，水中保持不断鼓泡。
ADP诱导的血小板聚集测定研究是在含450微升已调好的PRP的试验小杯暴露于NO气体混合物达10分钟后进行的。在测量ADP诱导的聚集期间连续给予气体。以随机的次序，用20、80、200和400ppmNO处理的不同PRP来研究血小板聚集。在给予NO之前和之后进行不暴露于NO的对照的ADP诱导的血小板聚集研究以评价PRP制剂的稳定性。所有的实验在血样收集后4小时内完成。
数据分析动脉开放的定义是造成最初的狭窄之后，流量大于25％基础流量的时间占总的观察时间的分数。除非另作说明，结果被表达成平均值±SEM。组之间差异的显著，对于成对或不成对的值用Student的t-试验确定。NO对ADP诱导的血小板聚集的作用的剂量反应的显著性用方差的双向分析评价。p值＜0.05被认为具显著性。
狗的血栓溶解和再灌注模型的结果在每个实验组中，外部收缩使左前降动脉血流减少基线的54±2％，从22±2减少到10±1毫升/分钟。为达到再灌注所需的tPA推注次数的中位数为2，范围是1-4(表1)。除了一个没有发生再闭塞之外，在其它所有动物中周期性的再流动和再闭塞伴随着心电图出现心肌损伤的迹象；未发生再闭塞的动物被排除在进一步的研究之外。
表1生理参数的基线值
表1中“tPA推注次数”指推注的次数；“ACT”指激活凝血时间；“FiO2”指吸入的O2分数；“比率”指基线时冠状动脉的比值未闭塞/闭塞；“血小板计数”指血小板的数目；“MetHb”指正铁血红蛋白(总血红蛋白的百分数)。在吸入NO 0ppm(对照)、20ppm、80ppm和200ppm时的基线流速比没有显著差异(每组n＝6)。
吸入NO对动脉开放的作用吸入0ppmNO(组A)的动物中，在三个处理阶段动脉的开放没有改变(图1A)。吸入20ppmNO(组B)的动物中，动脉开放从吸入NO前的基线阶段的50.6±6.9％增加到吸入阶段的63.8±7.9％(p＜0.01)(图1B)。在吸入80ppmNO的动物中(组C)，动脉开放从吸入前基线阶段的48.8±2.9％增加到吸入阶段的75.1±6.7％(p＜0.01)(图1C)。在吸入200ppmNO的动物中(组D)，动脉开放从吸入前基线阶段的45.27±5.6％增加到吸入期的54.8±10.4％(p＝不显著)(图1D)。组C中观察到的NO吸入阶段的动脉开放增加持续到吸入后阶段的45分钟(70.1±7.1％对基线，p＜0.05)。
在汇集组B、C和D的吸入阶段的动脉开放结果时，汇集的处理组和对照组之间有统计上显著的差异(p＜0.005)。在汇集组B、C和D吸入后45分钟阶段动脉开放的结果时，汇集的处理组和对照组之间也有统计上显著的差异(p＜0.005)。
每组动物的血小板计数和血红蛋白在吸入NO的期间和之后都没有改变(表3)。在吸入200ppmNO的狗的呼吸中，正铁血红蛋白水平从0.2±0.1％增加到1.1±0.4％(表3)。在停止给予NO后该增加仍然持续，给予低剂量NO的狗没有这种现象。
在该研究中所有组的狗的全身动脉压都下降，吸入或没有吸入NO的狗之间没有差异(表2A)。在整个研究过程中所有组动物的左心房压都没有改变(表2B)。
表2A在吸入NO前、期间和吸入后的平均全身动脉压(SAP)(mmHG)
数值被表示成平均值±SEM。
表2B在吸入NO前、期间和吸入后的平均左心房压(LAP)(mmHG)
数值被表示成平均值±SEM。
NO对ADP诱导的体外血小板聚集的作用向PRP之上的气体混合物加入20、80、200和400ppmNO，使ADP造成的透光度的最大变化产生了剂量相关性的下降(图3)每一研究开始和结束时进行的两条对照聚集曲线的ADP诱导的光的透光度的下降没有改变(30.57±5.5％相对31.1±4.31％)。
表3在吸入NO前、期间和吸入后的血红蛋白值
上述结果显示吸入NO在溶解了关键的狭窄部位的血栓之后增加了冠状动脉的开放，但不产生任何全身性的血液动力学作用。它们也显示吸入NO的抗血栓作用在停止吸入NO后可至少持续45分钟。在相似于体内所达到的NO浓度之下，气体NO明显抑制了体外的ADP诱导的血小板聚集。
内膜增生实验新生内膜平滑肌细胞增生是人体动脉再狭窄的主要病理机制。因此，为了阐明吸入NO对血管介入操作如PTCA后的再狭窄的作用，现用大鼠颈动脉的动脉损伤模型来研究吸入NO对内膜增生的作用(Clowes等，实验室研究(LaboratoryInvest.)，49372(1983))，这是对于人体新生内膜平滑肌细胞增生的标准的动物模型。
动脉损伤用以前证明会引起新生内膜增生的方法(Clowes等，同上)使成年雄性Sprague-Dawley大鼠(charles River Laboratories，MA)颈动脉产生气囊损伤。通过腹腔内注射氯胺酮(60-80mg/kg)和乙酰丙嗪(0.1mg/kg)使体重300-350克的大鼠麻醉。一旦得到满意的麻醉效果，作纵向中线切开，用钝器解剖法分离左颈动脉。进一步仔细解剖出颈内和颈外动脉的分支点，颈外动脉的远端用4-0号丝线结扎。用微型解剖剪刀对颈外动脉作动脉切开术，通过动脉切口插入2French Fogarty气囊导管(Baxter Edwards LIS)，推进到在颈动脉分支点之下2厘米处。气囊用足量盐水充盈使颈总动脉可见到膨胀，并慢慢退出到分支水平。然后除去气囊导管，允许经动脉切开位点反向出血(bak bleeding)以消除潜在的血栓和空气泡之后，在动脉切开点近端用4-0号丝线结扎颈外动脉。肉眼检查以保证颈总动脉有充分的搏动后，缝合手术口让动物从麻醉状态恢复正常。
慢性吸入NO在特别制备的40升丙烯酸吸入室内进行NO慢性吸入。用对氧气、加压的空气和NO储存气体(在N2中的800ppm和10,000ppmNO，美国新泽西)分开调节和校准的流量计来混合气体混合物。在整个实验阶段定期分析来自该吸入室的气体以保证稳定的FiO2和NO水平。用极谱电极(Hudson Oxygen Meter 5590，美国加利福尼亚)测量FiO2；通过化学发光(型号14A，Thermo Environmental Instruments，Inc.，美国马里兰)测量NO浓度；在通过加热的不锈钢炉(850℃)以98％的效率将NOx转化为NO(型号100B NOx发生器，Thermo Environmental Instruments，Inc.，美国马里兰)之后，二氧化氮和较高氧化态的氮(NOx)用化学发光测量。在吸入室内保持新鲜的碱石灰以减少NOx。根据实验将NO浓度保持在20-80ppm。一系列测量表明FiO2是21％，NOx是3-4ppm。存在在暴露室内的气体和从化学发光装置中排出的气体，用以实验室中央真空系统保持负大气压的文丘里捕集器来捕集。
对照动物被放在与NO处理动物相同的室内的带过滤器的笼子内。在手术操作前30-120分钟开始暴露于NO。在手术操作期间，将NO处理组从吸入室取出，并通过来自吸入室的流入气体管进气的改良的面罩来暴露于NO。吸入气体的分析表明，在80ppm实验中NO水平取出为50-80ppm，在20ppm手术实验期间为10-20ppm。每只动物从吸入室中处于面罩下的总的时间范围为20-40分钟。
形态测定分析气囊损伤后1、3和14天后用致死量的戊巴比要钠或氯胺酮经腹腔注射来处死大鼠。将16号导管通过左室尖端引入升主动脉。结扎降胸主动脉。然后在100mmHg压力下用100毫升生理盐水、再用50毫升2％在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的聚甲醛灌注动物。体内固定15-30分钟后，分离出两个颈总动脉，通过浸在1％PBS中的聚甲醛中过夜来进一步固定。接着用连续增加的乙醇浓度然后是二甲苯使组织脱水，接着包埋在石蜡中。切下横切面(6微米)，用苏木精和曙红和/或弹性蛋白染色以供分析。每个动物邻近颈动脉分支点的7-8毫米取一个切面用于分析。被分析的切面以100×进行照相。用Kodak 2135TN扫描器使图像数字化。在Power Macintosh 8100/80TM计算机上用公共流通NIH图像程序(U.S.National Institutes of Health的Wayne Rasband编写，可得自互联网Iippy.nimh.nih.gov(按无名文件传输协议)或NTIS，5285的软盘(美国弗吉尼亚)；材料号PB93-504868)进行内膜和血管中层面积的分析。由对实验组不了解的研究进行形态测定分析。
统计学分析用市售的StatviewTM(Abacus Concepts)软件在MacintoshTM计算机上进行统计学分析。用不成对的双尾t-试验对实验组与对照组进行比较。p＜0.05被认为统计学上显著。所有的数据被表示成平均值+/-SEM。n值指每组动物数。
啮齿类再狭窄模型的结果使总共62个大鼠经过颈动脉损伤操作。5只大鼠在动脉切开术中或气囊损伤时因血管并发症而死亡，操作的死亡率为8％。在不同实验组间未见有统计学意义的死亡分布失常。在最初操作中存活的57只大鼠在操作后没有死亡。在整个实验阶段，所有的大鼠，不论其所属的实验组，都有正常的饲养行为和活动水平。除了颈动脉损伤一侧偶见下垂，大鼠都没有显示肉眼可见的神经缺陷。分析实验组的各动物表明暴露于空气、20ppmNO和80ppmNO对体增加没有统计学上的差异。
在第一系列实验中，进行颈动脉气囊损伤的大鼠在整个实验过程中或被暴露于周围空气(n＝12)或被暴露于有80ppmNO的空气(n＝13)。于损伤后14天杀死动物对受损伤的颈动脉进行形态测定分析。光学显微镜检查表明来自空气(对照)组的3只大鼠和来自NO处理组的1只大鼠在受损伤的颈动脉腔内显示血栓闭塞。这些动物被排除在进一步的分析之外。如所预期，来自两组的血管显示了上皮的缺失，并产生了新的内膜增生。用光学显微镜没有发现新生内膜细胞形态学上质的差异(数据未显示)。但是，定量分析发现，吸入80ppmNO对新生内膜增生有38％的抑制，即，与0ppmNO(对照，1.512+/-0.147)动物相比，80ppm动物的内膜/血管中层之比为0.932+/-0.13(p＝0.008)(图4)。
在下一系列的实验中，试验了暴露于N01周的作用。在杀死动物前将实验组(n＝7)暴露于80ppmNO 7天，然后转移到空气中再7天。对照组(n＝5)在空气中暴露整整14天。组之间没有形态上质的差异。另外，定量分析内膜/血管中层比值表明两组之间的新生内膜增生没有显著的差异，即与1.217+/-0.309的对照组相比，NO处理动物为1.059+/-0.239(p＝没有意义)(图4)。
在第三系列实验中，研究低剂量吸入NO大鼠吸入20ppmNO(n＝8)或空气(n＝8)。在2组之间没有发现新生内膜增生程度有质或量的差异，即与吸入空气的对照组内膜/血管中/之比为0.985+/-0.149相比，20ppmNO处理的动物为0.917+/-0.233(p＝没有意义)(图4)。
上述结果显示在2周内吸入80ppmNO会明显抑制啮齿类动物在气囊诱导颈动脉损伤后新生内膜的增生。
本发明的其它技术方案被下列权利要求所揭示。
权利要求
1.气态NO在制备用于治疗或预防由内膜过度增生造成的哺乳动物动脉再狭窄药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中治疗或预防是采用包括下列步骤的方法(a)诊断出有动脉再狭窄或有形成动脉再狭窄的危险的哺乳动物；以及(b)让所述的哺乳动物吸入治疗有效浓度的气态NO。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的哺乳动物为人体。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的哺乳动物已经经受或准备经受血管介入操作。
5.根据权利要求4所述的应用，其中所述的血管介入操作选自血管成形术、冠状动脉手术和冠状动脉斯滕特固定模。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述的操作是经皮经腔冠状血管成形术(PTCA)。
7.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的NO按预定浓度范围吸入。
8.根据权利要求7所述的应用，其中所述的浓度范围是0.1ppm-300ppm。
9.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的气态NO以包括NO、O2和N2气的混合物吸入。
10.根据权利要求9所述的应用，其中所述的混合物包括按体积计，20％-99％的O2气。
11.根据权利要求9所述的应用，其中所述的O2与所述的NO在所述的混合物被哺乳动物吸入之前即刻混合。
12.根据权利要求1或2所述的应用，它进一步包括为了配合NO的吸入，给所述的哺乳动物施用治疗有效量的、可增强气态NO治疗作用的第二个化合物的步骤。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述的第二个化合物选自磷酸二酯酶抑制剂和超氧化物歧化酶。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述的磷酸二酯酶抑制剂选自2-邻-丙氧基苯基-8-氮杂嘌呤-6-酮(ZaprinastTM)、双嘧达莫(dipyridamole)和茶碱。
15.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述的气态NO在不吸烟的情况下吸入。
全文摘要
本发明揭示了治疗、抑制或预防哺乳动物血管血栓形成或动脉再狭窄的方法。所揭示的方法包括给哺乳动物吸入治疗有效量的气态氧化氮(NO)。也揭示了包括配合吸入NO,施用下列类型药剂的方法:能增强吸入NO有益作用的化合物,能补充吸入NO有益作用的抗血栓剂。附图是比较对照大鼠,暴露于20ppmNO达2周的大鼠,暴露于80ppm达1周然后在空气中暴露1周的大鼠的内膜/血管中层比率的图。星号表示与基线值有显著差异的值(p< 0.05)。
文档编号A61P9/08GK1174513SQ96191929
公开日1998年2月25日 申请日期1996年2月8日 优先权日1995年2月16日
发明者W·M·扎波尔, K·D·布洛克 申请人:总医院有限公司