专利名称：白细胞介素－12对血管生成的抑制作用的制作方法
技术领域：
本发明涉及由有害的血管生成所引起的疾病预防。更具体地说，本发明涉及白细胞介素-12(IL-12)在预防有害的血管生成的药物制备中的用途，特别是用于治疗血管生成依赖的或与血管生成有关的疾病。
白细胞介素-12(IL-12)以前曾被称为天然杀伤细胞刺激因子(Kobayashi M，et a1.，J.Exp.Med.170827-845，1989)和细胞毒淋巴细胞成熟因子(Stern A.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876808-6812，1990)，它在多种鼠肿瘤模型中具有有效的抗肿瘤和抗肿瘤转移的活性(Brunda M.j.etal.，J.Exp.med.1781223-1230，1993；Nastala C.L，et al.，J.Immunol.153；1697-1706，1994)。尽管IL-12发挥其抗肿瘤作用的机理尚不完全清楚，人们已知道IL-12在体外能对自然杀伤细胞及T细胞产生多种生物作用(Manetti R.，et al.，J.Exp.Med.1791273-1283，1994；Wu C.Y. et al.，J.Immunol.1511938-1949，1993；Tripp C.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA903725-3729，1993；Seder R.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9010188-10192，1993；Bloom E.T.，et al.，J.Immunol.1524242-4254，1994；Cesano A.，et al.，J.Immunol.1512943-2957，1993；ChanS.H.，et al.，J.Immunol.14892-98，1992)。IL-12对细胞毒T淋巴细胞的活化作用在抗肿瘤活性中起着决定性的作用(Brunda M.J.，etal.J.Exp.Med.1781223-1230，1993)。IL-12的部分抗肿瘤活性保持在严重联合免疫缺陷(SCID)及光秃小鼠中，这两者均为T细胞缺陷，在CD8衰竭的胸腺机能正常的小鼠中也是如此(Brunda M.J.，et al.J.Exp.Med.1781223-1230，1993；O′Toole M.，et al.J.Lmmunol.150294A 1993)。这些结果证明，IL-12对鼠肿瘤具有有效的体内抗肿瘤和抗肿瘤转移的作用，也证明了CD8+T细胞对引发抗皮下肿瘤具有关键作用。
本发明提供了白细胞介素-12在药物制备中的用途，该药物可有效抑制有害的血管生成。据观察IL-12在体内可抑制多种肿瘤，但在体外对肿瘤细胞没有直接作用。此外，在T细胞缺陷的小鼠中，IL-12的抗肿瘤活性没有完全消失，这提示IL-12具有抗血管生成的性质。IL-12诱发强烈抑制新血管形成的作用。该作用不是通过免疫系统的特异细胞类型产生的。在IL-12的抗血管生成作用中，γ干扰素(IFN-γ)起到关键的传递介质作用。IL-12的抗血管生成的惊奇作用是精确设计一些治疗方案的核心，该治疗方案包括其与新血管形成的其它抑制剂共同给药的方案。
其次，本发明提供了白细胞介素-12在药物制备中的用途，该药物用于治疗由有害的或失控的血管生成所引起的疾病，特别是用于抑制由这种有害的或失控的血管生成所引起的新血管形成，尤其是视网膜/脉络膜新血管形成。本发明另一目的是用于治疗与糖尿病的视网膜病有关的视网膜/脉络膜新血管形成，或者与黄斑变性有关的视网膜/脉络膜新血管形成。
本发明的又一目的是提供了白细胞介素-12在药物制备中的用途，该药物用于治疗由失控的血管生成引起的疾病，该疾病是角膜新血管形成。
本发明还有一个目的是提供了白细胞介素-12在制备治疗糖尿病的视网膜病和黄斑变性药物中的用途。
本发明进一步包括白细胞介素-12在治疗由有害的或失控的血管生成所引起的疾病的药物制备中的用途。其中的疾病来源于固体肿瘤或血源性肿瘤及它们的转移瘤。
本发明还有一个目的是提供了白细胞介素-12在药物制备中的用途，该药物用于治疗各种类型的增生性玻璃体视网膜病，无论是否与糖尿病有关。
上述这些药物可含有一种或多种附加的血管生成抑制剂。
白细胞介素-12及其在治疗上述疾病中的用途是本发明的一部分内容。而且，本发明还包括白细胞介素-12，或其与一种或多种附加的血管生成抑制剂结合起来在治疗上述疾病中的用途。附图的简要说明
图1基因重组的鼠白细胞介素-12对bFGF诱发的鼠角膜新血管形成的作用。这些照片代表作为载体(对照)用的或经IL-12治疗的C57BL/6和SCID小鼠的角膜在植入基础纤维细胞生长因子小丸(P)后5天时的情况。在对照组的角膜中有明显新血管生成，而经IL-12治疗的角膜几乎看不到血管应答。(注意到SCID小鼠预先存在有虹膜血管，由于其虹膜着色不足，通过角膜能看见该虹膜血管。因此，IL-12治疗组中所见到的血管是在该虹膜同一平面上，并不是由基础纤维细胞生长因子诱发产生的角膜血管。)图2基础纤维细胞生长因子小丸植入C57BL/6小鼠后5天时的血管生成应答。由载体(21只角膜)、IL-12(30只角膜)或IL-12的单体混合物(10只角膜)构成的治疗程序如下所述。血管长度以mm计，记录的时间(clock hours)以小时计，以平均值±SEM表示。
图3IFN-γ抗体对小鼠角膜新血管形成的IL-12诱发抑制作用。如下所述，给雄性C57BL/6小鼠单次腹膜内注射大鼠XMGl.2 IFN-γ抗体或大鼠IgG。在第5天测量血管长度和时间。分别对这两种情况重复本实验，得到类似结果。数据以至少13只角膜的平均值±SEM表示。
图4IFN-γ对基础纤维细胞生长因子诱发的小鼠角膜新血管形成的治疗作用。雄性C57BL/6小鼠在植入小丸当天腹膜内注射IFN-γ药团，或在植入小丸前3天开始连续输注IFN。在基础纤维细胞生长因子小丸植入后5天测量血管长度和时间，结果以每组10只角膜的平均值±SEM表示。
图5IL-12与AGM-1470对Lewis肺癌生长的作用。雄性C57BL/6小鼠在第0天接种Lewis肺癌，在能测量到肿瘤后再用盐水、IL-12或AGM-1470处理。治疗的原始记录和测量过程如下所述。结果由每组4只动物的单次实验得出。
图6IL-12与AGM-1470对Lewis肺癌在肺表面的自发性转移的作用。治疗的原始记录和计算过程如下所述。结果由每组4只动物的单次实验得出。
血管生成是肿瘤及转移瘤生长扩大数毫米直径的主要原因(Folkman J.，N.Engl.J.Med.2851182-1186，1971)。已有的预防肿瘤及转移瘤中新血管发育的方法可有效抑制这些肿瘤生长(Millauer B.，et al.，Nature 367576-579，1994；KimK.J.，et al.，Nature 362841-844，1993)。为确定IL-12是否具有抗血管生成的性质，用一种基础纤维细胞生长因子诱发的小鼠角膜新血管形成模型进行测定。结果表明，IL-12为体内血管生成的有效抑制剂，而且该作用是由IFN-γ介导的。
血管生成是在组织或器管内产生新的血管。在正常生理条件下，人或动物只在非常特殊及有限的情况下才会有血管生成。例如，血管生成通常见于伤口愈合、胎儿及胚胎发育、以及黄体、子宫内膜及胎盘的形成中。对血管生成的控制，就是对血管生成刺激剂与抑制剂的严格限制。已发现控制血管生成可改变某些疾病状态，而且在多数情况下，与疾病有关的病理损伤都涉及失控的血管生成。
控制下的血管生成与失控的血管生成被认为是相似的作用方式。在内皮细胞和周皮细胞外包围着一层基膜，这两种细胞组成了毛细血管。血管生成开始于内皮细胞与白细胞释放的酶侵蚀基膜。然后，排列形成血管腔的内皮细胞伸出基膜。血管生成刺激剂诱导内皮细胞移行穿过受侵蚀的基膜。移行细胞离开母体血管，形成“新芽”，内皮细胞在此进行有丝分裂而增生。内皮新芽彼此结合形成毛细血管袢，从而产生新的血管。在疾病状态下，预防血管生成能避免由于新的微血管系统的侵入而造成的损害。
持续的血管生成见于许多疾病症状中，如肿瘤生长(包括原发瘤与转移瘤)和内皮细胞的异常生长在这些情况下造成可见的病理损伤。因失控的血管生成而发生的多种病理状态已被归入血管生成依赖性的或与血管生成有关的疾病类型中。针对血管生成过程的控制而进行的疗法能使这些疾病痊愈或好转。
由血管生成引起的疾病的实例是眼部新生血管病。该疾病以新血管侵入眼部结构为特征，如视网膜或角膜。这是最常见的致盲原因，而且还涉及20岁左右人的眼部疾病。在与年龄有关的黄斑变性中，伴随而来的视力障碍产生原因在于视网膜色素上皮下方的纤维血管组织增生，引起脉络膜毛细血管生成而致布鲁赫膜缺损。血管生成所造成的损伤也涉及糖尿病的视网膜疾病、视网膜早熟、角膜移植排斥、新血管引起的青光眼、和晶状体后纤维组织形成。其它与角膜新血管形成有关的疾病包括但不限于下列疾病流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、接触性晶状体劳损、特异性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、斯耶格伦综合症、红斑痤疮、phylectenulosis、梅毒、分支杆菌感染、磷脂变性、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染、卡波济肉瘤、莫伦溃疡、Terrien′s边缘变性、边缘角质层分离、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、创伤、Wegener肉样瘤、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊病、periphigoid放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的视网膜病、黄斑变性、镰状细胞性贫血、肉样瘤、梅毒、弹性纤维假黄瘤、佩吉特病、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉阻塞、慢性葡萄膜炎/vitritis、分支杆菌感染、Lyme′s病、系统性红斑狼疮、视网膜早熟、伊尔斯病、Bachets病、感染引起的视网膜炎或脉络膜炎、推定性眼部组织胞浆菌病、Bests病、近视、眼窝、Stargarts病、局部planitis、慢性视网膜脱离、高粘滞性综合症、弓形体病、创伤、和激光照射后引起的并发症。其它疾病包括但不限于下列疾病与潮红有关的疾病(角部新血管形成)和由纤维血管或纤维组织异常增生引起的疾病，包括各种类型的增生性玻璃体视网膜病。另一种疾病是类风湿性关节炎，据认为其中也涉及血管生成。即在关节滑液衬中的血管发生了血管生成。除了形成新血管网以外，内皮细胞还释放因子与反应性氧，引起血管翳生长和软骨损伤。涉及血管生成的因子能主动引起并有助于保养类风湿性关节炎的慢性发炎状态。
与血管生成有关的因子也可引起骨关节炎。有关血管生成的因子对软骨细胞的活化作用导致了关节损伤。其后，血管生成因子会促进新骨的生成。引入预防骨损伤的疗法能终止疾病的发展，并能缓解关节炎病人的痛苦。慢性炎症也涉及病理学上的血管生成。诸如溃疡性结肠炎和节段性回肠炎的疾病状态由于新血管向内生长进入发炎组织，引起组织学上的改变。巴尔通体病是一种在南美发现的细菌感染，它能引起一种以血管内皮细胞增生为特征的慢性症状。另一种有关血管生成的病理学作用见于动脉粥样硬化症。其血管腔内形成的斑块具有刺激血管生成的活性。
最常见的儿童血管生成疾病之一是血管瘤。多数情况下，该肿瘤是良性的并自然消退而无危险性。在较严重的情况中，肿瘤发展成为大的空洞状和浸润性的形式，引起各种临床并发症。多发性血管瘤，即全身性血管瘤，死亡率较高。血管瘤的抵抗疗法尚不能用在目前的治疗中。血管生成造成的损伤也见于遗传性疾病中，如Osler-Weber-Rendu病，或称之为遗传出血性毛细血管扩张。这是一种可遗传的疾病，以多发性小血管瘤为特征，即血管或淋巴管肿瘤。血管瘤见于皮肤和粘膜，并经常伴有鼻出血(鼻衄)或胃肠道出血，有时伴有肺或肝的动静脉瘘。
血管生成在固体瘤的形成与转移中呈隆凸状。已发现血管生成因子与若干种固体瘤有关，如横纹肌肉瘤、成视网膜细胞瘤、尤因肉瘤、成神经细胞瘤、和骨肉瘤。若没有血液供应以提供养分及排除细胞排泄物，肿瘤就不会扩大。血管形成起重要作用的肿瘤包括固体瘤和良性瘤，后者如听觉神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿。预防血管生成能终止这些肿瘤的生长，并终止由于这些肿瘤的存在而对动物造成的损伤。
血管生成与血源性肿瘤、如与白血病有关，以及与各种急性或慢性骨髓肿瘤有关，后者白细胞无限制地增生，这些疾病通常伴有贫血、凝血障碍、和淋巴结、肝、脾肿大。据认为，血管生成在骨髓异常中的作用是引发白血病样的肿瘤。
血管生成在肿瘤转移的两个阶段中都起到重要作用。第一阶段中，血管生成的活化作用是主要的，此阶段肿瘤血管形成，使肿瘤细胞进入血流并循环至全身。肿瘤细胞在离开原发部位并在继发的转移部位稳定下来后，必须进行血管生成才能使新肿瘤生长和扩大。因此，预防血管生成能防止肿瘤转移，并能抑制肿瘤在原发部位的生长。基于对血管生成在肿瘤的维持与转移中作用的认识，能用于预测乳腺癌。原发肿瘤的新血管形成数量的测量是通过计数侵袭性乳腺癌的新血管形成最强区域中微血管密度来进行的。高水平的微血管密度与肿瘤的复发相互关联。通过治疗控制血管生成，有可能使肿瘤不再复发。
正常的生理过程也涉及血管生成，如生殖和伤口愈合。血管生成是排卵的重要一步，也是受精后植入囊胚泡的重要一步。阻止血管生成能用于诱发闭经、阻塞排卵或防止囊胚泡植入。在伤口愈合中，过度修复或过度纤维组织的形成会带来外科手术中有害的副作用，这种情况可能由血管生成引起或由此而加剧。粘连是外科常见的并发症，并引起诸如小肠梗之类的问题。
有几种化合物已用于预防血管生成。Taylor等人用谷醇溶蛋白抑制血管生成，见Taylor et al.，Nature 297307(1982)。谷醇蛋白的毒性限制了其在实际疗法中的应用。Folkman等人发现了肝素与甾类化合物在控制血管生成中的用途。见Folkman et al.，Science22l719(1983)和美国专利Nos.5,001,116及4,994,443。已发现甾类化合物，如缺乏糖皮质激素与盐皮质激素活性的四氢皮质醇能抑制血管生成。
其它在动物体内发现的内源性因子，如来自牛玻璃体液的4kDa糖蛋白和取自软骨的因子已经用来抑制血管生成。诸如干扰素的细胞因子可抑制血管生成。例如，α干扰素或人β干扰素可抑制小鼠真皮中由人肿瘤细胞诱发产生的血管生成。β干扰素也是一种由异源脾细胞诱发血管生成的有效抑制剂。见Sidky et al.，Canser Research 475155-5161(1987)。据报道，人α干扰素的基因重组体(α/A)成功地用于治疗由血管生成诱发的肺多发性血管瘤。见White et al.，N.Engl.J.Med.3201197-1200，1971。
按照本发明所提供的组合物与方法有效地抑制动物、包括人与其它动物体内有害的血管生成。这些组合物易于通过包括肠道外途径在内的不同途径和安全剂量给药，并在体内部位抑制血管生成。本发明提供了一种由有害并失控的血管生成引引导的哺乳动物疾病的治疗方法，该方法是以含有白细胞介素-12的组合物给药，给药剂量足以抑制血管生成。
本发明尤其用于治疗某些眼部新生血管疾病，如黄斑变性。作为本发明一部分内容的组合物优选以肠道外途径给药，从而终止疾病发展。其它可用本发明治疗的疾病有糖尿病的视网膜病、新生血管青光眼和晶状体后纤维组织形成。
白细胞介素-12可按现有技术中已知的方法制备，载于欧洲专利申请433827号、国际专利申请WO9005147及WO9205256、Kobayashi M.et al.，J.Exp.Med.170827-845，1989，以及Stern A.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA876808-6812，1990。白细胞介素-12可按已知常用的化学合成法、基因重组法制备，或者从天然原料中提纯。术语“白细胞介素-12”也包括那些类似于精制和/或重组蛋白质的多肽，不过其变体是自然形成的或有意设计的。
本发明证明了对血管生成的抑制作用是IL-12的一种新的生物活性。这种对新血管形成的抑制作用具有深远意义，而且该作用也是在IL-12有最佳抗肿瘤作用的浓度时产生的(Brunda M.J.et al.，J.Exp.Med.1781223-1230，1993)。若将IL-12用在小鸡绒毛膜尿囊膜测定法中，观察不到其对血管生成的抑制作用，这说明IL-12是种特异性的。因此选择小鼠角膜新血管形成模型来评价IL-12的抗血管生成性质。使用这种具有不同免疫背景的小鼠种系模型，该免疫系统的个体细胞类型(自然杀伤细胞或T细胞)不能成为IL-12抗血管生成作用的传递介质。
用于此项研究的小鼠角膜新血管形成鉴定法是一种基础纤维细胞生长因子促成的血管生成模型。因此可以表明，IL-12能特异性抑制基础纤维细胞生长因子诱发的血管生成。不过，若用含有血管内皮生长因子的小丸(160ng/丸)代替基础纤维细胞生长因子小丸，IL-12仍表现出同样的抑制作用。
使用IL-12的疗法使小鼠血流中IFN-γ持续上升(Gately M.K.et al.，Int.Immund.6157-167，1994)。IFN-γ抗体给药阻止了IL-12诱发新血管形成的抑制作用。此外，注射IFN-γ药团或连续输注IFN-γ又会抑制新血管的形成。这些发现表明，IFN-γ是IL-12抗血管生成活性的一种必要和充分的传递介质。用IFN-γ抗体处理胸腺机能正常的小鼠会导致IL-12抗肿瘤功效的丧失，这样的观察资料也支持了IFN-γ在IL-12抗肿瘤活性中的重要作用(Nastala CL，et al.，J.Immunol 1531697-1706，1994)。IFN-γ曾用于鼠肿瘤模型(Brunda M.J.，et al.，Int.J.Cancer 40807-810，1987)。但是IFN-γ作为一种抗癌剂在临床应用中尚不是非常成功。IFN-γ的药物动力学已可解释这种药在临床试验中没有得到预期结果的原因。IFN-γ药团静脉内给药后，半衰期(小时)相对较短(Rutenfranz I.，etal.J.InterferonRes.8573-580，1988)，皮下注射后在血清中检测不到药物(Cross S.E，et al.，J.Interferon Res.45606-609，1993)。与药团注射相比，腹膜内连续输注IFN-γ提高了对血管生成的抑制作用，这样的观察结果表明了两种给药方法之间的药物动力学差异。不过这不能排除在植入基础纤维细胞生长因子小丸之前另外有3天连续用IFN-γ治疗已得到的有益效果。
尽管IFN-γ或取自经IL-12治疗的动物血清在体外对内皮细胞增生曾发现有显著的作用，目前仍不清楚IFN-γ如何发挥其对血管的作用。有关IFN-γ作为一种抗血管生成剂的文献报道尚存在争议，而且它们主要是基于体外观察结果得出的(Sato N.，et al.，J.Invest.Dermatool.9585s-89s，1990；Saegusa Y.，et al.，J.ell.Physiol.142488-495，1990；Friesel R.，etal.J.Cell.Biol.104689-696，1987；Saiki I.，et al.、Int.J.Cancer 51641-645，1992 Kobayashi S.，et al.，Immunopharmacol.2723-30，1994)。由于IFN-γ涉及大量基因的调节(Sen G.C.et al.，J.Biol.Chem.2675017-5020；1992)，因此似乎有理由可以假设IFN-γ在下游的作用涉及抗血管生成效果。
用患有Lewis肺癌小鼠进行实验的结果确认了IL-12与AGM-1470作为单一试剂使用时的有效的抗肿瘤活性(Brunda M.J.，et al.J.Exp.Med.1781223-1230，1993；Ingber D.et al.，Nature 348555-557，1990)。在Lewis肺癌模型中观察到同时用IL-12与AGM-1470治疗具有加性效应，这说明这些试剂通过不同途径作用于内皮细胞。用复合的抗血管生成剂是可提高治疗恶性肿瘤效果的方案。本发明清楚地证明，IL-12是一种有效的体内血管生成抑制剂，其作用是通过诱导IFN-γ持续释放来实现的。
关于本发明的IL-12药学上可接受的制剂可用本领域普通技术人员已知的制剂方法进行制备。这些制剂均能按标准途径给药。一般来说，该制剂是肠道外给药(如静脉内、皮下、或肌内)，也预料可用局部、透皮、口服或直肠途径给药。此外，该制剂中可加入可生物降解的聚合物，它能使IL-12持续释放，将该聚合物植入需要药物释放的部位、如肿瘤附近。可生物降解的聚合物及其应用详见Brem et al.，J.Neurosurg，74441-446(1991)。IL-12的剂量取决于治疗的病情、具体化合物和其它临床因素，如人或动物的体重与身体状况、及IL-12的给药途径。本发明应理解为可以人用也可兽用。在对人以肠道外途径给药时，约0.1至20mg/kg、每周1至5次，优选为0.5至10mg/kg、每周1至3次，最优选为l至l0mg/kg、每周1至3次的剂量一般来说足够了。
该制剂包括那些适宜肠道外途径(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内、气管内和硬膜外)给药的剂型。可按常用制药技术将该制剂制成方便的单位剂量方式。该制备方法包括使IL-12与药物载体或赋型剂结合的步骤。一般来说，在制备时要使IL-12与液体载体均匀、紧密地结合。适宜肠道外给药的制剂包括含水及非水的无菌注射溶液，溶液中可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和使制剂与预期的受治疗者血液等渗的溶质；还包括含水及非水的无菌悬浮液，该悬浮液可含有悬浮剂和增稠剂。制剂可置于单位剂量或多剂量容器中，如密封的安瓿和小瓶，可在冻干(冷冻干燥)条件下贮存，要求仅在使用前加入无菌液体载体，如注射用水。
优选的单位剂量制剂，如上所述，含有有效成分的日剂量或日单位剂量、每日分次剂量、或其分次的相应剂量。
能按本发明治疗的与角膜新血管形成有关的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的视网膜疾病、视网膜早熟、角膜移植排斥、新血管引起的青光眼、和晶状体后纤维组织形成。流行性角膜结膜炎、维生素A缺乏症、接触性晶状体劳损、特异性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干性角膜炎、斯耶格伦综合征、红斑痤疮、phylectenulosis、梅毒、分枝杆菌感染、磷脂变性、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯性疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染、卡波济肉瘤、莫伦溃疡、Temen′s边缘变性、边缘角质层分离、创伤、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、Wegener肉样瘤、巩膜炎、史蒂文斯-约翰逊病、periphigoid放射状角膜切开术、角膜移植排斥。
能按本发明治疗的与视网膜/脉络膜新血管形成有关的疾病包括但不限于下列疾病糖尿病的视网膜病、黄斑变性、镰状细胞性贫血、肉样瘤、梅毒、弹性纤维假黄瘤、佩吉特病、静脉闭塞、动脉闭塞、颈动脉阻塞、慢性葡萄膜炎/Vitritis、分支杆菌感染、Lyme′s病、系统性红斑狼疮、视网膜早熟、伊尔斯病、Bachets病、感染引起的视网膜炎或脉络膜炎、推定性眼部组织胞浆菌病、Bests病、近视、眼窝、Stargarts病、局部planitis、慢性视网膜脱离、高粘滞性综合征、弓形体病、创伤、激光照射后引起的并发症。
其它疾病包括但不限于下列疾病与潮红有关的疾病(角部新血管形成)和由纤维血管或纤维组织异常增生引起的疾病，包括各种类型的增生性玻璃体视网膜病，无论是否与糖尿病有关。
另一种能按本发明治疗的疾病是类风湿性关节炎。该病据认为是由于在关节滑液衬血管中生成新血管。除了形成新血管网以外，内皮细胞还释放因子与反应性氧，引起血管翳生长和软骨损伤。涉及血管生成的因子能主动引起并有助于保持类风湿性关节炎的慢性发炎状态。
另一些能按本发明治疗的疾病有血管瘤、Osler-Weber-Rendu病，或称之为遗传出血性毛细血管扩张，还有固体瘤或血源性瘤，及获得性免疫缺陷综合症。
用基本纤维细胞生长因子诱发的小鼠角膜新血管形成模型来评价IL-12对体内血管生成的作用。不同种系的不鼠用IL-12治疗，每天lmg腹膜内给药连续治疗5天。用新血管形成的血管长度和角膜的时间来测量含有基本纤维细胞生长因子的小丸而产生的新血管形成的程度。用患有Lewis肺癌小鼠评价LI-12与AGM-1470血管生成抑制剂的抗肿瘤活性。用牛毛细血管内皮细胞、小鼠胰内皮细胞和小鼠血管内皮瘤细胞系进行体外增生研究。免疫活性的C57BL/6小鼠、严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠和自然杀伤细胞缺陷的Beige小鼠经IL-12治疗的结果是角膜新血管形成几乎被完全抑制了。IFN-γ中和抗体给药阻止了血管生成潜在的抑制作用。此外，腹膜内注射IFN-γ药团或借助于腹膜内植入的渗透药泵连续输注IFN-γ，都能再现在用IL-12治疗中观察到的抗血管生成作用。用IL-12与AGM-1470共同治疗患有Lewis肺癌小鼠，产生加和的抗肿瘤作用，这提示了不同的抗血管生成的作用机理。
用下列实施例进一步说明本发明，但无论如何也不能将其解释为对本发明范围的附加限制。相反，本领域技术人员在阅读本说明书之后显然可采取其它各种具体的、变换的及等效的实施方案而不背离本发明的构思和/或附在后面的权利要求的范围。
实施例1.材料基因重组的鼠IL-12(IL-12)、基因重组的鼠γ干扰素(IFN-γ)和大鼠IgGlXMGl.2IFN-γ封闭性抗体，均来自Hoffmann-La Roche，Nutley，NJ.AGM-1470(TNP 470)和基本纤维细胞生长因子得自Takeda Industries，Osaka，Japan。所有其它材料购自Sigma，StLouis，Mo。
用二硫苏糖醇(10mM)与碘乙酰胺(50mM)还原IL-12制得IL-12的单体混合物。然后将此混合物渗析3小时(分子量截断点6-8000D，Spectra/Por渗析膜，Houston，Tx)去除去该还原化合物。用SDS-PAGE确认混合物中有单体存在而没有二聚物存在。2.细胞和培养条件本项研究使用牛毛细血管内皮细胞、小鼠胰岛内皮细胞初级培养物和小鼠血管内皮瘤细胞系。在10％CO2大气中，在Dulbeco改进的Eagle′s最少量必需培养基(DMEM)中进行单细胞层培养，培养基中补充了100V/ml青霉素、100mg/ml链霉素、2mM左旋谷酰胺(“全培养基”)及10％牛血清(GIBCOBRL，Grand Island，NY)。牛毛细血管内皮细胞在4ng/ml基本纤维细胞生长因子(bFGF)的存在下培养时保持不变，而小鼠胰岛内皮细胞在6ng/ml基本纤维细胞生长因子与10％NUSERUM IV培养营养物(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)的存在下则进行生长。涉及牛与小鼠内皮细胞的实验在10与15代之间进行。3.小鼠雄性C57BL/6小鼠、SCID(C57BL/6/SCID/szj)小鼠和Beige(C57BL/6/bgj)小鼠购自Jackon Laboratories，Bar Harbor，ME。光秃小鼠(NCR Nu/Sed，SwissWhite background)来自Massachusetts General Hospital，Boston，MA。全部动物研究对雄性、6-8周龄小鼠进行。4.体外测定为评价对内皮细胞增生的作用，将牛毛细血管内皮细胞、小鼠胰岛内皮细胞及血管内皮瘤细胞置于24池板中，使其密度为10000-12500个细胞/池。二十四小时后，在1ng/ml基本纤维细胞生长因子与5％牛血清的全培养基中孵育细胞，并用待测化合物激发免疫应答。72小时后，通过使其受胰蛋白酶作用来收集细胞，并用Coulter计数器计数细胞数目。5.体内测定为研究IL-12与IFN-γ在体内对血管生成的作用，使用前述小鼠角膜血管生成测定法，并作了改变(Polakowski I.J.，et al.，Am.J.Pathol.143507-517，1993；Muthukkaruppan V.，et al.，Science2051416-1418，1979)。简要地说，在两只眼角膜缘的1mm内做出角膜微囊，再将含有基本纤维细胞生长因子(-80ng)、硫糖铝及hydron的小丸植入两只眼中。每日测量新血管形成的最大血管长度与时间，作为血管应答。本项研究数据在植入基本纤维细胞生长因子后第5天得出，那天的血管生成应答达到最大。
实验中腹膜内植入渗透泵(Alzet2002，Alza Corporation，Palo Alto，CA)，以确保盐水或IFN-γ能实现连续输注。在植入基本纤维细胞生长因子之前让小鼠从上述剖腹术中恢复3天。实验结束后，检查一下剩余泵容量，以确保正常的功能和传输。
在每日注射IL-12的第5天注射后24小时，通过心脏穿刺得到经IL-12治疗的小鼠血清。6.肿瘤实验雄性C57BL/6小鼠接种106个Lewis肺癌细胞。在肿瘤体积达到75mm3后，用盐水、IL-12、AGM-1470或IL-12加AGM-1470开始进行治疗。IL-12腹膜内给药剂量为1mg/天，连续给药5天。休止2天后再重复上述循环。AGM-1470每隔一天皮下给药，剂量为30mg/kg。用连续测经器测量正交直径，按下式计算肿瘤体积，以mm3计最大直径×最小直径2×0.52。接种后三周，切除肿瘤和肺，称重。在解剖显微镜下计数肺表面转移瘤数目。7.统计学分析用Student′s双尾t检验计算各组间的统计学上显著差异。结果以平均值±均值的标准误差(SEM)表示。8.IL-12对小鼠角膜新血管形成的作用雄性C57BL/6小鼠用IL-12(每天以溶于0.1ml载体中的1mg IL-12腹膜内给药，连续给药5天，从植入小丸当天开始)或用载体(1％同种基团的小鼠血清的磷酸盐缓冲盐水)作对比处理。在治疗过程中没有产生明显毒性。经IL-12治疗的C57BL/6小鼠几乎没有因基本纤维细胞生长因子小丸而形成角膜新血管，而用载体处理的小鼠在植入该小丸后5天内有血管生长进到小丸(P＜0.0001；图1和图2)。结果来自三个独立的实验。若将IL-12还原为单体混合物并以每天1mg这种混合物腹膜内给药5天，则体内对新血管形成的抑制作用丧失(图2)。
为搞清楚IL-12对新血管形成的抑制作用是通过免疫系统的哪种细胞起作用的，于是对免疫系统异常的小鼠种系进行小鼠角膜新血管形成测定。我们首先研究了T细胞缺陷的SCID小鼠。IL-12在SCID小鼠中保持了其对血管生成的抑制作用(以载体与IL-12分别处理小鼠，结果为血管长度0.98±0.06mm与0.22±0.02mm)(P＝0.0002)，时间4.6±0.4h与3±0.3h(P＝0.011)。其抑制作用程度与在胸腺机能正常的C57BL/6小鼠中观察到的类似。自然杀伤细胞缺陷的beige小鼠经IL-12治疗后观察到了类似的抑制图形(以载体或IL-12分别处理小鼠，结果为血管长度0.7±0.05mm与没有新血管(P＜0.0001)，时间3.6±0.3h与没有新血管(P＜0.0001))。发现光秃小鼠有自发的角膜新血管形成，该作用掩盖了由基本纤维细胞生长因子诱发新血管的作用。不过上述发现的一致点在于经IL-12治疗的动物没有毛细血管生长进到小丸，而经载体处理的小鼠明显生成了长入小丸的血管，这在一定程度上说明了IL-12对血管生成的抑制作用。9.IL-12与IFN-γ对内皮细胞体外增生的作用IL-12(在0.001-100ng/ml范围内)对牛或小鼠的内皮细胞或血管内皮瘤细胞的增生没有作用。经IL-12治疗5天后，C57BL/6、SCID或光秃小鼠血清对各类型的内皮细胞增生没有抑制作用。
IFN-γ(在0.0001-200ng/ml范围内)对小鼠胰岛内皮细胞增生仅有最小作用(与对照细胞相比有16％抑制)，对牛毛细管内皮细胞增生没有作用。10.IFN-g作为IL-12体内活性传递介质的作用对C57BL/6小鼠单次注射IFN-γ抗体(在植入小丸当天，在第一次注射IL-12前2小时，每只小鼠腹膜内给药1mg)完全消除了IL-12抗血管生成性质(P＜0.0001)。用大鼠IgG进行对照物注射(在植入小丸当天每只小鼠腹膜内注射1mg)。并不影响IL-12对新血管形成的抑制作用(图3)。
为搞清楚IFN-γ治疗是否会导致与IL-12类似的抑制血管生成作用，于是给C57BL/6小鼠每日腹膜内注射IFN-γ(250,000U/天，连续5天)。在这些小鼠中观察到了对血管长度显著(P＝0.0007)的抑制作用(图4)，且没有产生明显的毒性。为保持IFN-γ水平恒定不变，腹膜内植入微渗透泵，在实验过程中该泵释放IFN-γ并达到130,000U/天的最终剂量。在泵植入72小时后植入基本纤维细胞生长因子小丸。植入载有盐水的泵并不影响对照动物体内新血管的发育。这些动物体内新血管形成程度与不植入泵的对照动物相当。不过，植入含有IFN-γ的泵的动物，角膜中新血管生长被完全抑制了(图4；与对照组相比，对血管长度，P＝0.0002，对时间，P＝0.0004)。对照动物与经IFN-γ治疗的小鼠在剖腹术后的恢复阶段中体重都下降了。植入小丸后，对照动物体重上升，而经IFN-γ治疗的小鼠体重不变，并有嗜睡表现。11.IL-12与AGM-1470对Lewis肺癌的治疗作用与用盐水处理的对照动物相比，IL-12或AGM-1470有效地抑制接种了Lewis肺癌小鼠原发肿瘤的生长和自发的肺转移瘤。同时用IL-12或AGM-1470治疗患有Lewis肺癌小鼠，结果发现原发肿瘤体积比单用IL-12或AGM-1470治疗的动物更小(图5)，自发肺转移瘤比单用IL-12或AGM-1470治疗的动物更小(图6)。在各组治疗过程中均没有明显毒性产生。
权利要求
1.白细胞介素-12在药物制备中的用途，该药物用于治疗由有害的或失控的血管生成所引起的疾病。
2.权利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病为新血管形成。
3.权利要求2的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病为视网膜/脉络膜新血管形成。
4.权利要求3的用途，其中视网膜/脉络膜新血管形成与糖尿病的视网膜病有关。
5.权利要求3的用途，其中视网膜/脉络膜新血管形成与黄斑变性有关。
6.权利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病为角膜新血管形成。
7.白细胞介素-12在制备治疗糖尿病的视网膜病的药物中的用途。
8.白细胞介素-12在制备治疗黄斑变性的药物中的用途。
9.权利要求1的用途，其中由有害的或失控的血管生成所引起的疾病起源于固体瘤或血源性瘤及它们的转移瘤。
10.权利要求l的用途，其中由有害的或的控的血管生成所引起的疾病为增生性玻璃体视网膜病。
11.按照权利要求1至10的白细胞介素-12加一种或多种其它的血管生成抑制剂的用途。
12.白细胞介素-12在治疗如权利要求l至ll中任一项权利要求限定的疾病中的用途。
13.用于治疗如权利要求1至11中任一项权利要求所述疾病的白细胞介素-12。
14.与一种或多种另外的血管生成抑制剂结合的白细胞介素-12，用于治疗如权利要求1至11中任一项权利要求所述的疾病。
15.如前面所述的发明。
全文摘要
本发明涉及白细胞介素－12在药物制备中的用途,该药物用于治疗有害的或失控的血管生成,这对治疗糖尿病引起的视网膜病及黄斑变性具有重要意义。
文档编号A61K38/20GK1189102SQ96191943
公开日1998年7月29日 申请日期1996年2月7日 优先权日1996年2月7日
发明者摩西·J·福克曼, 加里·A·特鲁依特, 埃米尔·E·沃斯特 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司, 儿童医疗中心公司