专利名称：Lcksh2特异性化合物在治疗自身免疫疾病与同种异体移植排斥反应中的应用的制作方法
背景技术：
与src相关的淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶p56lck(lck)，可通过其独特的氨基末端区与T淋巴细胞的CD4胞质尾区相结合。结合了lck的CD4是T细胞级联活化作用中的基本组份，而且完整的lck SH2区/CD4复合物是T细胞对抗原产生功能性免疫应答所必需的，对lck SH2区/CD4复合物的抑制作用将导致T细胞特异性免疫抑制。
许多多肽生长因子和激素通过某种信号传导途径来实现其细胞中的功能。从细胞表面上这些配体的受体到胞内效应物的信号传导通常包括特异性蛋白底物通过起调节作用的蛋白酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶的磷酸化和去磷酸化作用。酪氨酸的磷酸化作用在多细胞有机体的信号传导中也许是首要的、甚至是唯一的标志。受体结合与胞内PTKs在免疫系统细胞中调节着细胞增殖、分化与信号发送过程。
异常的蛋白酪氨酸激酶活性已被揭示或怀疑与许多病理状况有关，如糖尿病、动脉粥样硬化、牛皮癣、败血症性休克、骨质丧失、贫血、很多癌症以及其它一些增生型疾病。因此，酪氨酸激酶及其参与的信号传导途径是药物设计中潜在的目标。参见Levitzki等的综述，《科学》(Science)267卷1782-1788页(1995)。
信号传导途径中的许多蛋白质以低水平存在并常常具有相反的活性。这些信号分子的特性使得细胞可以通过效应物的亚细胞定位与并列以及通过阻遏来平衡其活性而控制信号的传导，因而传导途径中一个细小的变化将能起到开关作用。
信号分子通过蛋白质间相互作用而并列造成的传导复合物的形成，是通过特异停靠区序列基元来调节的。src同源2(SH2)区是非受体PTKs、激酶靶效应物分子等多种信号分子以及癌基因蛋白中发现的近100个氨基酸的保守的非催化序列，它在上述过程中起着关键的作用。SH2区对于自磷酸化的PTK受体及胞内酪氨酸激酶中存在的含有磷酸化酪氨酸的短肽序列是高度特异的。
已经证实，将近60种蛋白质，尽管它们具有不同的催化或其它功能区，但都具有一个约100个氨基酸的保守序列，即SH2区。现在还未能确切地知道体内哪些生理反应是由这些SH2区逐一控制的。而且，SH2区-配体/复合物间相互作用是高度特异的，因而配体/复合物结构上细小的变化将显著改变配体/复合物与不同的SH2区结合的选择性。
对SH2区非选择性的拮抗作用的后果是非常严重的。例如src SH2区、lck SH2区和fyn SH2区结构上相似，各区之间具有高度的保守性。对src SH2区的拮抗作用将影响骨再吸收，而对lck SH2区(在此讨论的)或fyn SH2区的拮抗作用将导致免疫抑制。在需要免疫抑制诱导的长期治疗中，对骨再吸收的抑制作用是很讨厌的。
而且，将可能的lck SH2区的拮抗剂与所有已知的60种SH2区进行结合实验是不切实际的。目前，尚未有已知的化合物能与lck SH2区选择性相互作用。
因此，提供可通过拮抗lck SH2区治疗自身免疫疾病和同种异体移植排斥反应而又能避免无选择性SH2拮抗剂产生的副作用的方法和化合物是非常必需的。
如本发明所公开的，已意外地发现lck SH2区选择性拮抗剂可通过一系列SH2区亚型的结合实验来鉴别，这些SH2区亚型由src SH2区、lck SH2区、fyn SH2区、SHPTP2 SH2区、p85区、Grb2 SH2区和hcp SH2区组成。
从下面将给出的结合信息可看出，已意外地发现了一些可与人lckSH2区特异结合的化合物，其与人lck SH2区结合的亲和力比与人srcSH2区或人fyn SH2区结合的亲和力高出50倍以上，而且，这些复合物与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SH PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合的亲和力比其与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上，它们对于治疗自身免疫疾病和同种异体移植排斥反应是有效的。
发明概述本发明提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物。该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
本发明也提供了一种抑制同种异体移植排斥反应反应的方法，该方法包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
本发明还提供了一种诱导免疫抑制的方法，该方法包括给予受治疗者诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
发明详述按照本文的用法，术语“自身免疫疾病”指任何以过度活跃的免疫应答或错误地针对自身抗原的免疫应答为特征的疾病。优选的自身免疫疾病是类风湿性关节炎。也包括其它疾病，如多发性硬化、系统性红斑狼疮和I型糖尿病。
按照本文的用法，术语“治疗”及派生词指预防或治疗的疗法。
按照本文的用法，术语“化合物”指非肽的化学化合物。
按照本文的用法，除非另外定义，术语“lck SH2区拮抗剂”指的是这样一种化合物，(a)它可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上，优选高100倍以上，(b)它可与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SHPTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上，优选低100倍以上。
本发明提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物。该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
本发明的一个优选方面是提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
本发明的一个优选方面是提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
本发明的一个优选方面是提供了一种治疗自身免疫疾病的方法，该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
本发明也提供了一种抑制同种异体移植排斥反应反应的方法，该方法包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上，优选高100倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SH PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上，优选低100倍以上。
本发明的一个优选方面是提供了一种抑制同种异体移植排斥反应反应的方法，该方法包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上，优选高100倍以上。
本发明也提供了一种诱导免疫抑制的方法，该方法包括给予受治疗者以诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上，优选高100倍以上；(b)可与人hcp SH2区、人Grb2SH2区、人SH-PTP2 SH2区和人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上，优选低100倍以上。
本发明的一个优选方面是提供了一种诱导免疫抑制的方法，该方法包括给予受治疗者诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物(a)可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上，优选高100倍以上。
利用在大肠杆菌中表达的融合蛋白的SH2区可在体外测定化合物对不同的人SH2区的抑制活性，具体方法将在实施例11中详述。
表1和2中所列的数据显示了所述化合物拮抗lck SH2区的能力。在实施例11的实验中，显示出选择性lck SH2区拮抗活性的化合物用已知的试验检验了其诱导免疫抑制活性的能力。优选的试验包括1)IL2产生试验-本试验测量了T细胞在应答不同刺激时IL2的产量。最常用的T细胞是Jurkat人T细胞系。Jurkat细胞分别用a)促有丝分裂的凝集素(植物血细胞凝集素或PHA)加钙离子载体或加伏波酯，或b)T细胞受体抗体加伏波酯刺激。以对人IL2特异的ELISA测定的IL2表示其活性水平和2)三道人混合淋巴细胞反应(MLR)-本方法能模拟对外源抗原的应答。本实验测定了来自某个体的淋巴细胞对存在于另一个体血细胞中的外源抗原的反应。来源于三种不同供体血中的淋巴细胞(三道反应)混合在一起并在完全生长培养基中培养4-5天。通过胸腺嘧啶掺入测出的细胞增殖应答反映了其活性水平。
在这些实验中测出的这些化合物的活性，在本领域被认为与体内治疗自身免疫疾病的疗效有关，也被认为与体内抑制同种异体移植排斥反应反应的效果有关，还被认为与体内诱导免疫抑制的效果有关。
因此本发明提供了一种诱导免疫抑制的方法，该方法包括给予诱导免疫抑制有效量的本文定义的一种lck SH2区拮抗剂。药物可以通过任何常规的途径给予需要免疫抑制的患者，其途径包括但不限于静脉内、肌内、口服、皮下、皮内和非肠道给药。诱导免疫抑制的有效剂量为每kg体重约0.001-10.0mg。在0.001mg-10.0mg/kg体重间选择的剂量是有效而无毒的。所用的剂量将以每天1～6次给予患者。
本发明中公开的诱导免疫抑制的方法也可通过使用含有本文定义的lck SH2区拮抗剂和合适的药剂载体的药剂组合物来实现。该组合物可含0.05mg-500mg的lck SH2区拮抗剂，并可组合成任何适合于所选给药方式的形式。适合于口服的组合物包括固体形式，如药丸、胶囊、粒剂、片剂和粉剂；液体形式，如溶液、糖浆、酏剂和悬液。适于非肠道给药的组合物形式包括无菌溶液、乳剂和悬液。
本发明也提供了一种抑制同种异体移植排斥反应反应的方法，该方法包括给予抑制同种异体移植排斥反应有效量的本文定义的lck SH2区拮抗剂。药物可以用任何常规的途径给予刚接受同种异体移植或准备接受同种异体移植的患者，其途径包括但不限于静脉内、肌内、口服、皮下、皮内和非肠道给药。抑制移植排斥反应的有效剂量大约为每kg体重0.001mg-10.0mg。在大约0.001mg-10.0mg/kg体重间所选的剂量是有效而无毒的。所用的剂量将以每天1～6次给予患者。
本发明中公开的抑制同种异体移植排斥反应的方法也可通过使用含有本文定义的lck SH2区拮抗剂和合适的药剂载体的药剂组合物的形式来实现。该组合物可含0.05mg-500mg的lck SH2区拮抗剂，并可组合成任何适合于所选给药方式的形式。适合于口服的组合物包括固体形式，如药丸、胶囊、粒剂、片剂和粉剂；液体形式，如溶液、糖浆、酏剂和悬液，适于非肠道给药的组合物形式包括无菌溶液、乳剂和悬液。
另外，药物可配制成无菌的固体组合物形式，在给药的时候可用无菌的水、生理盐水或其它合适的无菌注射用介质溶解或悬浮。载体意味着包括必需且惰性的粘合剂、悬浮剂、润滑剂、香味剂、甜味剂、防腐剂、染色剂和包被。
最佳的给药量容易由本领域的技术人员确定，并且它将随所用的具体的lck SH2区拮抗剂、制剂浓度、给药方式以及病情的进展情况而变。还需要根据所治疗的具体患者的其它因素调整剂量，包括患者的年龄、体重、饮食和给药时间。
本发明也提供了lck SH2区拮抗剂在制造用于治疗自身免疫疾病的药物中的应用。
本发明也提供了lck SH2区拮抗剂在制造用于抑制同种异体移植排斥反应反应的药物中的应用。
本发明也提供了lck SH2区拮抗剂在制造用于诱导免疫抑制的药物中的应用。
本发明还提供了用于治疗自身免疫疾病的含lck SH2区拮抗剂的药剂组合物。
本发明还提供了用于抑制同种异体移植排斥反应的含lck SH2区拮抗剂的药剂组合物。
本发明还提供了用于诱导免疫抑制的含lck SH2区拮抗剂的药剂组合物。
按照本发明使用本发明的方法，将不会出现不可接受的毒副作用。
即便没有进一步的说明，确信，本领域的技术人员能利用以上说明最大限度地应用本发明。
因此，以下实施例仅供示例说明，而不应被理解成以任何方式对本发明的范围进行限制。
实验详述除非特别指明，本文所用的符号°指℃。
L-3，5-二溴酪氨酸可用本领域已知的方法制备，例如在《甲状腺激素和类似物，I.合成、物理性质及理论计算》(Thyoid Hormonesand Analogues.I.Synthesis，Physical.Properties and TheoreticalCalculations)E.C.Jorgensen，《激素蛋白质及肽》(HormonalProteins and Peptides)第六卷，1978，Academic Press，N.Y.一文及其引用文献中所描述的方法。
L-3，5-二溴-N-三氟乙酰-酪氨酸甲酯(在实施例2(e)和实施例2B(b)中用到)可按下面方法制备。
将L-3，5-二溴酪氨酸(500g)悬浮在甲醇(5升)中，并向搅拌的悬浮液中通干燥氯化氢5小时。反应混合液蒸发干后，残留物悬浮在水(4升)中，用40％氢氧化钠调pH至6。收集沉淀并用水洗涤，得到L-3，5-二溴酪氨酸甲酯(467g，90％)，熔点201°-203°。所得酯(768g)悬浮在氯仿(2.7升)和乙酸乙酯(2.7升)中，在0.5小时内加入三氟乙酸酐(565g)，保持温度低于35°。混合物放置过夜，加水(2升)，用饱和碳酸氢钠溶液调pH至7。移出有机相，用水洗涤，用无水硫酸镁干燥并蒸发。残留物用含水甲醇重结晶，得到L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯(786g，81％)，熔点136°-7°。
下面实施例6中用到的方案1
4-反式-氨甲基环己基羧酸1中的氨基用标准的保护基团，如丁氧羰基(Boc)基团(Boc酐、NaOH、H2O、二
烷)保护以形成2。然后用DCC等偶联剂偶联到开氏肟树脂(Kaiser，E.T.、等《美国化学学会学报)》(J Am Chem Soc)1985年107卷7087-7092页)上形成3。随后在标准条件(25％三氟乙酸(TFA)、二氯甲烷)下将胺去保护形成4。4在标准条件(如在DMF中用HBTU、NMM或在DMF或NMP中用DCC或DIC)下酰化形成5。然后用不同的胺使化合物5从树脂上裂解形成最终所需的产物6。
化合物1到10按照下面实施例1到10制备。
实施例17-〔D，L-α-氨基-α-(4-羧苯基)乙酰氨基〕-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-头孢-4-羧酸(化合物1)的制备
a)4-羟甲基苯甲醛溶于无水四氢呋喃(200ml)的1，4-苯二甲醛(50.0g，0.373mol)溶液在冰浴中于氮气下滴加溶于500ml四氢呋喃中的三(叔丁氧基)氢化铝锂(104.0g，0.410mol)。在冰浴中搅拌半小时后，将反应混合液倾入2L冰冷的2N盐酸中。该水溶液用四批800ml的乙醚萃取，合并的醚相用碳酸氢钠溶液及盐水洗并干燥。溶剂蒸发后得到46g粗制品，用色谱(氧化铝，乙醚洗脱〕纯化后得到晶状的题头化合物(17.6g，35％)熔点44.5-46℃。
b)5-(4-羟甲基苯基)乙内酰脲向4-羟甲基苯甲醛(10.0g，73.5mmol)和碳酸铵(17.1g，150mmol)在110mL加热到50℃的60％乙醇水溶液中的混合物里，边搅拌边加入溶于10ml水中的氰化钠(4.0g，81mmol)。将反应混合物搅拌并在50-60℃下加热3小时，随后在85℃加热一小时。在冰浴中冷却后，用浓盐酸将溶液pH调至6。冷却过夜，沉淀下来的固体经过滤、水洗、干燥后，得到题头化合物(11.0g，72％)熔点189-196℃。
c)4-羟甲基苯基氨基乙酸将实施例1(b)的化合物(10.9g，53mmol)和八水合氢氧化钡(25.5g，81mmol)在125ml水中的混合物搅拌回流18小时。反应混合物冷却后用浓硫酸酸化至pH为1。滤除硫酸钡并将滤液的pH用碳酸铅调升至6。滤去硫酸铅后，滤液用硫化氢饱和并滤去硫化铅。通过在减压条件下与乙醇共沸，将水溶液浓缩至100mL。冷却后，得到题头化合物(5.2g，54％)熔点230-231℃。
d)N-叔丁氧基羰基-4-羟甲基苯基氨基乙酸向溶于160mL水的4-羟甲基苯基氨基乙酸(8.0g，44mmol)和三乙胺(8.8g，87mmol)溶液中加入溶于120mL四氢呋喃的叔丁氧基羰基叠氮化合物(6.95g，49mmol)。室温下搅拌过夜后，反应混合物用200mL乙醚洗两次，水相被乙醚覆盖，用3N盐酸将水溶液在冰浴中酸化至pH 3-3.5。酸化的溶液用乙醚抽提，合并有机抽提物用盐水洗，干燥、蒸发得到的油状物用氯仿-己烷研磨，滤出固体，得到题头化合物(7.7g，63％)熔点139-141.5℃。
e)N-叔丁氧基羰基-4-羟甲基苯基氨基乙酸甲酯硫酸二甲酯(3.1g，24mmol)和溶于10mL甲醇的二异丙胺(5.2g，40mmol)加入实施例1(e)化合物(5.6g，20mmol)溶液中。将反应混合液回流20分钟后用2N盐酸处理。其水溶液用乙酸乙酯抽提三次，合并的有机抽提物用5％碳酸氢钠水溶液和盐水洗，蒸发掉有机溶剂得到油状题头化合物(3.2g，55％)。
f)N-叔丁氧基羰基-4-羧基苯基氨基乙酸甲酯溶于50ml丙酮的实施例1(e)化合物(0.62g，2.1mmol)的溶液于25℃下用过量的Jones试剂(8N铬酸)处理。反应混合物于室温下搅拌2小时。滤除绿色固体，过量的CrO3用异丙醇分解。滤液用无水硫酸钠干燥并用活性炭处理。滤去固状物，滤液蒸干后得到0.38g白色固体题头化合物熔点126-128℃。
g)N，N′-双(1-甲基乙基)氨基甲亚胺酸1，1-二甲基乙酯题头化合物可根据Santini等的方法(《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1994年59卷2261页)制备。在CuCl(0.01当量)存在下，纯的N，N′-二异丙基碳化二亚胺(1.0当量)与2-甲基-2-丙醇(1.15当量)室温下反应一天。
h)N-叔丁氧基羰基-4-(叔丁氧基羰基)苯基氨基乙酸甲酯溶于无水二氯甲烷中的实施例1(f)化合物(1.0g，3.2mmol)和N，N′-双(1-甲基乙基)氨基甲亚胺酸1，1-二甲基乙酯(1.3mg，6.5mmol)溶液在室温下搅拌过夜。滤除二异丙脲，过量的N，N′-双(1-甲基乙基)氨基甲亚胺酸1，1-二甲基乙酯用水分解。分层后二氯甲烷溶液用5％碳酸氢钠水溶液和盐水洗，用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后的残余物用乙醚处理。滤除残余的二异丙脲，有机滤液蒸发后得到油状的题头化合物(870mg，74％)。
i)N-叔丁氧羰基-4-(叔丁氧羰基)苯基氨基乙酸将实施例1(h)化合物(760mg，2.1mmol)在18ml 5％硫酸氢钠水溶液、18ml 5％碳酸钠水溶液和36ml甲醇中的溶液在室温下搅拌5小时。用水稀释反应液，用乙酸乙酯洗，水溶液用新鲜的乙酸乙酯覆盖并用3N HCl酸化到pH 2。分离各层后水溶液用乙酸乙酯抽提2次以上。乙酸乙酯溶液经无水硫酸钠干燥、蒸发后，产生白色固体的题头化合物(600mg，82％)熔点77-79℃。
j)7-氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-头孢烯-4-羧酸叔丁酯溶于磷酸缓冲液(pH 6.4)的7-氨基头孢菌烷酸叔丁酯(根据Blacklock等的方法(《有机化学杂志》(J.Org.Chem.)1989年54卷3907页)，利用7-氨基头孢菌烷酸与异丁烯和硫酸在1，2-二甲氧基乙烷中反应制得)、碳酸氢钠和2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑溶液，60℃搅拌6小时。反应混合液通过盐酸/乙酸乙酯抽提进行后处理，得到了题头化合物。
k)7-〔D，L-α-(叔丁氧基羰基氨基)-α-〔4-(叔丁氧基羰基)苯基〕〕乙酰氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-头孢烯-4-羧酸叔丁酯实施例1(i)中的N-叔丁氧基羰基-4-(叔丁氧基羰基)苯基氨基乙酸(351mg，1mmol)、实施例1(j)中的7-氨基-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-头孢烯-4-羧酸叔丁酯(368mg，1mmol)和DCC(212mg，1mmol)在无水二氯甲烷中的混合液在室温搅拌3小时。滤去二环己脲并将滤液蒸干。残余物用乙酸乙酯溶解，乙酸乙酯溶液依次用5％碳酸氢钠、2.5％硫酸、5％碳酸氢钠和盐水洗，用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸发后得到0.6g粗制品。用硅胶色谱法(用30∶70乙酸乙酯/苯洗脱)纯化后得到题头化合物(430mg，61％)熔点110-112℃。
l)7-〔D，L-α-氨基-α-(4-羧基苯基)乙酰氨基〕-3-〔2-(5-甲基-1，3，4-噻二唑基)硫甲基〕Δ3-头孢烯-4-羧酸实施例1(k)中化合物(400mg，0.57mmol)在7.2mL三氟乙酸和0.8ml苯硫酚中搅拌。反应混合物于0℃搅拌30分钟并于室温搅拌1小时。在40℃水浴中将溶剂蒸发后，残余物用乙醚研磨三次；固体产物用少量的甲醇溶解，加入乙醚使产物沉淀，得到题头化合物(300mg)熔点170-175℃。
实施例2L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)-甲腺原氨酸(化合物2)的制备
(a)O-甲氧基苯基乙腈(23.64g)和3，6-二氯哒嗪(23.93g)溶于无水二甲基甲酰胺(50ml)，在搅拌下于2小时内缓慢分批加入氢化钠(16.23g，50％油分散体)。反应混合物倾在过量的碎冰上用二氯甲烷抽提。分出有机相用水洗，无水硫酸镁干燥，活性炭过滤并蒸发至干。残余物从二氯甲烷/汽油中结晶，得到1-(6-氯-3-哒嗪基)-1-(2-甲氧基苯基)-乙腈(35.5g，85％)，熔点91-92℃。
(b)得到的腈(33.5g)用浓盐酸(200ml)、乙酸(100ml)和水(100ml)溶解并搅拌回流。6小时后蒸走溶剂，残余物从乙酸乙酯/汽油中重结晶，得到2-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)-苯甲醚(21.4g，77％)，熔点142°-3°。
(c)得到的哒嗪酮(15.7g)溶于三氯氧化磷(22ml)，于55°(油浴)加热搅拌1小时。将冷却后的混合物缓慢倾在碎冰上并用二氯甲烷抽提。分离有机层并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥并蒸干。将残余物与较小的一份(来自2.16g哒嗪酮)合并，用沸腾的汽油(60°-80°)抽提几次，合并抽提物，活性炭过滤并蒸干。得到2-(6-氯-3-哒嗪基甲基)苯甲醚(16.95g，87％)，熔点63℃。
(d)三(三氟乙酸)碘(在乙酸酐和三氟乙酸中碘(2.54g)与发烟硝酸(5ml)反应制备)的三氟乙酸酐(25ml)悬浮液，于-15℃搅拌下加入溶于三氟乙酸(20ml)和三氟乙酸酐(25ml)的上述氯哒嗪(9.39g)，保持温度低于-15°。室温下搅拌过夜，浓缩然后加入乙酸钠(25g)和高氯酸钠(15g)的水(200ml)溶液。反应混合物用氯仿抽提，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩至50ml并于搅拌下倒入乙醚(250ml)中。收集沉淀，干燥，得到4，4′-二甲氧基-3，3′-双(6-氯-3-哒嗪基甲基)-二苯基高氯酸碘鎓粗制品(14g)。1HNMRδ(DMSO-d6)3.80(3H，s，-OCH3)，4.20(2H，s，-CH2Ar)，7.05(1H，m，Ar-5H)，7.65(2H，m，PyH)和8.00(2H，m，Ar-2，6H)。
(e)上面的碘盐(12.45g〕、L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯(8.98g)、三乙胺(4.05g)和紫青铜(1.0g)在二氯甲烷(50ml)中搅拌18小时。反应混合液过滤后，依次用乙酸水溶液、2N氢氧化钠和水洗涤，然后用无水硫酸镁干燥并蒸干。将残余物与较小的另一份(来自0.72g碘鎓盐)合并，用硅胶(400g)柱色谱纯化，用乙酸乙酯/汽油(60°-80°)〔1∶3〕洗脱，得到棕色泡状L-3，5-二溴-3′-(6-氯-3-哒嗪基甲基)-O-甲基-N-三氟乙酰-1-甲腺原氨酸甲酯(4.0g)。1H NMRδ(CDCl3)3.06(2H，m，ArCH2CH)，3.84和3.93(6H，2s，-OCH3)，4.19(2H，s，ArCH2Py)，4.75(1H，m，ArCH2CH)，6.62(3H，m，ArH)，7.17(2H，m，PyH)和7.23(2H，s，ArH)。
(f)将上述二溴化合物(3.27g)溶于含乙酸钠(0.79g)的乙酸(20ml)中，回流1.25小时。加入足够的水(约2ml)溶解沉淀出的氯化物，将溶液蒸干。残余物在水和乙酸乙酯中分配，移出有机相并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，随后用无水硫酸镁干燥并蒸干。残留物用乙酸乙酯/汽油(60°-80°)结晶，得到L-3，5-二溴-O-甲基-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)-N-三氟乙酰甲腺原氨酸甲酯(2.52g，79％)，熔点176°-8°。
(g)将上述哒嗪酮(2.45g)溶于无水二氯甲烷(40ml)，冷却并在0℃搅拌。加入溶于二氯甲烷(3ml)中的三溴化硼(6.46g)，形成红棕色沉淀。混合物在室温搅拌1.5小时后加入碎冰。过滤混合物，收集沉淀并溶于2N氢氧化钠(30ml)中，将溶液用蒸气浴加热15分钟，然后加入乙酸至pH 5并冷却。收集沉淀，洗涤并干燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)-甲腺原氨酸(1.74g，88％)，熔点278°-9°(分解)。
或者是，为反应步骤(e)在(d)中制备的高氯酸盐，可用三氟乙酸碘鎓盐来替代，其制备方法如下碘(159g)悬浮于三氟乙酸酐(1升)中，通氮气搅拌，在1.5小时内加入发烟硝酸(350ml)，保持温度在36°至40°间。随后加入三氟乙酸酐(300ml)，混合物在氮气流下保持40℃直至所有氮的氧化物被除去，随后可于室温放置过夜。在减压条件下除去溶剂。残余的溶剂通过与三氟乙酸酐(2×300ml)共沸除去。然后将浅黄色残留的固体悬浮于三氟乙酸酐(1.2升)中，搅拌并冷却至-20°。逐滴加入溶于三氟乙酸(1.2升)的2-(6-氯-3-哒嗪基甲基)苯甲醚(600g)溶液，保持温度在-10°至-20°间。混合物于-10°搅拌1小时，然后室温搅拌过夜。减压除去溶剂，并将残余物倾入搅拌着的硫酸钠(3.5kg)水(20升)溶液中。用稀氢氧化钠水溶液将混合液的pH调至pH 2左右。随后用二氯甲烷(2×3升，1×2升)抽提，合并有机抽提物，干燥(MgSO4)，过滤，将体积减至2升，加到激烈搅拌的乙醚(12升)中。滤除深灰色固体沉淀，用醚洗，并在真空烘箱中于40°干燥6小时，得到4，4′-二甲氧基-3，3′-双(6-氯-3-哒嗪基甲基)二苯基三氟乙酸碘鎓(8.14g，90％)，熔点145-147℃。
该盐用类似于上面2(e)、(f)和(g)的方法进一步反应，得到所需的L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)甲腺原氨酸。
实施例2AL-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)甲腺原氨酸(化合物2)的制备(a)2-(6-氯-3-哒嗪基甲基)苯甲醚(按实施例2(c)制备)(2.35g)溶于无水二氯甲烷(20ml)中，搅拌下冷却至-50°。滴加三溴化硼(3ml)。然后将溶液温热至室温。0.5小时后将橙色反应混合液倾入冰/水(200ml)中并加入丙酮溶解沉淀。用二氯甲烷抽提混合物，分离有机抽提物，用水洗涤，干燥并蒸干。残余物用乙酸乙酯和汽油重结晶，得到2-(6-氯-3-哒嗪基甲基)苯酚(1.75g，80％)，熔点132°-132.5°。元素分析结果C，59.61；H，4.13；N，12.47；Cl，16.09；C11H9ClN2O理论值C，59.87；H，4.11；N，12.70；Cl，16.07％。
(b)往搅拌着的上述酚(2.4g)和脲(14g)的75％硫酸溶液中缓慢加入叔丁醇(17ml)。将混合物充分搅拌再加入叔丁醇，4小时后18ml，24小时后5ml，28小时后20ml。120小时后将反应混合液倾入水中，分离并除去有机相，用乙醚彻底抽提水相。合并乙醚抽提物用饱和盐水洗涤，干燥并蒸干。残余物用乙醚和汽油重结晶，得到2，4二叔丁基-6-(6-氯3-哒嗪基甲基)苯酚(3.43g，94％)，熔点143.0°-143.5°。元素分析结果C，68.32；H，7.51；N，8.36；Cl，10.89；C19H25ClN2O理论值C，68.56；H，7.57；N，8.41；Cl，10.65％。
(c)将该酚(1.95g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯(3.24g)的乙醚(100ml)溶液于室温在氩气中搅拌，随后用活性二氧化锰(3×5g)处理。4小时后过滤并加入四氯化钛(5ml)，2分钟后将黑色溶液用水处理并用乙酸乙酯充分抽提。合并有机抽提物，用饱和盐水洗涤，干燥并蒸干。残余物用硅胶色谱分离，用汽油和乙醚作洗脱液。得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氯-3-哒嗪基甲基)-N-三氟乙酰甲腺原氨酸甲酯(2.31g，55％)，熔点84°-86°。
(d)将该二溴甲腺原氨酸(2.76g)和无水乙酸钠(0.78g)的乙酸(25ml)溶液加热回流10小时，冷却后倾入冰水中，滤出沉淀并用乙酸乙酯溶解，干燥并蒸干，得到L-3，5-二溴-5′-叔丁基-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)-N-三氟乙酰甲腺原氨酸甲酯(2.4g，55％)，熔点112°-115°。
(e)该哒嗪酮(0.200g)和Hbr(1ml)的冰乙酸(20ml)溶液加热回流3天。随后将溶液冷却，用水稀释并用2N氢氧化钠水溶液碱化，用乙酸调pH 6。将沉淀过滤、洗涤、干燥，得到L-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)甲腺原氨酸(0.100g，65％)，熔点245°-247°(分解)。在光谱上与前面分离的物质(实施例2(g)〕相同。
实施例2BL-3，5-二溴-3′-(6-氧-3(1H)-哒嗪基甲基)甲腺原氨酸(化合物2)的制备(a)三(三氟乙酸)碘(用碘(10.0g)和发烟硝酸(20.95ml)在乙酸酐和三氟乙酸中制备)的乙酸酐(50ml)溶液冷却至-10°，滴加入2-甲氧基苯乙腈(30.0g)的三氟乙酸(60ml)和乙酸酐(30ml)溶液。滴加过程中使混合物温度维持在0°以下，随后于室温下放置过夜。然后将混合液倾入充分搅拌的冰冷的乙酸钠(100g)和高氯酸钠(13.0g)的水(600ml)溶液中。滤出沉淀用水和乙醚洗涤，得到3，3′-二氰甲基-4，4′-二甲氧基-二苯基高氯酸碘鎓，为细小的暗黄色固体(23.6g，57％)，熔点183°-4°(自甲醇/二乙醚中)。
(b)该碘鎓盐(22.6g)、L-3，5-二溴-N-三氟乙酰酪氨酸甲酯、三乙胺(6.1g)的二氯甲烷(300ml)溶液用紫青铜(1g)处理，混合物于室温搅拌20小时。过滤反应液并将滤液用2N盐酸(2×200ml)、水(2×200ml)和2N氢氧化钠水溶液(3×200ml)洗涤。然后将有机溶液用硫酸镁干燥并在减压下蒸干。油状残余物溶于二氯甲烷(30ml)并倾入汽油中。滤出固体沉淀并用二氯甲烷/汽油重结晶，得到L-3，5-二溴-3′-氰甲基-O-甲基-N-三氟乙酰甲腺原氨酸甲酯，是一种无色晶状体，熔点148°-149°。母液通过硅胶色谱可得到另一份这种化合物(总计8.05g，31％)。
(c)该二溴甲腺原氨酸(120mg)和3，6-二氯哒嗪(31mg)的二甲基甲酰胺(2ml)溶液中加入氢化钠(30mg，50％油分散体)，于室温放置50分钟。随后用冰处理反应液，用二氯甲烷抽提水相，然后用饱和盐水洗有机溶液，最后干燥并蒸干。残余物在制备型硅胶色谱板上层析，分离出3，5-二溴-3′-(1-(6-氯-3-哒嗪基)-1-氰甲基)-O-甲基-N-三氟乙酰甲腺原氨酸甲酯(5mg)。1HNMRδ(CDCl3)3.12(1H，m)，3.27(1H，m)，3.79(3H，s)，3.86(3H，s)，4.86(1H，m)，5.80(1H，s)，6.72(1H，dd)，6.83(1H，d)，7.04(1H，d)，7.15(1H，宽m)，7.37(2H，s)，7.50(2H，dd)。
用标准方法对此中间物进一步精细加工就得到了题头化合物。
实施例38，8-亚乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氢-4-甲基-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物3)的制备
a)2-氰基-2-(4，4-亚乙二氧基亚环己基)乙酸乙酯于室温下往1，4-环己二酮单乙二醇缩酮(25g，0.160mol)和氰乙酸乙酯(18g，0.160mol)在甲苯(400ml)中的混合液中滴加二乙胺(25g，0.337mol)。反应混合液加热回流过夜(用Dean Stark装置)。反应液冷却后分配在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液(3×)中，有机抽提物用硫酸钠干燥、过滤，在真空中浓缩并用乙醇重结晶得到白色固体题头化合物(15.8g，45％)熔点80-81℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.28(q，J＝7.2Hz，2H)，4.00(s，4H)，3.18(t，J＝6.5Hz，2H)，2.85(t，J＝6.5Hz，2H)，1.89(t，J＝6.5Hz，2H)，1.82(t，J＝6.5Hz，2H)，1.35(t，J＝7.1Hz，3H)。
b)2-氨基-6，6-亚乙二氧基-4，5，6，7-四氢化苯并〔b〕噻吩-3-羧酸乙酯在0℃下往实施例3(a)化合物(10g，45.6mmol)、硫(1.6g，50.2mmol)的乙醇(164ml)悬浮液中滴加二乙胺(3.6g，50.2mmol)的乙醇(26ml)溶液。得到的溶液在0℃搅拌1小时后在室温搅拌3.5小时。用乙酸乙酯使反应停止，并用饱和氯化铵溶液分溶，用乙酸乙酯抽提水相，有机抽提物用盐水洗涤，合并有机抽提物，用硫酸钠干燥，过滤并在真空中浓缩后，色谱(硅胶，5-10％梯度CH2Cl2EtOAc)分离得到油状题头化合物(11.3g，87％)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.25(q，J＝7.1Hz，2H)，4.02(s，4H)，2.92(t，J＝6.5Hz，2H)，2.74(s，2H)，1.90(t，J＝6.6Hz，2H)，1.33(t，J＝7.1Hz，3H)。
c)7，7-亚乙二氧基-4-羟基-2-甲基-5，6，7，8-四氢化苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡啶-2-羧酸乙酯室温下往实施例3(b)中化合物(11.2g，39.5mmol)的甲苯(307ml)溶液中加入3-乙氧基丁烯酸乙酯(12.4g，78.6mmol)和樟脑磺酸(0.78g，3.4mmol)。用Dean Stark分水器将反应混合液加热回流3.5小时。冷却混合液并往里滴加新鲜配制的1M乙醇钠溶液(49ml)，滴加完后立刻将混合液加热回流3小时。冷却并滤出沉淀。将所得盐溶于甲醇(60ml)，加水(500ml)和乙酸(2ml)得到黄色固体的题头化合物(10.4g，76％)熔点94-95℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.1Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.26(t，J＝6.5Hz，2H)，3.02(s，2H)，2.81(s，3H)，2.02(t，J＝6.5Hz，2H)，1.47(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z 350[M+H]+；C17H19NO5S元素分析理论值C，58.44；H，5.48；N，4.01；实验值C，58.34；H，5.46；N，3.86。
d)7，7-亚乙二氧基4-三氟甲基磺酰氧-2-甲基-5，6，7，8-四氢化苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡啶-3-羧酸乙酯往实施例3(c)中化合物(5.0g，14.3mmol)的吡啶(50ml)溶液中滴加三氟甲磺酸酐(4.0g，14.2mmol)。反应混合液在0℃搅拌4小时至反应完全。反应混合液用硫酸铜水溶液(3×)洗涤，随后用水(2×)和盐水(2×)洗涤。将有机相蒸发，用无水硫酸钠脱水干燥，并减压浓缩。经急骤层析(硅胶，1∶1己烷∶乙酸乙酯)纯化得到淡黄色题头化合物(3.7g，54％)熔点133-134℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.43(q，J＝7.2Hz，2H)，4.06(s，4H)，3.16(t，J＝6.5Hz，2H)，3.10(s，2H)，2.77(s，3H)，2.03(t，J＝6.8Hz，2H)，1.41(t，J＝7.1Hz，3H)；MS(ESI)m/z 482[M+H]+；C18H18F3NO7S2元素分析理论值C，44.90；H，3.77；N，2.91；实验值C，45.03；H，3.62；N，2.89。
(e)8，8-亚乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氢-4-甲基-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮室温下向实施例3(d)中化合物(2.4g，5.0mmol)的甲醇(40ml)溶液中加入一水合肼(4.1g，82.3mmol)。反应混合物加热回流3小时。冷却后分配在pH 7的含水缓冲液和乙酸乙酯中。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤并在真空中浓缩后，用甲醇/乙酸乙酯重结晶得到淡黄色固体的题头化合物(0.99g，60％)。1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ4.05(s，4H)，3.15(t，J＝6.5Hz，2H)，3.04(s，2H)，2.82(s，3H)，2.06(t，J＝6.5Hz，2H)；MS(ESI)m/z 318[M+H]+；C15H15N3O3S·0.25H2O元素分析理论值C，55.97；H，4.85；N，13.05；实验值C，55.85；H，4.75；N，13.30。
实施例44-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯乙醛(化合物4)的制备
a)4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酸甲酯在氩气氛下于0℃用氯化铝(8.0g，60mmol)处理溶于250ml甲苯的甲基对苯二甲酰氯(6.2g，31mmol)溶液。将搅拌的混合物加热到35℃0.5小时后缓缓加入100g冰，随后加入150ml乙酸乙酯、50ml浓HCl和50ml水。分层后，用100ml乙酸乙酯抽提水相两次。合并有机部分，依次用水(2×75ml)和盐水(1×75ml)洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩后得到白色固体。用乙酸乙酯和己烷重结晶后得到6.0g(79％)白色针状化合物。熔点117-118℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.15(d，J＝8.35Hz，2H)，7.83(d，J＝8.30Hz，2H)，7.73(d，J＝8.18Hz，2H)，7.31(d，J＝8.04Hz，2H)，3.98(s，3H)，2.46(s，3H)；MS(ESI)m/z 255[M+H]+。
b)4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酸4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酸甲酯(5.00g，20.0mmol)溶于150ml2∶1的四氢呋喃/水中，在搅拌下用一水合氢氧化锂(2.0g，48mmol)在65℃处理。0.5小时后将浑浊的反应液冷却至室温并用乙酸乙酯(300ml)和10％HCl(水溶液)处理。分离有机相用水(2×50ml)和盐水(1×50ml)洗涤，用硫酸镁干燥、过滤并浓缩后得白色泡沫体。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.22(d，J＝8.34Hz，2H)，7.81(d，J＝8.31Hz，2H)，7.73(d，J＝8.15Hz，2H)，7.31(d，J＝8.00Hz，2H)，2.46(s，3H)。
c)4-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯甲醚溶于250ml甲苯的实施例4(b)的化合物与乙二酰氯(21.8g，0.17mmol)反应。混合液加热回流2小时后浓缩，并于25℃0.5mmHg压力下放置过夜。所得固体溶于100ml苯甲醚并于0℃用氯化铝(11.2g，84mmol)处理。混合物于70℃加热1小时并缓慢加入100g冰，随后加入150ml乙酸乙酯、50ml浓HCl和50ml水。分层后，水相用100ml乙酸乙酯抽提。合并有机抽提物并用水(2×75ml)和盐水(1×75ml)洗涤，用硫酸镁干燥、过滤并浓缩后得到白色固体。自乙酸乙酯和己烷中重结晶得到4.6g(70％)题头化合物，熔点167-169℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.06Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，7.0(d，J＝8.74Hz，2H)，3.92(s，3H)，2.47(s，3H)；MS(ESI)m/z 331[M+H]+。
d)4-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯酚溶于20ml二氯甲烷的实施例4(c)的化合物(700mg，2.12mmol)溶液与氯化铝(1.0g，7.5mmol)和7.0ml溶于二氯甲烷的1.0M三氯化硼反应，加热回流1小时。随后混合物用100ml二氯甲烷稀释并依次用10％HCl(水溶液)(1×25ml)、水(1×25ml)和盐水(1×25ml)洗涤。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩得黑色残余物，用急骤层析(硅胶，用1∶1乙酸乙酯∶己烷洗脱)分离得到550mg(82％)题头化合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.8-7.9(m，6H)，7.77(d，J＝8.05Hz，2H)，7.32(d，J＝8.01Hz，2H)，6.93(d，J＝8.6Hz，2H)，2.47(s，3H)。
e)三氟甲磺酸4-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯酯溶于THF(20ml)的实施例4(d)的化合物(320mg，1.0mmol)溶液在0℃用氢化钠(40mg，1.67mmol)和N-苯基三氟甲磺酰亚胺(500mg，1.40mmol)处理。反应混合物温热至室温，搅拌18小时，随后分配在乙酸乙酯和盐水中，分层后有机抽提物用硫酸镁干燥并蒸干。急骤层析(硅胶，80∶20己烷∶乙酸乙酯)纯化后得到题头化合物(300mg，66％)，熔点180-181℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.96(d，J＝8.6Hz，2H)，7.89(s，4H)，7.76(d，J＝8.1Hz，2H)，7.45(d，J＝8.6Hz，2H)，7.33(d，J＝8.1Hz，2H)，2.47(s，3H)。
f)4-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯乙醛往实施例4(e)化合物(445mg，1.0mmol)的DMF(10ml)溶液中加入烯丙基三丁基锡(0.35ml，1.12mmol)、双(三苯膦)氯化钯(II)(55mg，0.077mmol)和氯化锂(125mg，2.95mmol)。反应混合物于90℃加热1小时，冷却至室温，随后分配在乙酸乙酯和盐水中。有机相用硫酸镁干燥，浓缩后的残余物含有所要的产物3-〔4-〔4-(4-甲基苯甲酰)苯甲酰〕苯基〕-1-丙烯和含锡副产物。将此物质经急骤层析(硅胶，用95∶5己烷∶乙酸乙酯洗脱)纯化，可除去大多数，但非全部含锡杂质。经第二次色谱处理(己烷中乙酸乙酯含量从5％至10％梯度洗脱)得到100mg(30％)纯净的烯。随后于-78℃将其溶于二氯甲烷/甲醇(3∶1，16ml)。向该溶液中通臭氧5分钟。滴五滴甲硫醚终止反应并继续于-78℃搅拌30分钟。蒸干溶剂并将所得物用急骤层析(硅胶，用85∶15到75∶25己烷∶乙酸乙酯梯度洗脱)纯化，得到题头化合物(40mg，40％)，熔点188-190℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ9.83(s，1H)，7.88(s，4H)，7.86(d，J＝8.1Hz，2H)，4.03(s，4H)，3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z 343[M+H]+。
实施例51，4-二甲基-8，8-亚乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氢-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物5)的制备
1，4-二甲基-8，8-亚乙二氧基-2，3，7，8，9，10-六氢-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮室温下实施例3(d)中化合物(0.4g，0.83mmol)溶于甲醇(6.7ml)，与甲肼(0.16g，3.45mmol)反应，混合液加热回流2小时。冷却混合液，滤出沉淀，其中含有150mg 2，4-二甲基区域异构体。滤液蒸干后用急骤层析(硅胶，用80∶20∶5乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸洗脱)纯化得到黄色固体的题头化合物(22mg)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.03(s，4H)3.73(s，3H)，3.76(t，J＝6.0Hz，2H)，3.00(s，2H)，2.80(s，3H)，2.03(t，J＝6.0Hz，2H)；MS(ESI)m/z 332[M+H]+。
实施例64-羧基-二苯酮-4-甲酰胺基-反-4-甲基环己基-N-己基甲酰胺(化合物6)的制备
a)N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基环己基羧酸于0℃将氢氧化钠(1N，100ml，100mmol)水溶液加入4-反-氨甲基环己基羧酸(9.0g，60mmol)在二
烷(100ml)及水(100ml)中的溶液中。加入Boc酸酐(15.9g，66mmol)并将反应液温热至室温，搅拌过夜，将溶液浓缩至50ml后，用EtOAc(100ml)稀释并用KHSO4水溶液(1N)酸化至pH 2。将有机相用水(100ml)抽提两次，并将有机物在减压下浓缩。得到的固体用EtOAc/己烷重结晶得到9.2g+3.4g(第二批产物)白色固体(80％回收率)。MS(ES)m/e 242[M+H]+。
b)N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基环己基(开氏肟树脂)羧酸酯开氏肟树脂(20g，0.7mmol/g填充量，Advanced Chem Tech公司)加入到N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基环己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)的二氯甲烷(200ml)溶液中并于室温下温和搅拌过夜。滤出并收集固体，并用二氯甲烷(5×100ml)洗涤。将树脂重新悬浮于二氯甲烷(200ml)中并加入N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基环己基羧酸(5.0g，20mmol)和DCC(4.4g，20mmol)，于室温下温和地混合过夜。滤出并收集固体，用二氯甲烷(5×100ml)洗涤并在真空中干燥。IR(KBr，cm-1)＝1820，1771，1520。
c)反-4-氨甲基环己基(开氏肟树脂)羧酸酯N-叔丁氧羰基-反-4-氨甲基环己基(开氏肟树脂)羧酸酯(20g)悬浮于二氯甲烷(100ml)并加入TFA(25ml)。反应液温和地混合0.5小时，滤出并收集固体，用二氯甲烷(5×100ml)洗涤，在真空中干燥过夜。IR(KBr，cm-1) ＝3150，1770，1526。
d)4-羧基-二苯酮-4-甲酰胺基-反-4-甲基环己基(开氏肟树脂)羧酸酯反-4-氨甲基环己基(开氏肟树脂)羧酸酯(200mg)悬浮于DMF(3.1ml)并加入N-甲基吗啉(0.2ml)、4，4′-二苯酮二羧酸(190mg，0.7mmol)和HBTU(265mg，0.7mmol)。反应液温和地混合3小时。滤出并收集固体，依次用DMF(3×20ml)和水(3×20ml)洗涤。重新悬浮于DMF(3.0ml)和N-甲基吗啉(0.1ml)中，并加入4，4′-二苯酮二羧酸(0.35mmol)和HBTU(0.35mmol)，反应液温和地混合3小时。滤出并收集固体，依次用DMF(3×20ml)、水(3×20ml)、二氯甲烷(5×20ml)洗涤后，在真空中干燥。
e)4-羧基-二苯酮-4-甲酰氨基-反-4-甲基-环己基-N-己基甲酰胺4-羧基-二苯酮-4-甲酰氨基-反-4-甲基-环己基(开氏肟树脂)羧酸酯(200mg)悬浮于二氯甲烷(3.0ml)中并加入己胺(0.3mmol)，反应液轻轻混合3小时后过滤，滤液在真空中浓缩得到题头化合物MS(ES)m/e 493[M+H]+。
实施例74-硝基-苯甲酰氨-反-4-甲基-环己基-N-己基甲酰胺(化合物7)的制备
4-硝基-苯甲酰氨-反-4-甲基-环己基-N-己基甲酰氨按照实施例6(a)-(e)的方法，但是以4-硝基苯甲酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，可得到题头化合物MS(ES)m/e 390[M+H]+。
实施例84-乙酰氨基-苯甲酰氨基-反-4-甲基-环己基-N-1-(氨基-R-2-〔甲氧甲基〕-吡咯烷)甲酰胺(化合物8)的制备
按照实施例6(a)-(e)的方法，但是以4-乙酰氨基苯甲酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，R-1-氨基-2-(甲氧甲基)-吡咯烷(RAMP)代替己胺，可得到题头化合物MS(ES)m/e 331[M+H]+。
实施例94-甲酰-E-肉桂酰氨基-反-4-甲基环己基-N-(丙基)甲酰胺(化合物9)的制备
按照实施例6(a)-(e)的方法，但是以4-甲酰肉桂酸代替4，4′-二苯酮二羧酸，以丙胺代替己胺，可得到题头化合物MS(ES)m/e 357[M+H]+。
实施例102，3，7，8，9，10-六氢-4-甲基-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮(化合物10)的制备
a)4-羟基-2-甲基-5，6，7，8-四氢化苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡啶-2-甲酸乙酯将2-氨基-4，5，6，7-四氢化苯并〔b〕噻吩-3-羧酸乙酯(8.9g，39mmol)和3-乙氧基丁烯酸乙酯(12.4g，78mmol)溶于甲苯(300ml)，与樟脑磺酸(0.78g，3.4mmol)反应。反应混合液在Dean Stark分水器中加热回流3小时。混合液冷却至室温后用新鲜配制的1M乙醇钠(48ml，48mmol)处理。加完样后反应液加热回流3小时。反应液冷却浓缩后，残余物溶于乙酸乙酯。加入乙酸(2ml)，溶剂蒸干后的残余固体用甲醇研磨，得到灰白色固体的题头化合物(8.4g，74％)熔点140℃；1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.48(q，J＝7.2Hz，2H)，3.04(br s，2H)，2.81(s，3H)，2.80(br s，2H)，1.87(br s，4H)，1.47(t，J＝7.2Hz，3H)；C15H17NO3S元素分析理论值C，61.83；H，5.88；N，4.81；实验值C，61.69；H，5.81；N，4.73。
b)4-氯-2-甲基-5，6，7，8-四氢化苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡啶-2-羧酸乙酯实施例10(a)的化合物(8.0g，27.4mmol)溶于磷酰氯(100ml)中，回流3.5小时。减压除去磷酰氯，残留的油状物溶于乙酸乙酯，用5％碳酸氢钠洗涤，用无水硫酸钠干燥。溶剂蒸干后得到晶状题头化合物(8.5g，95％)熔点65-66℃，1H NMR(400MHz，CDCl3)δ4.47(q，J＝7.1Hz，2H)，3.10(br s，2H)，2.85(br s，2H)，2.60(s，3H)，1.89(br s，4H)，1.43(t，J7.1Hz，3H)；C15H16ClNO2S·0.125H2O元素分析理论值C，57.73；H，5.25；N，4.49；实验值C，57.69；H， 5.08；N，4.30。
c)2，3，7，8，9，10-六氢-4-甲基-1H-苯并〔b〕噻吩并〔2，3-b〕吡唑并〔3，4-d〕吡啶-3-酮实施例10(b)的化合物(2.0g，6.4mmol)溶于甲醇(50ml)，与一水合肼(10ml)反应，混合液加热回流16小时，反应液倒入稀盐酸中，沉淀出黄色固体的题头化合物(1.8g)，1H NMR(400MHz，d4-MeOH)δ3.01(br s，2H)，3.00(s，3H)，2.92(br s，2H)，2.00(br s，4H)；C13H13N3OS·HCl·0.25H2O元素分析理论值C，52.00；H，4.87；N，13.99；实验值C，51.92；H，5.01；N，13.70。
实施例11SH2区拮抗剂功能试验方法利用大肠杆菌中表达的融合蛋白的SH2区，在体外测量了化合物对不同的人SH2区的抑制能力。这里用到的SH2区是人的src SH2区、Grb2 SH2区、lck SH2区、fyn SH2区、SH-PTP2 SH2区、p85 SH2区和hcp SH2区。
含有sre、lck和hcp SH2区的融合蛋白可用下面的通式表示DET1-DET2-间隔区-ek-SH2，其中DET1、DET2、间隔区、ek和SH2如下所述。DET1(“确定附加表位1”(defined epitope tag1))(SEQ ID NO1)是在1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)外壳蛋白gp 120(或gp 160)中发现的一个11氨基酸序列。针对HIV-1 gp 120(或gp 160)不同表位的单克隆抗体已为本领域所熟知，例如可参见U.S.Patent 5166050。一个优选的例子是单充隆抗体178.1(见Thiriart等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)143卷1832-1836页(1989))，它是用酵母表达的HIV-1 HB10株gp 160分子免疫小鼠后制备的(Ratner等，《自然》(Nature〕313卷277-284页(1985))。这个标记物可用于蛋白表达检测(利用Western印迹)和蛋白质的纯化(利用亲和层析)，还可用于成形试验，试验中利用178.1抗体可俘获或固定融合蛋白。DET2是一个6组氨酸序列标记(SEQID NO2)，它与含镍树脂结合可用于纯化目的。间隔区(SEQ IDNO3)用于在构建物的指定位置设计一个BamHI限制位点。-ek-指一个肠肽酶蛋白酶的识别序列(SEQ ID NO4)，该酶保证了标记物从SH2区可选择地去除，从而得到一个不含外源氨基酸的SH2区。对于晶体学研究，不含外源氨基酸的SH2区比标记蛋白更为可取。SH2指不同蛋白质的SH2区。
设计编码每个DET1-DET2-间隔区-ek SH2的DNA序列时，在间隔区-ek-SH2区侧翼引入指定的限制性酶切位点(BamHI和XbaI)，使得不同的间隔区-ek-SH2构建物很容易置换入下面的方法2或3中提到的任何一种载体中，从而得到DET1-DET2-间隔区-ek-SH2标记蛋白。编码每个DET1-DET2-间隔区-ek-SH2构建物的DNA序列在设计中也使得完整标记的SH2区能以NdeI-XbaI片段形式转入任何表达型载体，该载体含有一个在大肠杆菌转录和翻译调控序列下游适当位置的NdeI位点和一个与XbaI匹配的下游克隆位点。尽管任何合适的载体都能得到相似的结果(例如pET-11a，Novagen，Inc.，)，但在本实验中用到的载体是大肠杆菌表达型载体pEA1KnRBS3。这个载体是Shatzman，A，Gross，M和Rosenberg，M于1990年在“利用含λ噬菌体调控序列的载体进行表达”一文中描述的系列载体的衍生载体。该文收录于纽约格林出版社和威利交叉科学出版社(Green Pubishing and Wiley-Interscience N.Y.)出版的《现代分子生物学方法》(F.A.Ausubel等编)一书16.3.1-16.3.11页。特定的载体pEA1KnRBS3见Bergsma等，1991年《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)266卷23204-23214页。
下面的方法描述了鸡src、人src、人lck和人hcp SH2区的表达。首先，鸡src SH2区以DET1-DET2-间隔区-SH2形式表达，然后，其它的SH2区插入到这个载体替换鸡src，表达出DET1-DET2-间隔区-ek-间隔区SH2形式的蛋白。方法1含有标记物DET1和DET2的鸡src SH2区(DET1-DET2-间隔区-SH2)的克隆与表达利用下面的引物，用本领域的技术人员熟知的方法，从含有鸡src基因的cDNA克隆(p5H；Levy等，1986，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83卷4228页)中PCR扩增出编码标记蛋白DET1-DET2-间隔区-SH2的一段DNA序列。5′TTCCATATGAAAAGTATTCGTATTCAGCGTGGCCCGGGCCGTCACCACCACCACCACCACGGGATCCCCGCTGAAGAGTGGTACTTT 3′(SEQ ID NO17)划线处为NdeI识别位点(5′)和BamHI识别位点(3′)。5′GGAATTCTAGATTACTAGGACGTGGGGCAGACGTT 3′(SEQID NO18)划线处为XbaI识别位点。
PCR产物用NdeI和XbaI消化，随后消化片段用琼脂糖凝胶分离。将该片段与NdeI-XbaI消化的pEA1KnRBS3载体连接(Bergsma等，前文)，该载体已用琼脂糖凝胶纯化为一个6.5kbp的片段。连接反应用于转化大肠杆菌MM294cI+(F.A.Ausubel等，前文)。用DNA测序对质粒进行了鉴定，证实其中插入了正确的片段。在λ噬菌体PL启动子和调控系统控制下，所得的质粒编码DET1-DET2-间隔区-SH2。从MM294cI+中纯化质粒DNA并用来转化大肠杆菌AR 120菌株。在这个宿主菌株中，向生长的培养物中加入萘啶酮酸可诱导噬菌体启动子的表达，如F.A.Ausubel等在前文所述。含有这种质粒的AR 120经萘啶酮酸诱导后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色(F.A.Ausubel等，前文)对细胞蛋白进行分析，得到一条表观分子量为15,000的蛋白带；在未经诱导的细胞或虽经诱导但所含pEA1KnRBS3中缺少PCR扩增片段的细胞中均未发现此带。Western印迹证实，诱导产生的蛋白带可与抗DET1的单克隆抗体178.1反应。方法2含有标记物和一个肠肽酶蛋白水解断裂位点的人src SH2区(DET1-DET2-间隔区-ek src SH2)的克隆、表达和纯化用下面的引物，从含有人src基因(c-src SH2 DNA序列与Takeya，T和Hanafusa，H 1983年在《细胞》(Cell)32卷881-890页所述完全相同)的cDNA克隆中PCR扩增出编码ek-src SH2蛋白的DNA序列5′CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGCTGAGGAGTGGTATTTT3′(SEQ ID NO19)划线处为BamHI识别位点。5′GGAATTCTAGACTATTAGGACGTGGGGCACACGGT 3′(SEQID NO20)划线处为XbaI识别位点。
用BamHI和XbaI消化PCR产物，随后用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段。该片段连接到BamHI-XbaI消化的表达型载体上，该载体含有方法1所述的标记鸡src基因DET1-DET2-间隔区-SH2。在这个载体中，BamHI位点位于DET2和SH2两个编码区之间，而XbaI位点位于SH2编码区3′端下游。连接反应用于转化大肠杆菌MM294cI+。构建物DET1-DET2-间隔区-ek-src SH2经DNA测序证实(SEQID NO5)，并如上面方法1所述在大肠杆菌AR 120菌株中诱导表达。萘啶酮酸诱导后，观察到了被考马斯亮蓝染色、Western印迹阳性的诱导蛋白带，其表观分子量为16,000。
在溶菌酶存在和中性pH条件下利用超声处理裂解细胞。离心后，可溶物用Ni++NTA柱层析。用平衡缓冲液(Tris缓冲液，pH 8，含0.5MNaCl)和含15mM咪唑的同一缓冲液洗柱后，用含25mM咪唑的平衡缓冲液可洗脱出高纯度的蛋白质。用这种方法纯化的SH2区，用下面的“结合实验”发现，可以一种特异的、可饱和的方式与合适的pY肽高亲和力结合，证明标记物并不影响其功能。这种表达的融合蛋白DET1-DET2-间隔区-ek-src SH2用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人src SH2区的特异性。方法3含有标记物和一个肠肽酶蛋白水解断裂位点的人lck SH2(DET1-DET2-间隔区-ek-lck SH2)的克隆与表达。
用下面的引物，从含人lck基因(基因库登记号M 36881)的cDNA克隆中PCR扩增出编码蛋白ek-lck SH2的DNA序列5′CGGGATCCTGGACGACGACGACAAAGAGCCCGAACCCTGGTTCTT 3′(SEQ ID NO21)
划线处为BamHI识别位点。5′GCTCTAGACTATTACTGGGGCTTCTGGGTCTG 3′(SEQ IDNO22)划线处为XbaI识别位点。
PCR产物用BamHI和XbaI消化，用琼脂糖凝胶电泳分离消化片段，该片段连接到BamHI-XbaI消化的、含有方法1所述的标记鸡src基因DET1-DET2-间隔区-SH2的表达型载体中。在这个载体中，BamHI位点位于DET2和SH2编码区之间，XbaI位点位于SH2编码区3′端下游。因而，ek-lck SH2序列就替换了上述载体的src SH2序列。这个连接反应用来转化大肠杆菌MM294cI+。含有DET1-DET2-间隔区-ek-lck SH2的构建物已为DNA测序(SEQ ID NO6)所证实，并如方法1所述在大肠杆菌AR 120菌株中诱导表达。萘啶酮酸诱导后，观察到了考马斯亮蓝染色的、Western印迹阳性、表观分子量为17,000的诱导蛋白带。
在溶菌酶存在和中性pH条件下利用超声波裂解细胞。离心后，可溶物用Ni++NTA柱层析。用平衡液(Tris缓冲液，pH 8，含0.5MNaCl)和含15mM咪唑的同一缓冲液洗柱后，用含25mM咪唑的平衡液洗脱出高度纯化的蛋白质。用这种方法纯化的SH2区，在下述的“结合实验”中被发现可以一种特异的、可饱和的方式与合适的pY肽高亲和力结合，证明标记物并不影响其功能。表达的融合蛋白DET1-DET2-间隔区-ek-lck SH2用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人lck SH2区的特异性。方法4含标记物和一个肠肽酶蛋白水解断裂位点的人hcp SH2区(DET1-DET2-间隔区-ek-hcp SH2)的克隆与表达从人胎儿肝脏RNA中用反转录PCR扩增出一编码ek-hcp SH2蛋白的DNA序列(hcp SH2 DNA序列与Shen，S-H在《自然》(Nature)(1991)352卷736-739页中所述相同)。用Tri-Reagent(分子研究中心股份有限公司(Molecular Research CenterInc.))和反转录系统(Reverse Transcriptase System)(GIBCO-BRL)按厂商说明分离RNA，用下面的引物进行PCR扩增5′GAAGATCTTGGACGACGACGACAAATCCCGTGGGTGGTTTCAC3′(SEQ ID NO23)划线处为Bgl II识别位点。5′GCTCTAGACTATTAACTAGTGGGATCGGAGCA 3′(SEQ IDNO24)划线处为XbaI识别位点。
PCR产物用Bgl II和XbaI消化，随后消化片段用琼脂糖凝胶电泳分离。分离的片段连接到BamHI-XbaI消化的、含有方法2所述的标记人src基因DET1-DET2-间隔区-ek-src SH2的表达型载体中。在这个载体中，BamHI位点位于DET2和ek编码区之间，XbaI位点位于SH2编码区3′端下游，因而ek-hcp SH2序列就替换了上述载体中的ek-src SH2序列。连接反应用来转化大肠杆菌MM294cI+。含DET1-DET2-间隔区-ek-hcp SH2的构建物已为DNA测序(SEQ IDNO7)所证实，并用于转化大肠杆菌GI 698(Invitrogen公司，圣迭戈，加州)，按产品说明，往培养基中加入色氨酸至10mg/ml，诱导λ噬菌体启动子的表达。30℃生长的细胞经色氨酸诱导后，观察到了考马斯亮蓝染色的、Western印迹阳性、表观分子量为15,000的诱导蛋白带。
在溶菌酶存在和中性pH条件下用超声波裂解细胞。离心后，不溶的沉淀用含8M脲的Tris缓冲液(pH 8)溶解，并结合到Ni++NTA柱上。用平衡缓冲液(Tris缓冲液，pH 8，含0.5M NaCl，8M脲，5mMBME)和含15mM咪唑的同一缓冲液洗柱。脲去除后，在5mM BME存在下蛋白质在柱中重折叠，用含300mM咪唑的Tris缓冲液(pH 8)洗脱出纯化的重折叠的蛋白质。用这种方法纯化的SH2区，在下述的“结合实验”中发现，可以特异的、可饱和的方式与合适的pY肽高亲和力结合，证明标记物不影响其功能且蛋白质已成功地重折叠。表达的融合蛋白DET1-DET2-间隔区-ek-hcp SH2用于下述的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人hcp SH2区的特异性。
按购自Pharmacia(新泽西州)的GST基因融合试剂盒内说明制备含有构建物GST-X-SH2的融合蛋白。GST对fyn、Grb2和SH-PTP2来说是标记序列谷胱甘肽s-转移酶表位(SEQ ID NO8)，对p85来说是标记序列谷胱甘肽s-转移酶表位(SEQ ID NO9)。SH2指fyn、Grb2、p85和SH-PTP2的SH2区，将其表达并用谷胱甘肽Sepharose 4B(Pharmacia)进行纯化，方法见《现代分子生物学方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，F.MAusubel等编，John Wiley and Sons股份有限公司出版，(1995)，16.7.1页。X是一个合适的接头，优选有6-21碱基对，用来保持SH2构建物位于读框和互补克隆中。就此而言，X的序列并不苛刻，本领域的技术人员很容易构建一个合适的接头。编码每个GST-X-SH2融合蛋白的DNA序列在设计中都使得所示限制位点(BamHI和EcoRI)在SH2区的侧翼。本实验中用的载体是大肠杆菌表达型载体，对fyn、Grb2和SH-PTP2来说是pGEX-2T(Pharmacia)，对p85来说是pGEX-3X(Pharmacia)。每种载体都使得SH2构建物带上如下所述的额外的C末端氨基酸。
编码人fyn(氨基酸143-252)SH2区(Yamamoto等，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)83卷5459-5463页(1986))的序列克隆到表达型载体pGEX-2T的BamHI和EcoRI位点。额外的C末端氨基酸为亮氨酸-苏氨酸-天冬酰胺-丝氨酸-丝氨酸(SEQ ID NO10)的SH2区用本领域的技术人员熟知的PCR技术克隆产生表达的融合蛋白GST-X-fyn。这个表达的融合蛋白随后用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人fyn SH2区的特异性。
人p85 SH2区编码人p85(氨基酸321-440)SH2区(Skolnik，E等，《细胞》(Cell)65卷83-90页(1991))的序列克隆到表达型载体pGEX-3X的BamHI和EcoRI位点。额外C末端氨基酸为天冬酰胺-丝氨酸-丝氨酸(SEQ ID NO11)的SH2区用本领域的技术人员熟知的PCR技术克隆产生表达的融合蛋白GST Xp85。这个表达的融合蛋白用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人p85 SH2区的特异性。
人SH-PTP2区编码人SH-PTP2(氨基酸1-106)SH2区(Bastien，L等，《生物化学与生物物理研究通讯》(Biochem.Biophys，Res.Commun.)196卷124-133页(1993))的序列克隆到表达型形体pGEX-2T的BamHI和EcoRI位点。额外C末端氨基酸为谷氨酰胺-苯丙氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸(SEQ IDNO12)的SH2区用本领域的技术人员熟知的PCR技术克隆产生表达的融合蛋白GST-X-SH-PTP2。这个表达的融合蛋白用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人SH-PTP2区的特异性。
人Grb2 SH2区编码人Grb2(氨基酸58-159)SH2区(Lowenstein.E.等，《细胞》(Cell)70卷431-442页(1992))的序列克隆到表达型载体pGEX-2T的BamHI和EcoRI位点。额外C末端氨基酸为异亮氨酸-组氨酸-精氨酸-天冬氨酸(SEQ ID NO25)的SH2区，用本领域的技术人员熟知的PCR技术克隆产生表达的融合蛋白GST-X-Grb2。用一个六核苷酸接头在GST和SH2区之间引入甘氨酸和丝氨酸。这个表达的融合蛋白用于下面的“结合实验”，其目的在于确定化合物选择性抑制人Grb2 SH2区的特异性。结合实验根据化合物选择性地抑制SH2区与相应的特异性pY肽结合的能力来确定这些化合物与这些SH2区的结合能力。
SH2区和pY肽的结合实验在用于ELISA的96孔板上进行。在Millipore 96孔滤板上，向亲水性Durapore(孔径0.65μm，目录号MADVN 6550)加入2μl(50％悬液)蛋白G Sepharose(购自新泽西Pharmacia，目录号170618-01)和2μl 2mg/ml的MAB 178.1(gp 120/SH2区融合蛋白src、lck和hcp)或0.25μl抗-GST多克隆抗血清(购自新泽西州Pharmacia)(GST/SH2区融合蛋白fyn、Grb2、p85和SH-PTP2)。向相应的孔中加入10pmol目标SH2区融合蛋白。用TBS-T(Tris缓冲盐加0.05％吐温20)将体积调至100μl，于室温温育并摇动1小时。随后用TBS-T(4℃)洗一次，再向每孔中加入90μl TBS-T。用TBS-T将特异的pY生物素化的肽稀释至浓度为1.0μM(这些肽可从宾夕法尼亚州的BachemBioscience公司、德克萨斯州的Genosys Biotechnologies公司和加州的California Peptide Research公司获得)。每孔加入10μl使终浓度为0.1μM(近似于每个SH2区/肽对的Kd)，终体积为100μl。实验板温育至达到结合平衡(4℃摇3小时)。实验板每孔用TBS-T(4℃)洗2次，然后每孔加入100μl SABC(链霉抗生物素蛋白生物素化辣根过氧化物酶复合物，购自加州Zymed公司，目录号93-0043。每10mlTBS-T中加1滴试剂A(链霉抗生物素蛋白)和1滴试剂B(AH-生物素结合的辣根过氧化物酶)，37℃温育30分钟，然后冷却至4℃)，于4℃温育30-60分钟。用TBS-T(4℃)洗板4次(250μl/孔/次)。在每孔中加入100μl 1mg/ml溶于柠檬酸缓冲液的OPD(邻苯二胺，Sigma化学公司，密苏里州圣路易斯)。每孔中加入100μl 10％的硫酸终止反应，从试验板的每孔中移出150μl加入ELISA板中，然后确定每个ELISA板的A490。
表1中(IC50)的确定每个对照或化合物都实验两次，取平均值，减去本底并从板中读出没有抑制作用的最大值。其他所有数据点都表示成最大值的百分比(或对照的百分比)。这些对照的百分比数值都用Macintosh的Kaleidagraph(最佳协同作用软件(Synergy Software))成图。这些图上的曲线都是非线性曲线，且符合以下方程F(x)＝Emax/(1+Kd/浓度)A斜率)这里Kd代表了每个曲线的IC50。
表2中(Ki)的确定每个化合物的Ki通过下面的方程(见附注)计算。这个扩展的方程必须在本实验条件下使用，因为pY生物素化肽没有大大过量(100×)于SH2区融合蛋白。IC50是用Kaleidagraph图由非线性曲线拟合得到的外推值。Rtot和*D是用于本实验的试剂的已知值。每个SH2区融合蛋白和pY生物素化肽的结合物的KD通常必须通过实验确定。KI＝(IC50-Rtot+Rtot/2((*D/(KD+*D))+(KD/(KD+*D+Rtot/2)))/(1+*D/KD+Rtot/KD((KD+*D/2)/(KD+*D)))KI＝(μM)竞争物的KDIC50＝(μM)抑制物的IC50，通过每个SH2区的竞争选择性实验数据的非线性曲线拟合得出Rtot＝(μM)1个实验(微量板)孔中SH2区总浓度*D＝(μM)每个SH2区特异性pY和生物素化肽的浓度KD＝(μM)每个SH2区特异性pY和生物素化肽的KD值IC50是50％应答或信号抑制时抑制剂的浓度KD是配体在受体/配体相互作用中的解离常数，通常等于饱和结合曲线上1/2最大值时配体的浓度。
用于上述“结合实验”的pY肽配体如下含一氨基己酸(Aca)连接物的生物素化pY肽配体用于src、lck和fynSH2区Glu-Pro-Gln-pTyr Glu-Glu Ile Pro Ile-Tyr-Leu(SEQ ID NO13)含一氨基己酸(Aca)连接物的生物素化pY肽配体用于p85 SH2Asp-Gly-Gly-pTyr-Met-Asp-Met-Ser-Lys-AspGlu(SEQ ID NO14)含一氨基己酸(Aca)连接物的生物素化pY肽配体用于SH-PTP2 SH2Glu-Asn-Gly-Leu-Asn-pTyr-Ile-Asp-Leu-AspLeu(SEQ ID NO15)含一氨基己酸(Aca)连接物的生物素化pY肽配体用于hcp SH2Thr-Pro-Pro-His-Leu Lys-pTyr-Phe-Tyr-Phe-Val-Val-Ser-Asp-Ser-Gly(SEQ ID NO16)含一氨基己酸(Aca)连接物的生物素化pY肽配体用于Grb2 SH2Leu-Pro-Val Pro-Glu-pTyr-Ile-Asn-Gln-SerVal(SEQ ID NO26)结合实验结果表I和II显示了SH2拮抗剂与所示SH2区的交叉反应性。从这些表中公开的结果中，很容易辩认出那些与lck SH2区的结合亲和力/抑制作用浓度比与其它SH2区结合亲和力/抑制作用浓度高50倍以上的化合物。
表ISrc SH2区拮抗剂与克隆的人SH2区的交叉反应活性(IC50)化合物 SrcLck Fyn SH- p85 Grb2 HcpPTP21 6μM 6μMNI NININIX2 NI NI NI NININI0.9μM3 16.1μM22.9μM NI NININI1.2μM4 40μM 163μM NI X NINI30μM5 63μM 100μM NI NININI0.1μM620μM NI NIX NINIX77.4μM 383μM NININININI816μM 126μM NINININI＞100μM9131μM 200μM NINININI12μM10X X NINININI1.2μMNI-300μM以上仍未有抑制作用X-未检测表IISrc SH2区拮抗剂与克隆的人SH2区的交叉反应活性(Ki)化合物 SrcLck Fyn SH- p85 Grb2HcpPTP217μM X NINININI X2NI NI NINININI X36μM 11μM NINININI X440μM 163μM NIXXNINI X528μM 149μM NINININI X613μM 50μM NINININI X720μM 320μM NINININI X812μM 360μM NININI330 X955μM 146μM NINININI X10XX XX NINININI XNI-在1000μM以下无抑制X-没有计算XX-没有检测尽管上面举例说明了本发明的优选实施方案，但应当理解本发明并不仅限于本文公开的具体说明，并保留对于在下面权利要求范围内的所有改进的权利。
序列表(1)概括信息(i)申请人DUNNINGTON，DAMIEN(ii)发明题目LCK SH2特异性化合物在治疗自身免疫病和同种异体移植排斥中的应用(iii)序列数26(iv)通讯地址(A)收件人SmithKline Beecham Corporation(B)街道709 Swedeland路(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)国家USA(F)ZIP19406(v)计算机可读形式(A)介质类型磁盘(B)计算机IBM兼容(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ 1.5版(vi)当前申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请数据(A)申请号08/386,381(B)申请日1995.2.10(A)申请号08/400,220(B)申请日1995.3.7(A)申请号08/497,357(B)申请日1995.6.30(viii)律师/代理人信息(A)姓名Dustman，Wayne J(B)登记号33,870(C)参考/备案号P50323-2L1(ix)电信信息(A)电话610-270-5023
(B)传真(C)电报(2)SEQ ID NO1信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg1 5 10(2)SEQ ID NO2信息(i)序列特征(A)长度6氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO2His His His His His His1 5(2)SEQ ID NO3信息(i)序列特征(A)长度3氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO3Gly Ile Leu1(2)SEQ ID NO4信息(i)序列特征(A)长度5氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO4Asp Asp Asp Asp Lys1 5(2)SEQ ID NO5信息(i)序列特征(A)长度130氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无
(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO5Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ala Glu Glu Trp Tyr Phe20 25 30Gly Lys Ile Thr Arg Arg Glu Ser Glu Arg Leu Leu Leu Asn Ala Glu35 40 45Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu Val Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly50 55 60Ala Tyr Cys Leu Ser Val Ser Asp Phe Asp Asn Ala Lys Gly Leu Asn65 70 75 80Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Lys Leu Asp Ser Gly Gly Phe Tyr Ile85 90 95Thr Ser Arg Thr Gln Phe Asn Ser Leu Gln Gln Leu Val Ala Tyr Tyr100 105 110Ser Lys His Ala Asp Gly Leu Cys His Arg Leu Thr Thr Val Cys Pro115 120 125Thr Ser130(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度134氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源
(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO6Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Glu Pro Glu Pro Trp Phe20 25 30Phe Lys Asn Leu Ser Arg Lys Asp Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ala Pro35 40 45Gly Asn Thr His Gly Ser Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu Ser Thr Ala50 55 60Gly Ser Phe Ser Leu Ser Val Arg Asp Phe Asp Gln Asn Gln Gly Glu65 70 75 80Val Val Lys His Tyr Lys Ile Arg Asn Leu Asp Asn Gly Gly Phe Tyr85 90 95Ile Ser Pro Arg Ile Thr Phe Pro Gly Leu His Glu Leu Val Arg His100 105 110Tyr Thr Asn Ala Ser Asp Gly Leu Cys Thr Arg Leu Ser Arg Pro Cys115 120 125Gln Thr Gln Lys Pro Gln130(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度133氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO7Met Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg His His His His1 5 10 15His His Gly Ile Leu Asp Asp Asp Asp Lys Ser Arg Gly Trp Phe His20 25 30Arg Asp Leu Ser Gly Leu Asp Ala Glu Thr Leu Leu Lys Gly Arg Gly25 40 45Val His Gly Ser Phe Leu Ala Arg Pro Ser Arg Lys Asn Gln Gly Asp50 55 60Phe Ser Leu Ser Val Arg Val Gly Asp Gln Val Thr His Ile Arg Ile65 70 75 80Gln Asn Ser Gly Asp Phe Tyr Asp Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala85 90 95Thr Leu Thr Glu Leu Val Glu Tyr Tyr Thr Gln Gln Gln Gly Val Leu100 105 110Gln Asp Arg Asp Gly Thr Ile Ile His Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys115 120 125Ser Asp Pro Thr Ser130(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度224氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO8Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg210 215 220(2)SEQ ID NO9信息(i)序列特征(A)长度225氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无
(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO9Met Ser Pro Ile Leu GLy Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro1 5 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Pne Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Ile Glu Gly210 215 220Arg225(2)SEQ ID NO10信息(i)序列特征(A)长度117氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO10Ser Ile Gln Ala Glu Glu Trp Tyr Phe Gly Lys Leu Gly Arg Lys Asp1 5 10 15Ala Glu Arg Gln Leu Leu Ser Phe Gly Asn Pro Arg Gly Thr Phe Leu20 25 30Ile Arg Glu Ser Glu Thr Thr Lys Gly Ala Tyr Ser Leu Ser Ile Arg35 40 45Asp Trp Asp Asp Met Lys Gly Asp His Val Lys His Tyr Lys Ile Arg50 55 60Lys Leu Asp Asn Gly Gly Tyr Tyr Ile Thr Thr Arg Ala Gln Phe Glu65 70 75 80Thr Leu Gln Gln Leu Val Gln His Tyr Ser Glu Arg Glu Arg Ala Ala85 90 95Gly Leu Cys Cys Arg Leu Val Val Pro Cys His Lys Gly Met Pro Arg100 105 110Leu Thr Asn Ser Ser115(2)SEQ ID NO11信息(i)序列特征(A)长度123氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO11Gly Met Asn Asn Asn Met Ser Leu Gln Asn Ala Glu Trp Tyr Trp Gly1 5 10 15Asp Ile Ser Arg Glu Glu Val Asn Glu Lys Leu Arg Asp Thr Ala Asp20 25 30Gly Thr Phe Leu Val Arg Asp Ala Ser Thr Lys Met His Gly Asp Tyr35 40 45Thr Leu Thr Leu Arg Lys Gly Gly Asn Asn Lys Leu Ile Lys Ile Phe50 55 60His Arg Asp Gly Lys Tyr Gly Phe Ser Asp Pro Leu Thr Phe Ser Ser65 70 75 80Val Val Glu Leu Ile Asn His Tyr Arg Asn Glu Ser Leu Ala Gln Tyr85 90 95Asn Pro Lys Leu Asp Val Lys Leu Leu Tyr Pro Val Ser Lys Tyr Gln100 105 110Gln Asp Gln Val Val Lys Glu Asp Asn Ser Ser115 120(2)SEQ ID NO12信息(i)序列特征(A)长度112氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(xi)序列描述SEQ ID NO12
Met Thr Ser Arg Arg Trp Phe His Pro Asn Ile Thr Gly Val Glu Ala1 5 10 15Glu Asn Leu Leu Leu Thr Arg Gly Val Asp Gly Ser Phe Leu Ala Arg20 25 30Pro Ser Lys Ser Asn Pro Gly Asp Phe Thr Leu Ser Val Arg Arg Asn35 40 45Gly Ala Val Thr His Ile Lys Ile Gln Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Asp50 55 60Leu Tyr Gly Gly Glu Lys Phe Ala Thr Leu Ala Glu Leu Val Gln Tyr60 70 75 80Tyr Met Glu His His Gly Gln Leu Lys Glu Lys Asn Gly Asp Val Ile85 90 95Glu Leu Lys Tyr Pro Leu Asn Cys Ala Asp Gln Phe Ile Val Thr Asp100 105 110(2)SEQ ID NO13信息(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(A)名称/键其他(B)位置4...4(C)其它信息磷酸化的酪氨酸残基(xi)序列描述SEQ ID NO13Glu Pro Gln Tyr Glu Glu Ile Pro Ile Tyr Leu1 5 1015(2)SEQ ID NO14信息
(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(A)名称/键其他(B)位置4...4(C)其它信息磷酸化的酪氨酸残基(xi)序列描述SEQ ID NO14Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu1 5 10 15(2)SEQ ID NO15信息(i)序列特征(A)长度19氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(A)名称/键其他(B)位置6...6(C)其它信息磷酸化的酪氨酸残基(xi)序列描述SEQ ID NO15
Glu Asn Gly Leu Asn Tyr Ile Asp Leu Asp Leu1 5 10 15(2)SEQ ID NO16信息(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(A)名称/键其他(B)位置7...7(C)其它信息磷酸化的酪氨酸残基(xi)序列描述SEQ ID NO16Thr Pro Pro His Leu Lys Tyr Phe Tyr Phe Val Val Ser Asp Ser1 5 10 15Gly20(2)SEQ ID NO17信息(i)序列特征(A)长度87碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO17TTCCATATGA AAAGTATTCG TATTCAGCGT GGCCCGGGCC GTCACCACCA CCACCACCAC60GGGATCCCCG CTGAAGAGTG GTACTTT87(2)SEQ ID NO18信息(i)序列特征(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO18GGAATTCTAG ATTACTAGGA CGTGGGGCAG ACGTT38(2)SEQ ID NO19信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO1935 CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGCTGA GGAGTGGTAT TTT46(2)SEQ ID NO20信息(i)序列特征
(A)长度38碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO20GGAATTCTAG ACTATTAGGA CGTGGGGCAC ACGGT38(2)SEQ ID NO21信息(i)序列特征(A)长度48碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO21CGGGATCCTG GACGACGACG ACAAAGAGCC CGAACCCTGG TTCTT48(2)SEQ ID NO22信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无
(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO22GCTCTAGACT ATTACTGGGG CTTCTGGGTC TG35(2)SEQ ID NO23信息(i)序列特征(A)长度46碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO23GAAGATCTTG GACGACGACG ACAAATCCCG TGGGTGGTTT CAC46(2)SEQ ID NO24信息(i)序列特征(A)长度35碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假想链无(iv)反义链无(v)片段类型(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO24GCTCTAGACT ATCAACTAGT GGGATCGGAG CA35(2)SEQ ID NO25信息(i)序列特征(A)长度106氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(xi)序列描述SEQ ID NO25His Pro Trp Phe Phe Gly Lys Ile Pro Arg Ala Lys Ala Glu Glu Met1 5 10 15Leu Ser Lys Gln Arg His Asp Gly Ala Phe Leu Ile Arg Glu Ser Glu20 25 30Ser Ala Pro Gly Asp Phe Ser Leu Ser Val Lys Phe Gly Asn Asp Val35 40 45Gln His Phe Lys Val Leu Arg Asp Gly Ala Gly Lys Tyr Phe Leu Trp50 55 60Val Val Lys Phe Asn Ser Leu Asn Glu Leu Val Asp Tyr His Arg Ser65 70 75 80Thr Ser Val Ser Arg Asn Gln Gln Ile Phe Leu Arg Asp Ile Glu Gln85 90 95Val Pro Gln Gln Pro Thr Ile His Arg Asp100 105(2)SEQ ID NO26信息(i)序列特征(A)长度11氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假想肽无(iv)反义肽无(v)片段类型内部的(vi)初始来源(ix)特征(A)名称/键其他(B)位置6...6(C)其它信息磷酸化的酪氨酸残基(xi)序列描述SEQ ID NO26Leu Pro Val Pro Glu Tyr Ile Asn Gln Ser Val1 5 10
权利要求
1.一种治疗自身免疫疾病的方法，包括给予受治疗者有疗效量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
2.权利要求1的方法，包括给予受治疗者有疗效量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
3.权利要求1的方法，包括给予受治疗者有疗效量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
4.权利要求3的方法，包括给予受治疗者有疗效量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
5.一种抑制同种异体移植排斥反应反应的方法，包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
6.权利要求5的方法，包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
7.权利要求5的方法，包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
8.权利要求7的方法，包括给予受治疗者以抑制同种异体移植排斥反应量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
9.一种诱导免疫抑制的方法，该方法包括给予受治疗者以诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
10.权利要求9的方法，包括给予受治疗者以诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人srcSH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
11.权利要求9的方法，包括给予受治疗者以诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
12.权利要求11的方法，包括给予受治疗者以诱导免疫抑制量的一种化合物，该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
13.一种化合物在生产用于治疗自身免疫病的药物中的用途，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
14.根据权利要求13的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
15.根据权利要求13的用途，其中该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
16.根据权利要求1 5的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
17.一种化合物在生产用于抑制同种异体移植排斥反应反应的药物中的用途，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
18.根据权利要求17的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
19.根据权利要求18的用途，其中该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
20.根据权利要求19的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
21.一种化合物在生产用于诱导免疫抑制的药物中的用途，该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低50倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
22.根据权利要求21的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高50倍以上。
23.根据权利要求21的用途，其中该化合物a.可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上；b.可与人hcp SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；c.可与人SH-PTP2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lckSH2区结合的亲和力低100倍以上；d.可与人p85 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上；e.可与人Grb2 SH2区结合，其亲和力比该化合物与人lck SH2区结合的亲和力低100倍以上。
24.根据权利要求23的用途，其中该化合物可与人lck SH2区结合，其亲和力比该化合物与人src SH2区和人fyn SH2区结合的亲和力高100倍以上。
全文摘要
本发明一种治疗自身免疫疾病的方法,该方法包括给予受治疗者具有疗效量的一种化合物,该化合物可与人lckSH2区结合,其亲和力比该化合物与人src SH2区或人fyn SH2区结合的亲和力高出50倍以上,而且该化合物与人hcp SH2区、人Grb2 SH2区、人SH－PTP2 SH2区或人p85 SH2区结合的亲和力比其与人lck SH2区结合的亲和力低50倍以上。
文档编号A61K31/00GK1179713SQ96192916
公开日1998年4月22日 申请日期1996年2月9日 优先权日1996年2月9日
发明者D·J·杜宁顿 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司