溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白和包含该蛋白质的疫苗的制作方法

专利名称：溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白和包含该蛋白质的疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的溶血巴斯德氏菌(Pasteurela haemolytica)运铁蛋白结合蛋白，其截短物、类似物、同系物以及同工型；编码该蛋白质和其截短物、类似物和同系物的核酸分子；包含该蛋白质的疫苗；抗该蛋白质的抗体；以及所述蛋白质和核酸分子的用途。
巴斯德氏菌属的成员包括一组相关的细菌物种，它们是反刍动物重要的病原体。这组细菌包括基于糖利用已被分类成两种生物型(A和T)的溶血巴斯德氏菌物种，和分类成基于它们的菌体抗原所识别的16种血清型(Biberstein,E.L.等，1960；Fraser等，1982)。以利用海藻糖为特征的溶血巴斯德氏菌的T-型菌株前不久被再分类为新的海藻巴斯德氏菌(P.trehalosi)物种(Sneath,P.H.A等，1990)。
由溶血巴斯德氏菌引起的肺巴斯德氏菌病在世界范围内对牛、绵羊和山羊产业是一个主要的经济问题。牛败血病，这一疾病的各种变型在北美的牛产业上是一个主要的问题，并且几乎全部由这一物种的A1型菌株引起(Babiuk,LA.和S.D.Acres,1984)。血清型A2是在绵羊中最主要的致病型，但其它血清型在绵羊和山羊中也可能是重要的(Gilmour和Gilmour,1991)。相关物种海藻巴斯德氏菌(以前称为T-型溶血巴斯德氏菌)是小羊败血症的病原体，该疾病是困扰绵羊产业(特别是在英国)的问题。同样，相关物种多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)物种的菌株引起出血性败血症(在牛和水牛中的一种严重的传染病)，这种病在东南亚特别严重。
接种是在反刍动物中控制巴斯德氏菌病的一种合乎需要的方法，但是由于缺乏诱导针对所有致病血清型的保护作用的免疫制剂，其有效性受到限制，特别是在考虑对所有反刍动物有效的疫苗时。杀灭全细胞的疫苗在小牛中引发保护作用不一致的水平和抗体反应(Wilkie,B.N.,1990)，包含水杨酸钠提取物(SSEs)的同种疫苗保护绵羊抵抗由血清型A1,A6和A9引起的疾病(Cilmour等，1983)，但不能抵抗更流行的血清型A2引起的疾病(Fraser等，1982)。由溶血巴斯德氏菌产生的外毒素(其对反刍动物的白细胞和肺泡巨噬细胞特异性致死(Benson等，1978))在小牛和绵羊的保护实验中作为疫苗候选者已显示出很大希望(13,35)，但对抵抗异种血清型具有有限的保护作用(33)。将在铁-有限生长条件下诱导的蛋白质包含进小羊巴斯德氏菌病疫苗中已经显示出增强的保护作用(15)。
以前的研究已经说明病原菌体内获取铁的能力是其病理生物学的关键性因素(7,11)。从宿主铁-结合耱蛋白，运铁蛋白取回铁的一种机理涉及通过细菌上的表面受体直接结合运铁蛋白，和从运铁蛋白除去铁并摄取到细胞中(21)。Schryvers(1992)描述了利用亲和层析从各种细菌病原体分离运铁蛋白受体蛋白质的方法。所说的运铁蛋白受体已经显示由两种蛋白质组成，这两种蛋白质称为运铁蛋白结合蛋白1或A(Tbp1或TbpA)和运铁蛋白结合蛋白2或B(Tbp2或TbpB)。铁摄取的受体介导的类型已经显示出在血清型A牛溶血巴斯德氏菌菌株中起作用(26)。在铁有限条件下体外生长的溶血巴斯德氏菌细胞表达大量的可抑制铁的外膜蛋白(IROMPs)，其与由从患巴斯德氏菌病的动物的感染部位体内回收的细胞产生的那些相同(9,10)。在这些蛋白质中尤其突出的是分子大小为100,77,70和60 Kda的那些(9,10)。100 Kda的蛋白质已作为一种牛分离物中的宿主特异性运铁蛋白受体被鉴别(26)，而某些其它IROMPs已被提出为可能与铁获取受体复合物中的100Kda蛋白质相关(26)。由小羊溶血巴斯德氏菌表达的IROMPs在铁获取中的作用还未阐明，也不知道由山羊分离物表达的类似蛋白质。
溶血巴斯德氏菌通过受体介导型机制从牛宿主运铁蛋白获得铁。具有这一类型的铁获取机制的细菌可以仅依赖于它们的体内铁获取表面受体(29)的观点意味着它们仅能够引起这些宿主(其运铁蛋白由它们的表面受体识别)中的疾病。已报道溶血巴斯德氏菌引起牛、绵羊和山羊中的疾病，因而预期它们的表面受体会识别这些宿主的运铁蛋白。因此，确定绵羊和山羊分离物是否也具有铁获取中所涉及的运铁蛋白受体以估价它们对不同反刍动物运铁蛋白的特异性，以及确定在引起牛、绵羊和山羊肺巴斯德氏菌病的不同菌株的表面受体之间是否具有抗原相关性是重要的。
在牛、绵羊和山羊的各种血清型和生物型(A和T)溶血巴斯德氏菌(和海藻巴斯德氏菌)的收集中鉴别了运铁蛋白受体。生长研究、结合研究和亲和性分离实验显示这些受体具有识别牛、绵羊和山羊运铁蛋白的相同的特异性。这表明在这些受体蛋白质上具有配体结合中所涉及的保守区，其是在细胞表面可及的。
抗个体纯化的溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株受体蛋白质(TbpA和TbpB)所制备的抗血清显示出抗选择的代表性菌株的受体蛋白质的相当大的交叉反应性。也观察到抗完整细胞的交叉反应性，说明在细胞表面具有用作宿主免疫作用机制的靶的保守的免疫表位。
本发明发明人已经从溶血巴斯德氏菌A1克隆、测序和表达了编码运铁蛋白受体蛋白TbpA和TbpB(本文也分别称为Tbp1和Tbp2)的tbpA和tbpB基因。这些基因组构在tbpB-tbpA的操纵子排列中。tbpB基因之前是推定的启动子和调节序列，之后为96个碱基对的基因间序列，在其中没有发现任何启动子区，说明这两个基因是协调转录的。TbpA与TbpB蛋白质的推定的氨基酸序列具有与相应的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)和胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)Lbp和Tbp蛋白质同源的区。完整的tbpB基因在T7表达系统中表达，并且所形成的重组TbpB蛋白质保持功能性牛运铁蛋白结合特征。重组TbpB的有用性使发明人能够说明其对反刍动物运铁蛋白的特异性，其结合牛运铁蛋白的C-和N-端片段两者的能力，以及其对这一蛋白质的载铁形式的优先选择性。
本发明发明人也明显地发现用包含溶血巴斯德氏菌TbpA和TbpB的制剂进行的免疫接种给出很好的抵抗实验性牛肺巴斯德氏菌病的保护作用。用两剂量的TbpB也给出保护作用。
广泛而言，本发明提供了包含编码TbpA蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子，或包含编码TbpB蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子。TbpA与TbpB蛋白质结合反刍动物运铁蛋白，并且在其反刍动物宿主中的溶血巴斯德氏菌的受体介导的铁获取中起作用。TbpA蛋白质大小约100kDa,TbpB大小约60kDa。
在本发明的一个实施方案中，纯化的与分离的核酸分子包含编码具有如图22或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的TbpA蛋白质的序列，或编码具有如图24或SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的TbpB蛋白质的序列。在本发明一个优选的实施方案中，纯化的与分离的核酸分子包含编码TbpA蛋白质并且具有如图21或SEQ ID NO:1所示的核酸序列的序列，或编码TbpB蛋白质并且具有如图23或SEQ ID NO:3所示的核酸序列的序列。
本发明也涉及(a)包含编码TbpA或TbpB的截短物(其对所说的蛋白质是唯一的)、TbpA或TbpB的类似物或同系物或它们的截短物(本文分别统称为＂TbpA相关蛋白质＂或＂TbpB相关蛋白质＂)之序列的核酸分子；b)包含在高严格条件下杂交到编码TbpA或TbpB(分别具有如图22和24所示的氨基酸序列)或TbpA或TbpB相关蛋白质的全长核酸上之序列的核酸分子；(c)包含在高严格条件下杂交到分别具有如图21或SEQ ID NO:1所示的，或者如图23或SEQ ID NO:3所示的序列的tbpA或tbpB基因的全长核酸序列上之序列的核酸分子。
本发明进一步涉及纯化的与分离的双链核酸分子，该分子含有本发明的核酸分子，本发明的核酸分子结合与互补核酸碱基序列氢键结合。
本发明的核酸分子可以插入到一个适当的表达载体中，即插入到含有所插入的编码序列的转录与翻译必要的元件的载体中。因此，可以构建适于转化宿主细胞的重组表达载体，其包含本发明的核酸分子和一个或多个有效地与核酸分子连接的转录和翻译元件。
所说的重组表达载体可以用来制备表达TbpA和/或TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白质的转化的宿主细胞。因此，本发明进一步提供了包含本发明的重组分子的宿主细胞。
本发明进一步提供了利用本发明的纯化的与分离的核酸分子制备新的TbpA或TbpB，以及TbpA或TbpB相关蛋白质的方法。在一个实施方案中，提供了一种用于制备TbpA或TbpB的方法，该方法包括(a)将本发明的重组表达载体转移到宿主细胞中；(b)选择转化的宿主细胞，使其与未转化的宿主细胞分离；(c)在使得TbpA或TbpB可以表达条件下培养选出的转化的宿主细胞；和(d)分离重组TbpA或TbpB。
本发明更广泛地涉及结合到反刍动物运铁蛋白上的纯化的与分离的TbpA或TbpB，其优选地是通过培养包含本发明的重组表达载体的宿主细胞获得的。在本发明的一个实施方案中，提供了分别具有图22或图24所示的氨基酸序列的纯化的TbpA或TbpB。本发明也包括所说蛋白质的截短物和所说蛋白质的类似物、同系物以及同工型和它们的截短物(即＂TbpA或TbpB相关蛋白质＂)。
本发明的TbpA和TbpB，或TbpA和TbpB相关蛋白质可以与其它分子，如蛋白质连接，以制备融合蛋白质。这可以通过例如合成N-端或C-端融合蛋白来完成。
本发明进一步涉及具有抗本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的特异性的抗体。可以用可检测的物质标记这些抗体，它们可以用于在样品中监测本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质。
本发明也使得可以构建这样的核苷酸探针，其对本发明的核酸分子是唯一的，因而对本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质是唯一的。这样，本发明也涉及包含编码TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的序列的探针。可以用例如可检测的物质标记探针，该探针可以用于从核苷酸序列混合物中选择编码显示一种或多种TbpA或TbpB性质的蛋白质的核苷酸序列。
本发明还进一步提供了用于鉴别能够结合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式上的物质的方法，该方法包括使TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式与至少一种潜在地可以与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式结合的物质在使得可以在所说物质与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式之间形成复合物的条件下反应，并测定复合物、游离的物质、非复合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式。潜在地可以与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质结合的物质包括运铁蛋白，特别是反刍动物运铁蛋白，运铁蛋白的类似物和衍生物以及抗TbpA和TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白质的抗体。
此外，本发明还提供了一种测定介质中TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质和与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式结合的物质之间相互作用的兴奋剂或拮抗剂的存在的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括在可以使所说物质与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质之间形成复合物的条件下提供已知浓度的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，以及能够结合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质上的物质和怀疑的兴奋剂或拮抗剂物质，并且测定复合物、游离的物质、非复合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质。在本发明的一个优选的实施方案中，所述的物质是反刍动物运铁蛋白、其类似物，衍生物或部分，或者抗TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的抗体。
影响TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的表达的物质也可以通过比较在所述物质的存在和不存在下，细胞中本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的表达方式和水平，采用本发明的方法鉴别。
利用本发明的方法鉴别的物质可以用于动物的治疗，特别是受到溶血巴斯德氏菌感染的反刍动物的治疗，因此它们可以配制成供反刍动物施用的药物组合物。所说的动物例如患溶血巴斯德氏菌感染或者接触溶血巴斯德氏菌感染的牛，绵羊以及山羊。
本发明发明人已经证实本发明的TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质是免疫原性的。因此，本发明也涉及抗本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的抗体。在一个实施方案中，抗体是抗宽范围的血清型溶血巴斯德氏菌TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质交叉反应性的。所说的抗体可以用于诊断以及治疗溶血巴斯德氏菌感染，例如，可用于被动免疫以治疗或预防反刍动物中由溶血巴斯德氏菌引起的疾病。
本发明进一步包括疫苗组合物，这些组合物包含本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，两者之一或两者组合在一起。本发明还进一步包括通过施用治疗有效量的所述疫苗免疫宿主(优选地是反刍动物)使其抵抗溶血巴斯德氏菌感染的方法。本发明发明人已弄清来源于一系列反刍动物的不同溶血巴斯德氏菌的菌株能够结合和利用一系列反刍动物运铁蛋白。因此可以预期本发明的疫苗组合物作为适于免疫一系列反刍动物(例如绵羊、奶牛和山羊)使其抵抗宽范围的溶血巴斯德氏菌生物型和血清型感染的广谱疫苗是有用的。
本发明也涉及编码TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的本发明的核酸分子在重组病毒载体疫苗(用于增强反刍动物对溶血巴斯德氏菌的免疫反应或者治疗溶血巴斯德氏菌感染)中的用途。可以用本领域公知技术构建重组病毒载体。
本发明的其它目的，特点以及优点从下列详细描述中可以明显看出。然而，应当理解，显示本发明的优选实施方案的详细描述和特定的实施例仅仅以说明的方式给出，因为通过这些详细描述，本领域技术人员会清楚在本发明的本质和范围内的各种改变和修改。
现在参照附图描述本发明，在附图中

图1是PCR方法(a)以及由Tbp1引物和左引物(b)扩增的0.8kb PCR产物的一个示意性图；图2是tbp质粒9,10和482的限制性内切核酸酶图谱；图3是溶血巴斯德氏菌tbpA和tpbB的基本核苷酸序列；图4是溶血巴斯德氏菌TbpB(PHTBPB)的启动子区；图5是以ClaⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因组DNA的Southern杂交印迹；图6是以HindⅢ和BamHⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因组DNA的Southern杂交印迹；图7是以各种选择性内切核酸酶消化的并且用溶血巴斯德氏菌tbpA探查的猪放线杆菌(A.suis)37114、胸膜肺炎放线杆菌CM5和shope 4074基因组DNA的Southern杂交印迹；图8是溶血巴斯德氏菌A1，胸膜肺炎放线杆菌CM5,Shope 4074和猪放线杆菌3714中的tbpA、tbpB区的限制性酶切图；图9显示了溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)与脑膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)的氨基酸序列对比；图10显示了溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和胸膜肺炎放线杆菌血清型1和7 TfbA蛋白质(APL,APL7)的氨基酸序列对比；
图11是说明溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)，脑膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)和胸膜肺炎放线杆菌血清型1和7 TfbA蛋白质(APL,APL7)之间的遗传相关性的图示；图12是溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1和大肠杆菌TonB-依赖性外膜受体之间的肽序列对比；图13是显示溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白质的T7分析的印迹；图14是溶血巴斯德氏菌A1和大肠杆菌HB101的内和外膜的Western免疫印迹；图15是采用在小牛中用Presponse接种抗可溶性抗原产生的血清获得的溶血巴斯德氏菌A1和大肠杆菌HB101的内和外膜的Western免疫印迹；图16是显示由铁-缺乏细菌膜结合的标记运铁蛋白的印迹；图17是显示用运铁蛋白亲和柱分离受体蛋白质的免疫印迹；图18是显示来源于牛、绵羊和山羊的不同血清型溶血巴斯德氏菌的受体蛋白质的免疫学分析的免疫印迹，其中A组用抗-TbpB血清，B组用抗-TbpA血清；图19显示由完整的细胞结合的标记运铁蛋白和抗-受体抗体的印迹；图20是溶血巴斯德氏菌tbp操纵子(顶端)和溶血巴斯德氏菌tbp操纵子(顶端)和调节序列(底端)的图；tbpA和tbpB分别是编码TbpA和TbpB的基因；p是在tbpB前的推定的启动子区，在底部以-35和-10部位表示；图21和SEQ ID NO:1显示溶血巴斯德氏菌菌株h196 tbpA基因的DNA序列；图22和SEQ ID NO:2显示溶血巴斯德氏菌菌株h196的TbpA蛋白质的预测的氨基酸序列；图23和SEQ ID NO:3显示溶血巴斯德氏菌菌株h196 tbpB基因的DNA序列；图24和SEQ ID NO:4显示溶血巴斯德氏菌菌株h196的TbpB蛋白质的预测的氨基酸序列；图25是显示固相HRP-Tf结合测定结果的印迹；图26是显示用溶血巴斯德氏菌血清型A1的抗-TbpA和抗-TbpB抗血清进行的银染(A组)和Western印迹(B组)研究的印迹；图27是显示用抗完整细胞的溶血巴斯德氏菌血清型A1的单特异性抗-TbpA和抗-TbpB抗血清进行的交叉反应性研究结果的印迹；图28显示PCR扩增的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA(A组)和tbpB(B组)基因的限制性内切核酸酶消化模式的凝胶；和图29是显示tbpA(A组)和tbpB(B组)基因可变区段的PCR扩增的凝胶。
氨基酸残基的下列标准缩写在整个说明书中使用A,Ala-丙氨酸；C,Cys-半胱氨酸；D,Asp-天冬氨酸；E,Glu-谷氨酸；F,Phe-苯丙氨酸；G,Gly-甘氨酸；H,His-组氨酸；I,Ile-异亮氨酸；K,Lys-赖氨酸；L,Leu-亮氨酸；M,Met-甲硫氨酸；N,Asn-天冬酰胺；P,Pro-脯氨酸；Q,Gln-谷氨酰胺；R,Arg-精氨酸；S,Ser-丝氨酸；T,Thr-苏氨酸；V,Val-缬氨酸；W,Trp-色氨酸；Y,Tyr-酪氨酸；和p.Y.,P.Tyr-磷酸酪氨酸。Ⅰ．本发明的核酸分子如上文所述，本发明提供了包含编码TbpA蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子，或包含编码TbpB蛋白质的序列的纯化的与分离的核酸分子。术语＂分离的与纯化的＂指当经重组DNA技术产生时实质上没有细胞物质或培养基，或者当用化学合成产生时实质上没有化学前体或其它化学物质的核酸。＂分离的与纯化的＂核酸也没有天然侧翼于所述核酸所来源的核酸的序列(即，位于所述核酸5’和3’端的序列)，术语＂核酸＂旨在包括DNA和RNA，并且可以是双链或单链。
在本发明的一个实施方案中，提供了编码具有图22或SEQ.ID.NO:2所示的氨基酸序列的TbpA的核酸分子。在另一个实施方案中，提供了编码具有图24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列的TbpB的核酸分子。在本发明的优选的实施方案中，所说的核酸分子是包含图21或SEQ.ID.NO:1所示的核苷酸序列或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列的DNA。
本发明包括互补于以下核酸的核酸序列(a)编码具有图22或SEQ.ID.NO:2所示的氨基酸序列的TbpA的核酸；(b)编码具有图24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列的TbpB的核酸；(c)具有图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的序列的核酸。优选地，所说的序列互补于图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的全长核酸序列。
本发明也包括与以下核酸序列具有实质上的序列等同性或同源性的核酸分子图21或SEQ.ID.NO:1所示的或图23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列；分别编码具有与图22或SEQ.ID.NO:2所示的或图24或SEQ.ID.NO:4所示的氨基酸序列实质上的同源性的TbpA或TbpB蛋白质的核酸序列。同源性指序列之间的序列相似性，可以通过比较在各序列(为了比较的目的所排列的)中的位置确定。当在所比较的序列中的一个位置由相同的核苷酸碱基或氨基酸占据时，则这些分子是匹配的或具有这些序列所共有的相同的位置。
具有实质上同源性的核酸序列包括(a)与图21或SEQ.ID.NO:1所示的核酸序列具有至少40-60％，优选地60-80％，最优选地80-90％的等同性的核酸序列；和(b)与图23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列具有至少40-60％，优选地60-80％，最优选地80-90％的等同性的核酸序列。
本发明的另一方面提供了这样的核酸分子以及其具有至少15个核苷酸碱基的片段，所述的核酸分子在杂交条件下，优选地是在严格杂交条件下与本发明的核酸分子杂交。有利于DNA杂交的适当的严格条件是本领域技术人员知道的，或者可以在分子生物学的当代方案(John Wiley＆Sons,N.Y.(1989)6.3.1-6.3.6)中找到。例如，采用在约45℃下的6.0 X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，其后为在50℃下的2.0 X SSC洗涤。基于在洗涤步骤中使用的条件，可以选择严格度。举例来说，在洗涤步骤中的盐浓度可以选择在50℃下的约0.2X SSC的高严格度。此外，在洗涤步骤中的温度可以在高严格条件下，在约65℃。
编码具有TbpA或TbpB活性的蛋白质的分离的与纯化的核酸分子，和由于遗传密码子简并性分别具有不同于图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的核酸序列的序列的分离的与纯化的核酸分子也在本发明的范围内。这样的核酸应编码功能上等同TbpA或TbpB的蛋白质，但由于遗传密码子简并性，序列上分别不同于图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的序列。
包括DNA在内的本发明的分离的与纯化的核酸分子可以通过以下方法分离基于图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的全部或部分核酸序列制备标记的核酸探针，并使用该标记的核酸探针筛选合适的DNA文库(例如cDNA或基因组DNA文库)。通过筛选cDNA或基因组DNA文库分离到的核酸可以用标准技术测序。
为DNA的本发明的分离的与纯化核酸分子也可以通过以下方法分离利用聚合酶链反应(PCR)方法和cDNA或基因组DNA选择性地扩增编码TbpA或TbpB的核酸。从图21或SEQ.ID.NO:1或者图23或SEQ.ID.NO:3所示的核苷酸序列设计用于PCR的合成寡核苷酸引物是可能的。利用这些寡核苷酸引物与标准的PCR扩增技术可以从cDNA或基因组DNA扩增核酸。如此扩增的核酸可被克隆进一种合适的载体中，并且通过DNA序列分析确定特征。合乎需要的是通过用各种技术，例如通过使用Chirgwin等，生物化学，18,5294-5299(1979)的硫氰酸胍抽提法，分离总细胞mRNA，可以从mRNA制备cDNA。然后利用逆转录酶(例如，由Gibco/BRL Bethesda,MD提供的Moloney MLV逆转录酶，或由Seikagaku America,Inc.St.Petersburg，FL提供的AMV逆转录酶)从mRNA合成cDNA。
是RNA的本发明的分离的与纯化的核酸分子可以通过以下方法分离将编码TbpA或TbpB的cDNA克隆进一个适当的载体中，这种载体允许所说的cDNA转录，产生编码显示出TbpA或TbpB活性的蛋白质的RNA分子。
本发明的核酸分子也可以利用标准技术化学合成。化学合成聚脱氧核苷酸的各种方法是已知的，包括如同肽合成的固相合成，其已由市售的DNA合成仪完全自动化(参见例如，Itakura等的美国专利4,598,049；Caruthers等的美国专利4,458,066；以及Itakura的美国专利4,401,796和4,373,071)。
确定特定的核酸分子是否编码具有TbpA或TbpB活性的蛋白质可以通过以下方法完成用标准的技术在合适的宿主细胞中表达DNA，试验所表达的蛋白质结合反刍动物运铁蛋白和/或调节铁摄取的能力。具有这样的活性的cDNA可以用标准技术测序，如用双脱氧核苷酸链终止或Maxam-Gilbert测序法，以确定核酸序列和所编码的蛋白质的预计氨基酸序列。
采用常规技术可以鉴别tbpA或tbpB的调节元件。通过用这些元件表达有效连接到这些元件上的报道基因可以证实这些元件的功能。采用标准技术可以将这些构建体引入到培养细胞中。
本发明的核酸分子的序列相对于正常出现而言，为了转录可以颠倒，以产生反义核酸分子。利用本领域已知的方法，用化学合成和酶促连接反应可以构建反义核酸分子。Ⅱ．重组TbpA和TbpB本发明也涉及纯化的与分离的来源于溶血巴斯德氏菌A1的TbpA或TbpB蛋白质，这些蛋白质显示出运铁蛋白结合活性。在本发明的一个实施方案中，提供了具有图22或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的纯化的TbpA蛋白质。在另一个本发明的实施方案中，提供了具有图24或SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列的纯化的TbpB蛋白质。重组TbpB不同于天然受体复合物，它识别在运铁蛋白的N-片段与C-片段上的结合决定簇。
除全长TbpA或TbpB氨基酸序列之外，如本文的描述，本发明的蛋白质包括TbpA或TbpB的截短物，以及TbpA或TbpB的类似物和同系物和它们的截短物。截短的蛋白质可以包括具有至少3个氨基酸残基的肽。该截短的蛋白质可以具有氨基(-NH2)；在氨基末端的疏水基团(例如苄氧羰基、丹酰、或叔-丁氧羰基)、乙酰基、9-芴基甲氧-羰基(PMOC)、或大分子(包括但不限于脂-脂肪酸缀合物、聚乙二醇或糖类)。该截短的蛋白质可以具有羧基；在羧基末端的酰氨基、叔-丁氧羰基、或大分子(包括但不限于脂-脂肪酸缀合物、聚乙二醇、或糖类)。
如本文所描述的，本发明的蛋白质也包括分别在图22或SEQ ID NO:2或者图24或SEQ ID NO:4所示的TbpA或TbpB的类似物，和/或它们的截短物，其可以包括但不限于含有一个或多个氨基酸取代，插入和/或缺失的TbpA或TbpB(图22或SEQ ID NO:2或者图24或SEQ ID NO:4)。氨基酸取代可以是具有保守或非-保守性质的。保守氨基酸取代包括以类似的电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸取代TbpA或TbpB氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。当仅进行保守取代时，所形成的类似物应该是功能上等同于TbpA或TbpB的。非保守取代包括以一个或多个不类似的电荷、大小和/或疏水性特征的氨基酸取代TbpA或TbpB氨基酸序列中的一个或多个氨基酸。
一个或多个氨基酸插入可以引入到TbpA或TbpB(图22或SEQ ID NO:2或者图24或SEQ ID NO:4)。氨基酸插入可以由单一氨基酸残基或者长度在2至15个氨基酸范围内的连续氨基酸组成。
缺失可以由从TbpA或TbpB(图22或SEQ ID NO:2或者图24或SEQID NO:4)序列除去一个或多个氨基酸或不连续的部分组成。所缺失的氨基酸可以也可以不必邻接。缺失突变所形成的类似物的低限长度是约10个氨基酸，优选地是100氨基酸。
如本文的描述，本发明的蛋白质也包括TbpA或TbpB(图22或SEQ IDNO:2或者图24或SEQ ID NO:4)的同系物和/或它们的截短物。这样的TbpA或TbpB同系物是这样一些蛋白质，其氨基酸序列由其它物种的TbpA或TbpB区的氨基酸序列组成，所说的区在严格杂交条件(参见本文的严格杂交条件的讨论)下与用于获得TbpA或TbpB的探针杂交。
具有实质上的同源性的蛋白质包括与图22(或SEQ ID NO:2)或者图24(SEQ ID NO:4)所示的氨基酸序列至少具有40-60％，优选地60-80％，最优选地80-90％等同性的蛋白质序列。
本发明也涉及本发明的蛋白质的同工型。同工型含有与本发明的蛋白质相同数量和种类的氨基酸，但是同工型具有不同的分子结构。本发明所包括的同工型是那些具有与本发明的蛋白质相同的性质的那些。
本发明也包括与所选择的蛋白质或选择性标记蛋白质(参见下述)缀合产生融合蛋白质的TbpA,TbpB或TbpA或TbpB相关蛋白质。另外，TbpA,TbpB或TbpA或TbpB相关蛋白质的免疫原性部分也在本发明的范围之内。
利用重组DNA方法制备本发明的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质。因此，具有编码本发明的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质的序列的本发明的核酸分子可以用已知的方式掺合到保证所说的蛋白质得到很好表达的适当的表达载体中。表达载体＂适于转化宿主细胞＂意指表达载体含有本发明的核酸分子，和基于用于表达的宿主细胞所选择的调节序列，这些调节序列有效地与所说的核酸分子连接。有效连接意指核酸以使得其可以表达的方式与调节序列连接。
因此，本发明涉及包含本发明的核酸分子、或其片段以及插入的蛋白质序列转录和翻译所必需的调节序列的重组表达载体。合适的调节序列可以来自各种来源，包括细菌，真菌，病毒，哺乳动物或昆虫基因。对适当的调节序列的选择依赖于按以下讨论所选择的宿主细胞，易于由本领域普通技术人员完成。
本发明的重组表达载体也可以含有选择性标记基因，该基因有利于以本发明的重组分子转化或转染的宿主细胞的选择。选择性标记基因的例子是编码赋予某些药物抗性的蛋白质或β-半乳糖苷酶的基因。
重组表达载体也可以含有编码融合部分的基因，其给出重组蛋白质增加的表述；重组蛋白质增加的溶解性；并通过在亲和纯化法中作为配体有助于靶重组蛋白质的纯化。
重组表达载体可以引入宿主细胞产生转化体宿主细胞。术语＂转化体宿主细胞＂旨在包括已由本发明的重组表达载转化或转染的原核和真核细胞。术语＂用...转化＂，＂用...转染＂，＂转化＂和＂转染＂旨在包括通过本领域已知的许多可能的技术之一将核酸(例如载体)引入到细胞中。转化和转染宿主细胞的合适的方法可以在Sambrook等(分子克隆实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社(1989))和其它实验室手册中找到。
本发明的蛋白质也可以经采用蛋白质化学领域已知的技术由化学合成制备，所说的技术例如固相合成(Merrifield,1964，美国化学会杂志，85:2149-2154)或均相溶液中合成法(Houbenweyl,1987，有机化学方法，编者E.Wansch,Vol.15Ⅰ和Ⅱ,Thieme，斯图加特)。
包括与其它分子(例如蛋白质)缀合的本发明的TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白质在内的N-端或C-端融合蛋白可以经重组技术将TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白质N-端或C-端与所选择的蛋白质或选择性标记蛋白质(具有所需生物功能)的序列融合而制备。所形成的融合蛋白含有融合进所选择的蛋白质或标记蛋白质的TbpA,TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白。Ⅲ．本发明的应用本发明的核酸分子使得本领域技术人员可以构建用于检测样品中的核酸序列的核苷酸探针。合适的探针包括基于分别编码图22和SEQ ID NO:2或者图24和SEQ ID NO:4中所示的TbpA或TbpB蛋白质的区的至少6个连续氨基酸之核酸序列的核酸分子。例如，合适的探针可以包括选自图21和SEQ ID NO:1所示的TbpA序列的1741至2784位核苷酸的TbpA的核酸分子。核苷酸探针可以用可检测的物质标记，所述物质如提供充分的信号并且具有足够的半衰期的放射性标记，如32P,3H,14C或类似的物质。可被利用的其它可检测的物质包括被特异性标记抗体识别的抗原，荧光化合物，酶，对标记抗原特异性的抗体和发光化合物。合适的标记可以基于考虑杂交速率，探针对待测核苷酸的结合和杂交可用的核苷酸的量选择。如Sambrook等1989，分子克隆，实验室手册(第二版)中一般性所描述的，标记的探针可以在固相支持体(例如硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上与核酸杂交。所说的核酸探针可以用于检测编码TbpA,TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的基因，优选的是在人细胞中的。
本发明的TbpA,TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质可以用于制备对所述蛋白质特异性的抗体。常规方法可以用来制备抗体。为了产生多克隆抗体，可以用TbpA,TbpB蛋白质的片段或者两者的混合物免疫哺乳类动物，如兔，小鼠或大鼠。蛋白质的免疫原性通过添加佐剂至蛋白质混合物中或通过将蛋白质与免疫原性载体缀合可以得到增强。载体的例子包括钥孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。
为了产生单克隆抗体，可以从动物(如上所述免疫的)收获产生抗体的细胞(淋巴细胞)，并且用标准的体细胞融合方法与骨髓瘤细胞融合，由此使这些细胞无限增殖和产生杂交瘤细胞。这样的技术是本领域已知的，例如，最初由Kohler和Milstein(自然256,495-497(1975))开发的杂交瘤技术，以及其它技术，例如人B-细胞杂交瘤技术(Kozbor等，当代免疫学，4,72(1983))，产生人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole等，在癌治疗中单克隆抗体(1985)Allen R.Bliss,Inc.,77-96页)，以及筛选组合抗体文库(Huse等，科学246,1275(1989)]。可以经免疫化学筛选杂交瘤细胞，以产生与所说的肽发生特异性反应的抗体，并且可以分离单克隆抗体。因此，本发明也涉及分泌具有对如本文所描述的TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质特异性的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本文所使用的术语＂抗体＂旨在包括其片段，这些片段也特异性地与具有TbpA或TbpB活性的蛋白质或其肽反应。可以用常规技术使抗体片段化，筛选的片段以本文描述的相同的方式使用。例如，F(ab’)2片段可以通过利用胃蛋白酶处理抗体产生。可以处理所形成的F(ab’)2片段，还原二硫键，产生Fab’片段。多价抗体可以通过融合两个或多个F(ab’)2片段或Fab’片段制备。例如，多价抗体可以含有一个对TbpA特异性的F(ab’)2片段和一个对TbpB特异性的F(ab’)2片段。
嵌合的抗体衍生物，即，结合非反刍动物可变区和反刍动物恒定区的抗体分子也包括在本发明的范围之内。嵌合的抗体分子可以包括，例如，小鼠，大鼠或其它物种抗体的抗原结合结构域，以及牛恒定区。常规方法可以用来制造包含免疫球蛋白可变区(其识别本发明的新的Tbp基因的基因产物)的嵌合抗体(参见，例如，Morrison等，美国科学院院报81,6651(1985)；Takeda等，自然314,452(1985),Cabilly等，美国专利4,816,567；Boss等，美国专利4,816,397；Tanaguchi等，欧洲专利出版物EP171496；欧洲专利出版物0173494)。
与TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其衍生物(如酶缀合物或标记的衍生物)特异性反应的抗体可以用作检测样品(例如组织和细胞)中的TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质的探针，例如它们可以用于任何依赖于TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质的抗原决定簇与抗体之间的结合相互作用的已知免疫测定中。这样的测定的例子是放射免疫测定，酶免疫测定(例如ELISA)，免疫荧光，免疫沉淀法，乳汁凝集作用，血凝，以及组织化学测定。这样，抗体可以用于检测并且在样品中定量TbpA,TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质。在一个实施方案中，抗体是对宽范围血清型溶血巴斯德氏菌TbpA或TbpB或TbpA，或TbpB相关蛋白质交叉反应性的。当用作探针时，抗体通常用本领域已知的技术标记。
本发明的抗体也可以用于溶血巴斯德氏菌感染的诊断和治疗。在一个实施方案中，抗体用于被动免疫，以治疗或预防反刍动物中由溶血巴斯德氏菌引起的疾病。在这种情况下，可以利用抗体的混合物或多价抗体。
本发明还进一步地提供了用于鉴别能够结合到TbpA或TbpB或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或它们的活化形式上的物质的方法，该方法包括使TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或它们的活化形式与至少一种潜在地可以与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或它们的活化形式结合的物质在使得可以在所说物质与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或它们的活化形式之间形成复合物的条件下反应，并测定复合物、游离的物质、非复合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或它们的活化形式。潜在地可以与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质结合的物质包括运铁蛋白，特别是反刍动物运铁蛋白，运铁蛋白的类似物和衍生物和抗TbpA和TbpB，或TbpA或TbpB相关蛋白质的抗体。
此外，本发明还提供了一种测定介质中TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质和与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，或其活化形式结合的物质之间相互作用的兴奋剂或拮抗剂的存在的方法。在一个实施方案中，所述的方法包括在所说物质与TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质之间能够形成复合物的条件下提供已知浓度的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质，以及能够结合到TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质上的物质和怀疑的兴奋剂或拮抗剂物质，并且测定复合物、游离的物质、非复合的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质。在本发明的一个优选的实施方案中，所述的物质是反刍动物运铁蛋白、其类似物，衍生物或部分，或者抗TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的抗体。
影响TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的表达的物质也可以通过比较在所述物质的存在和不存在下，细胞中本发明的TbpA或TbpB，或者TbpA或TbpB相关蛋白质的表达方式和水平，采用本发明的方法鉴别。
利用本发明的方法鉴别的物质可以用于动物的治疗，特别是受到溶血巴斯德氏菌感染的反刍动物的治疗，因此它们可以配制成供反刍动物施用的药物组合物。所说的动物例如患溶血巴斯德氏菌感染或者接触溶血巴斯德氏菌感染的牛，绵羊以及山羊。
所说的物质可以配制成用于施用于受治疗者的药物组合物，该组合物是适于体内施用的生物学上相容的形式。“适于体内施用的生物学上相容的形式”意指其中任何毒性副作用小于治疗作用的待施用物质的形式。该物质可以施用于活的生物体，包括人和动物。本发明的药物组合物的治疗有效量的施用被定义为给予获得所需的结果所必需的有效量和时间。例如，一种物质的治疗有效量可以根据一些因素变化，这些因素例如个体疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体在个体中激发所需反应的能力。用药方式可以调节，以给出最佳的治疗反应。
所说的活性物质可以以一种方便的方式施用，例如注射(皮下，静脉内，等)，口服，吸入，经皮使用，或直肠施用。依据施用途径，活性物质可以包衣在物质中，以便保护化合物使之免受酶，酸，以及灭活化合物的其它天然条件的作用。
本文所描述的组合物可以通过用于制备药学上可接受的组合物(其可以施用于受治疗者)的本来已知的方法制备，以便有效量的活性物质在混合物中与药学上可接受的载体组合。合适的载体在例如Remington的药物科学(Remington的药物科学，Mack出版公司，Easton,Pa.,美国1985)中有描述。在此基础上，所说的组合物包括但不限于与一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂缔合的所述物质的溶液，和包含在具有合适的pH值和与生理体液等渗的缓冲溶液中的所述物质的溶液。
TbpA或TbpB和/或TbpA或TbpB相关蛋白质可以用作在动物中预防和治疗各种传染病的疫苗。包含在本发明中的传染病包括由溶血巴斯德氏菌引起的感染，例如牛中的牛肺炎，绵羊中的全身性疾病和肺炎。此外，按照本发明的疫苗也可以用于预防和治疗由其它Pasteurella spp引起的感染。一个例子是在牛、猪和家禽中预防和治疗多杀巴斯德氏菌，包括呼吸和全身性感染，例如出血性败血症和牛乳腺炎。预期所说的疫苗可以施用于各种动物，优选地是反刍动物，包括牛、绵羊和山羊。
本发明发明人证明一系列反刍动物的溶血巴斯德氏菌不同菌株都可以结合和利用一系列反刍动物运铁蛋白。因此可以预期，本发明的疫苗组合物作为适于免疫一系列反刍动物(如绵羊，奶牛以及山羊)使其抵抗宽范围的溶血巴斯德氏菌生物型和血清型引起的感染的广谱疫苗是有用的。
所说的疫苗组合物包含TbpA,TbpB和/或TbpA或TbpB相关蛋白质，两者之一或者两者。该疫苗组合物可以含有所描述的蛋白质或其免疫原性片段的任何组合。此外，所述组合物可以含有Tbp蛋白质，这些蛋白质是从一种或多种溶血巴斯德氏菌生物型或血清型或者其它微生物分离的。包括TbpA,TbpB和/或TbpA或TbpB相关蛋白质的重组蛋白质优选地用于本发明的疫苗组合物中。在一个优选的实施方案中，本发明的一种或多种重组TbpA或TbpB，和TbpA或TbpB相关蛋白质用于疫苗组合物中。在另一个本发明的实施方案中，疫苗组合物含有纯化的与分离的TbpA和TbpB，优选地是重组TbpA和TbpB。
本发明的疫苗含有免疫有效量的一种或多种TpbA,TbpB,TbpA相关蛋白质，和TbpB相关蛋白质。蛋白质的最佳量取决于感染(需要针对它进行保护)的性质，待保护动物的特征，以及本领域技术人员已知的其它因素。
除TpbA,TbpB,TbpA相关蛋白质和/或TbpB相关蛋白质之外，疫苗还可以包含一种免疫学上可接受的载体，如含水稀释剂，悬浮助剂，缓冲液，赋形剂，和一种或多种本领域已知的佐剂。合适的佐剂包括氢氧化铝，弗氏佐剂(完全或不完全)，细菌(如百日咳博德特氏菌或大肠杆菌)或细菌衍生的物质，免疫刺激复合物(iscom)，油，sapronin，寡肽，乳化的石蜡-EmulsigenTM(MVP Labs,Ralston,Nebraska)，包含AL(OH)3的L80佐剂(Reheis，新泽西)，Quil A(Superphos)或技术人员已知的其它佐剂。优选地，所说的佐剂是包含AL(OH)3的L80佐剂(Reheis，新泽西)和QuilA(Superphos)。疫苗可以掺入到使TbpA和/或TbpB蛋白质在接受者中缓释的脂质体系统中。疫苗也可以含有防腐剂如叠氮化钠，硫柳汞(thimersol)，庆大霉素，新霉素，以及多粘菌素。
疫苗可以是多价疫苗，并且还以预防和治疗有效的方式含有溶血巴斯德氏菌的其它免疫原或与其它疾病相关的免疫原。例如，本发明的疫苗组合物可以含有溶血巴斯德氏菌白细胞毒素和TbpB。
本发明的疫苗可以以一种方便的方式施用，如静脉内、肌内、皮下、腹膜内、产期内或经口。疫苗优选地经肌内或皮下施用。
剂量取决于感染的性质，所需的效果、所选择的施用途径和本领域技术人员已知的其它因素。
本发明也涉及重组病毒载体疫苗和重组细菌载体疫苗在治疗和/或预防溶血巴斯德氏菌感染上的用途，所说的疫苗含有本发明的编码TbpA,TbpB,TbpA相关蛋白质和/或TbpB相关蛋白质的核酸分子。在这样的系统中，TbpA或Tbpg蛋白质在受体中从疫苗中的外源核酸分子体内合成。采用本领域已知的技术和如本文的描述，可以构建重组病毒或细菌载体。细菌系统的例子包括大肠杆菌和沙门氏菌(Salmonella spp)。
下列非限制性的实施例是说明本发明的。
实施例实施例1下列材料与方法用于实施例所描述的研究中材料和方法细菌菌株和克隆载体溶血巴斯德氏菌菌株由P.Shewen博士(Guelph大学兽医微生物学和免疫学系(VMI))提供，这些菌株最初从E.Biberstein博士(加利福尼亚大学，Davis),G.Frank博士(USDA,Ames,Iowa)和W.Donachie博士(Moredun研究院，Edinburgh,U.K)获得。猪放线杆菌(Actinobacillus suis)菌株3714，胸膜肺炎放线杆菌菌株CM5和Shope 4074由S.Rosendal博士(VMI)提供。大肠杆菌菌株HB101和TG-1由R.Lo博士(Guelph大学微生物学系)提供，用作克隆实验的受体菌株。大肠杆菌菌株JM109(DE3)由C.Whitfield博士(Guelph大学微生物学系)提供。
巴斯德氏菌属和放线杆菌属菌株保持在绵羊血琼脂上并在心脑浸出肉汤(BHIB)(Difco Labs,Detroit,Michigan)中培养。大肠杆菌HB101在加有胸苷的Luria-Bertaini(LT)上培养，所述的培养基在用于选择重组质粒时以100mg/L补充了氨苄青霉素(西格玛化学公司，圣路易斯，密苏里)。类似地，大肠杆菌TG-1和JM109(DE3)在具有氨苄青霉素的Davis基本培养基中培养。通过加入铁螯合剂乙二胺二(o-羟苯基乙酸)(EDDA)(西格玛)至100μM的终浓度产生铁-耗尽状态。通过添加FeCl3至1mM产生铁-耗尽状态。
质粒pBR322,噬菌体载体M13/mp18和M13/mp19按以前描述(Lo和Cameron,1986；Lo等，1985；和Lo等，1987)使用。pBluescript载体从Stratagene(La Jolla，加利福尼亚)获得。重组克隆482由A.Schryvers博士(Calgary大学微生物学系)提供。
酶，化学药品和抗血清限制性内切核酸酶和DNA修饰酶从Bethesda研究实验室(BRL)(Burlington，安大略)或Pharmacia化学品公司(Dorval，魁北克)购买，并且按制造厂商的描述使用。放射性同位素从ICN生物化学公司(蒙特利尔，魁北克)或Amersham实验室(Oakville，安大略)购买。
山羊抗-兔免疫球蛋白G-碱性磷酸酶缀合物和免疫检测试剂从Bio-Rad实验室(Mississauga，安大略)购买。山羊抗-牛免疫球蛋白G-碱性磷酸酶缀合物从杰克森免疫研究公司(西Grove,PA)购买。兔抗-自体抗血清和牛抗-Presponse抗血清从P.Shewen博士(Guelph大学兽医微生物学和免疫学系)获得。兔＂抗-自体＂抗血清针对溶血巴斯德氏菌A1(在补充有兔自身血清的RPMI 1640中培养)的可溶性抗原产生。注意到RPMI 1640是一种贫铁培养基是重要的。
DNA方法a)染色体DNA分离根据Marmer(1961)的方法从细菌细胞分离染色体DNA。将细菌接种在250ml合适的培养基中，并且在37℃于150rpm振荡下培养过夜。下一天，通过在Sorvall RC5-B冷冻离心机(Dupont仪器公司，Mississauga，安大略)的GSA转鼓中于4,000 xg离心10分钟使细胞沉淀。沉淀悬浮在8ml0.6M山梨醇，0.05mM Tris-HCl(pH8.0),0.05M EDTA溶液中。加入溶菌酶(西格玛)至3mg/ml终浓度，并且将样品置于冰上温育30分钟。将2ml裂解液(0.5％SDS,0.05 M EDTA,0.05 M Tris-Cl[pH 8.0])和3 mg/ml蛋白酶K(西格玛)溶液加入到样品中，然后在37℃水浴中温育4小时，接着在56℃下温育。
以用等体积的TE缓冲液(0.05M Tris-HCl[pH7.5],0.001M EDTA)饱和的苯酚(Gibco/BRL)抽提悬液，并在30-50 rpm下振荡45分钟。通过在5℃下在SS34转鼓中于12,000 xg离心10分钟分离苯酚和水相。用切断的宽口巴斯德移液管收集上清液，用2-3倍体积的冰冷95％乙醇沉淀DNA。将DNA链蘸取到玻璃棒上，并溶解到小体积的0.1X SSC(1X SSC含有0.15 M NAC1,0.015 M柠檬酸钠)中。
用RNase处理DNA至10μg/ml终浓度并在37℃温育30分钟，用2-3倍体积的冷95％乙醇再次沉淀DNA，蘸取到玻璃棒上并溶于1XSSC中。4℃下贮藏样品。
b)限制性内切核酸酶消化和连接根据制造厂商的说明，以适当的限制性内切核酸酶消化质粒和噬菌体载体。将载体和插入DNA混合至5μl总体积，并用0.5单位的T4 DNA连接酶连接。在转化进大肠杆菌细胞之前，将连接混合物在室温下温育3-4小时，或者在14℃下温育一夜。
c)感受态大肠杆菌细胞的制备转化用来将质粒和噬菌体DNA引入到感受态大肠杆菌细胞(Mandel和Higa,1970；Lederberg和Cohen等，1972)中。在37℃和150rpm振荡下在LT肉汤中培养待转化的大肠杆菌菌株一夜。下一天，在20ml相同的培养基中制备1/40传代培养物，并且在37℃和75rpm振荡下培养额外的60分钟。通过在SS34转鼓中于3,000 xg离心收集细胞，并重悬在10ml无菌冰冷的50mM CaCl2中。将悬液置于冰上温育30分钟。然后经离心收集细胞，并重悬于2ml无菌冰冷的mM CaCl2中。此时，感受态细胞可以贮存在4℃下，并且用到多达3天。
为了转化，将感受态细胞的0.2ml在冰上与DNA样品混合30分钟，在42℃下热击细胞2分钟，然后加入0.2ml LT肉汤。将细胞在37℃培养15分钟，接着平板接种到含有合适的抗生素的LT平板上，37℃下培养过夜。
d)大量质粒分离按照修改的Clewell和Helinski方法(1969)进行大量质粒分离。将携带质粒的大肠杆菌接种到包含氨苄青霉素的250ml LT肉汤中，并且在37℃和150rpm振荡下培养过夜。下一天，加入氯霉素(西格玛)至25mg/l的终浓度，使培养物再生长4-6小时。通过在GSA转鼓中在4,000 xg下离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬在4ml包含25％蔗糖和0.05M TrisHCl(pH8.0)的冰冷溶液中，然后加入新鲜的1ml 10mg/ml溶菌酶(西格玛)溶液。将混合物在37℃水浴中温育30分钟，置于冰上5分钟，然后加入2ml 0.25M EDTA(pH8.0)。进一步置于冰上5分钟后，加入5ml裂解溶液(0.05M Tris-HCl[pH8.0],0.0625M EDTA和2％Triton X-100)。将混合物返回到37℃水浴中5-15分钟直到细胞裂解完全。然后在27,000 xg下离心30分钟，将澄清的裂解物转换到一支清洁的试管中，将裂解物与1g/ml固体CsCl(Boehringer曼海姆，Laval，魁北克)混合至总共4.5ml。然后将100μl溴化乙锭(10mg/ml)加入到4.5ml样品中。热封离心管，并将样品在Beckman VTi65垂直转鼓中于15℃和240,000 xg下离心至少9小时。
通过刺破离心管的顶端与底端并收集管中两个带的下一个回收质粒DNA。为了从样品中抽提溴化乙锭，将质粒DNA溶液与等体积的Cs/C1饱和的正丁醇混合。在进行相分离后，除去包含正丁醇和溴化乙锭的上层。将这一过程重复三次。在抽提溴化乙锭后，透析下层水相以除去CsC1。通过在0.1M碳酸氢钠中煮沸2×15分钟和在0.25M EDTA(pH7.5)中煮沸1×15分钟制备分子截断值为10kDa透析管(Fisher)，于4℃贮存在50％乙醇和1mM EDTA中。在透析之前，用dH2O洗涤透析管，然后加入质粒DNA溶液。于4℃在4×1L透析缓冲液(0.01 M Tris-HCl[pH 7.5,40℃]，和0.001 M EDTA)中透析DNA24小时。将样品贮存在-20℃。
此外，将得自Pharmacia(魁北克市，魁北克)的Flexi-prep试剂盒用于小量质粒制备。这一方法包括标准的碱性细胞裂解，包括RNase处理和异丙醇沉淀(Birnboim和Doly,1979；Isch-Horowicz和Burke,1981)。纯化质粒DNA,并且利用在盐酸胍中的二氧化硅基质(SephaglasFPTM)浓缩。
e)经随机引发放射性标记DNA探针利用GIBCO/BRL的随机引物DNA标记系统用[α-32P] dATP(3,000Ci/mmol,ICN)标记DNA片段。这一标记系统基于Feinberg和Vogelstein的方法(1983)，具有某些修改(Feinberg和Vogelstein,1984)。通过煮沸5分钟(在10μl H2O中的25ng DNA)使样品变性，然后立即置于冰上。仍然在冰上加入下列试剂dCTP,dGTP和dTTP各2μl,15μl随机引物缓冲液，4μl[α-32P]dATP，加水至49μl。简短地混合样品，并加入3个单位的克列诺片段。将反应混合物在25℃温育1小时，通过加入5μl终止缓冲液终止。
经通过小型葡聚糖凝胶G-50柱的凝胶过滤从未掺入的放射性核苷酸分离放射性标记的DNA。所述的柱用塞有玻璃棉的巴斯德移液管制备，在加入放射性标记的样品之前用TE缓冲液平衡。采用Geiger计数器(Mini-Instruments公司，Essex,England)监测穿过柱的DNA的迁移。放射性第一个峰相应于标记的DNA，而第二个峰相应于未掺入的[32P]-dATP。在加入到杂交溶液之前，通过煮沸5分钟使DNA探针变性。
f)琼脂糖凝胶电泳和Southern杂交通过添加TAE缓冲液(40 mM Tris[pH 7.9],1mM EDTA)至电泳级琼脂糖粉(正常或低熔点；西格玛)上至0.7％至1％的终浓度制备琼脂糖凝胶。在水平平面凝胶装置(Tyler Research,Edmonton,Alberta)中使琼脂糖凝胶电泳。
将DNA样品与1/2体积的示踪染料(50％甘油，0.1％梯(Gibco/BRI)混合，或者将用HindⅢ消化的λDNA(Pharmacia)用作分子标准。使用补充有1μg/ml溴化乙锭的TAE跑胶缓冲液。样品最初在100V下电泳5分钟，然后将电压减少至10-12V进行一夜电泳。在电泳之后，用中等范围的紫外透射仪观察样品并用Polaroid 57型黑白胶卷(Sharp等，1973；Hayward,1972)照相。
为了Southern杂交，将琼脂糖凝胶浸没在0.25M HCl中15分钟，以使DNA脱嘌呤。将凝胶转移到由0.5M NaOH和1.5M NaCl组成的碱性溶液中15分钟，然后用0.5M Tris-HCl(pH7.5),1.5M NaCl中和30分钟。在150mA的恒定电流下30分钟(Wahl等，1979；Southern,1975)内，在20X SSPE缓冲液(3.6M NaCl,0.2M Na2PO4[PH 7.0],0.02MNa2EDTA,0.16M NaOH)中用半干印迹装置(Tyler Research)经电泳转移法将DNA移到硝酸纤维素膜(Schleicher和Shuell,Willowdale，安大略)上。
在电泳转移之后，硝酸纤维素膜用2X SSPE缓冲液洗涤10分钟，经UV交联剂(Stratagene)交联DNA。将膜在密封的塑料袋中预杂交，所说的塑料袋含有在0.1％甘氨酸中的25％(低严格性)或50％(高严格性)甲酰胺溶液(Gibco/BRL),5X BFP(100X BFP含有2％w/v牛血清白蛋白，Ficoll和聚乙烯吡咯烷-40),5X SSPE缓冲液和0.1mg/ml声波处理、煮沸的鲑精载体DNA。将密封的袋子放置在42℃的振荡水浴中，其中使膜可以预杂交至少1小时。然后弃去预杂交缓冲液，用含有煮沸的标记的DNA探针的杂交缓冲液(10％葡聚糖硫酸酯，5X SSPE,5X BFP,0.1％SDS,0.1mg/ml载体DNA或25％或50％甲酰胺)替代。将袋子置于42℃的振荡水浴中，使膜杂交过夜。
在杂交之后，从塑料袋移去硝酸纤维素膜，并且在42℃的振荡水浴中用高严格性(5X SSPE,0.1％SDS)或低严格性(2X SSPE,0.1％SDS)洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜。使膜通风干燥，置于Whatman滤纸上，以塑料覆盖物覆盖，并且于-20℃暴露在X-光胶片(Cronex,Willingmington,Delaware)下104天,直到获得所需的暴露。通过采用Geiger计数器测定放射活性信号的强度确定暴露时间。用柯达GBX快速显影仪(Eastman柯达，Rochester，纽约)显影放射自显影图2分钟。通过在2.5％乙酸中浸没胶卷1分钟终止显影反应，在柯达GBX定影液(Eastman柯达)定影2分钟。
g)Southern菌落印迹将生长在加氨苄青霉素的LT上的细菌菌落的主模板在37℃下培养过夜。将在主平板上的菌落复制到硝酸纤维素膜上，该膜覆盖在加氨苄青霉素的LT平板上，在37℃培养2-3天。然后将膜覆盖在Whatman滤纸上(该滤纸在0.5M NaOH,1.5M NaCl溶液中浸透)，在室温(RT)下温育5分钟，以裂解细胞。然后将硝酸纤维素膜转移到Whatman滤纸上(该滤纸在0.5M Tris=HCl(pH7.5),1.5M NaCl溶液中浸透)，在室温(RT)下温育5分钟，以中和膜。将膜转移到在95％乙醇中浸透的Whatman滤纸上，用95％乙醇喷射以沉淀DNA。用UV交联剂(Stratagene)交联在膜上的DNA，然后，如上所述进行预杂交和杂交。
h)聚合酶链反应(PCR)PCR反应在Perkin-Elmer Cetus 480 DNA热循环仪中的薄壁500μlGeneAmp微量离心管(microfuge tubes)中进行，其中利用Ferkin-ElmerCetus PCR核心试剂试剂盒，该试剂盒包含脱氧核苷酸三磷酸，MgCl2，反应缓冲液和Ampli-Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer Cetus)。按照Saiki等(1988)的方法(由Perkin-Elmer Cetus修改的)完成扩增反应。PCR反应在包含1X反应缓冲液(0.5 M KCl,0.1 M Tris-HCl[pH 9.0]),0.2 mM的各dNTP,0.4μM引物，5μg模板，15mM MgCl2和2.5单位的Ampli-Taq酶的100μl混合物中进行。将反应混合物在95℃加热2分钟，以变性模板DNA。然后，30个循环的变性，退火和延伸分别按照温度和时间为95℃(1分钟)，52℃(1分钟)和72℃(2分钟)进行。使用温度之间(0.01秒的斜坡时间)的最快可用转变。不含模板DNA的阴性对照包含在每一个PCR反应中。
在扩增之后，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检查。通过低熔点琼脂糖凝胶经电泳分离PCR产物，其后切下所需的DNA片段。利用玻璃株基质纯化试剂盒(GENECLEAN)纯化来自琼脂糖的DNA产物。
i)来自琼脂糖凝胶的DNA片段的纯化利用来源于Bio/Can Scientific(Mississauga，安大略)的GENECLEAN试剂盒纯化来自琼脂糖凝胶的DNA片段。GENECLEAN纯化过程基于Vogelstein和Gillespie(1979)的方法。用剃刀片从凝胶切下包含所述片段的凝胶片，并且放置在1.5ml Eppendorf离心管中。加入等体积的贮存NaI溶液，将样品在55℃水浴中温育5分钟，直到琼脂糖完全熔化。
以每5μg或更少的DNA 5μl体积的量将GLASSMILK(Bio/CanScientific)加入到样品中，将混合物置于冰上5分钟。通过在16,000 xg下离心10秒钟收集二氧化硅基质，然后重悬于600μl NEW洗涤缓冲液(Bio/Can Scientific)中。用NEW缓冲液洗涤沉淀总共3次。在最后洗涤后，将二氧化硅基质重悬于10μl TE缓冲液中，并在55℃下温育5分钟。将样品离心，回收TE，以避免二氧化硅基质沉淀。将样品贮存在-20℃下。
j)DNA双脱氧测序利用Pharmacia T7-测序试剂盒按照制造商的描述通过克隆进M13mp18/mp19噬菌体载体(单链测序)或者直接从重组体质粒(双链测序)对DNA片段进行测序。Pharmacia T7-测序试剂盒方法基于由Sanger等(1977)概述的方法。
对于单链测序，将DNA片段克隆进M13 mp18/mp19噬菌体载体，并且转化进感受态大肠杆菌TG-1细胞。选择由于丧失β-半乳糖苷酶产生而显示出白色的重组噬菌体＂噬斑＂。将各噬斑接种到10ml LT肉汤(接种有在Davis基本培养基中生长过夜的培养物大肠杆菌TG-1)中，在37℃和75rpm振荡下培养4-5小时。将样品在12,000 xg下离心10分钟，以除去大肠杆菌细胞。通过加入1/4体积的20％聚乙二醇(8,000 MW；西格玛)，2.5MNaCl使噬菌体从培养上清液沉淀，并置于冰上30分钟。用微量离心机(microfuge)在12,000 xg下离心10分钟回收沉淀的噬菌体。将沉淀重悬于0.6ml噬菌体缓冲液(0.1M Tris-HCl[pH8.0]),0.001M EDTA,0.3MNaCl)中。
用0.5ml TE缓冲液饱和的苯酚(Gibco/BRL)抽提噬菌体DNA。通过在14,000 xg下离心10分钟使苯酚和水相分离。水相以1∶1苯酚∶氯仿，最后以氯仿抽提。然后用1/10体积的3M乙酸钠(pH7.0)和2体积的冷的95％乙醇沉淀噬菌体DNA，在-20℃下温育一夜。通过14,000xg下离心10分钟来收集沉淀的DNA。水相用1∶1苯酚∶氯仿，最后以氯仿抽提。然后用1/10体积的乙酸钠(pH7.0)和2体积的冷95％乙醇沉淀噬菌体DNA，在-20℃温育过夜。通过在4℃的微量离心机中在14,000 xg下离心10分钟收集沉淀的DNA。将沉淀通风干燥并重悬于50μl TE缓冲液中，用于测序。在测序反应之前，通过在65℃下温育10分钟，然后在室温下温育10分钟，在退火缓冲液(Pharmacia T7测序试剂盒)存在下将所说的DNA退火到通用M13引物或特异性引物上。
对于双链测序，利用修改的Pharmacia T7测序试剂盒方案中所概述的方法制备质粒模板。将质粒DNA调节至1.5-2.0μg/32μl，并且通过加入12μl 2M NaOH 1分钟使其变性。由加入11μl 3M乙酸钠(pH5.0)终止变性。用7μl dH2O和120μl冰冷的无水乙醇沉淀DNA，并在-20℃下温育过夜。
在14,000 xg下于微量离心机中离心10分钟收集DNA，用100μl冰冷的70％乙醇洗涤沉淀，离心并真空干燥。将样品重悬于5μl dH2O中，与5μl引物和2μl退火缓冲液混合。在测序前，将混合物在65℃下温育5分钟，37℃下温育10分钟，室温下温育5分钟。
将[32P]dATP或[35S]dATP(比活性3000 Ci/mmol)用于测序反应中。对短的放射自显影暴露时间，使用[32P]dATP。对较高的分辨率，使用[35S]dATP。根据制造厂商的说明在国际应用生物系统391 PCR-MateDNA合成仪上合成寡核苷酸引物并纯化。通过使用前测定在260nm的光密度定量所说的引物。
对于[32P]dATP测序，测序凝胶含有18g尿素(ICN，蒙特利尔，魁北克)，3.75ml 10X TBE缓冲液(1M Tris[pH 8.3],0.02M EDTA和0.865M硼酸)和7.5ml 40％丙烯酰胺(19∶1丙烯酰胺∶双丙烯酰胺,Bio-Rad)，加dH2O至38ml。搅拌溶液直到尿素溶解，然后加入0.23ml 10％的过硫酸铵(西格玛)以及10μl TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)(西格玛)(0.01％终浓度)，用于聚合。
对于[35S]dATP测序，凝胶含有16.8g尿素(ICN),4.8ml 10X TEE缓冲液和4ml改性的丙烯酰胺溶液(＂Long Ranger＂,J.T.Baker,Phillipsburg,新泽西)。向溶液中加水使体积达到40ml，将溶液与200μ1过硫酸铵(西格玛)和20μl TEMED(西格玛)聚合。
跑胶缓冲液含有1X TBE。测序凝胶在40W/凝胶恒定功率下进行2-6小时。将[35S]dATP测序凝胶转移到一张Whatman滤纸上，并且在80℃真空下干燥45分钟。将两种类型测序凝胶对Cronex 4 X-光胶卷曝光(对Cronex而言，-20℃下18-48小时)。Ⅳ．蛋白质方法a)内和外膜的分离用Hancock和Carey(1979)等的修改(Lo等，1991)的方法从大肠杆菌和溶血巴斯德氏菌A1制备内和外膜制剂。于37℃在250ml合适的培养基中培养细菌一夜。经在4,000xg离心收集细胞，用0.01M Tris-HCl(pH 6.8)洗涤两次，并重悬于7.5ml冷的Sucrose-Tris溶液中，该溶液含有20％蔗糖，0.01 M Tris-HCl(pH 6.8)，溶菌酶(1mg/ml),DNase(50μg/ml)和RNase(100μg/ml)。于4℃在16,000-18,000 psi下用弗氏压碎器裂解细胞3次。将样品在1,085xg下离心5分钟以除去未裂解细胞。
将上清液铺设放到70∶52∶样品∶12％蔗糖梯度液(含有14ml 70和52％蔗糖，接着是5ml样品裂解物和4-5ml 12％蔗糖)上。于4℃在80,000 xg下在吊桶式转头中离心该梯度液16-18小时。经抽吸收集内与外膜组分。内膜组分位于12％和52％蔗糖区之间，并且具有淡黄-褐色。白色的外膜组分邻近70％蔗糖区。将收集的组分装入离心管，用dH2O封盖，于4℃在225,000 xg下在定角Ti80转鼓中离心1小时。然后通风干燥沉淀，并重悬于Tris-HCl(pH6.8),0.001M二硫苏糖醇缓冲液中。将样品保存在-20℃下。
b)蛋白质浓度的Bradford测定利用Bradford(1976)的方法测定内与外膜组分的蛋白质浓度。制备各膜组分的稀释液，用dH2O添加到0.8ml最终体积。然后将样品与0.2mlBradford试剂(Biorad,Mississauga，安大略)混合，在室温下温育5分钟，使发生显色。在595nm波长的分光光度计中测定各样品的光密度(OD)。利用在1-25μg范围中的牛血清白蛋白(BSA；西格玛)绘制标准曲线，从BSA标准曲线推知各样品的蛋白质的浓度。
c)十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以4％(w/v)堆积和7.5％(w/v)分离凝胶(Laemelli,1970)分析蛋白质。通过添加0.1％过硫酸铵和TEMED到0.01％使凝胶聚合。通过在100℃下5分钟用等体积的2X样品缓冲液溶解样品。也煮沸一种高分子量的标准物，并加到凝胶上。使用不连续缓冲液系统(0.192M甘氨酸，0.02M Tris-HCl[pH8.4],0.1％SDS)。
在100V使凝胶电泳，直到当电压增加到150V时样品进入分离胶。使样品电泳，直到染料前端脱离凝胶底部。除去堆积凝胶，将分离胶以考马斯亮蓝染色或者经电泳转移到硝酸纤维素上用于Western免疫印迹分析。用考马斯亮蓝R250(在40％甲醇，10％乙酸中的0.05％)(Eastman柯达)染色凝胶一夜，然后在甲醇∶乙酸溶液中脱色。
d)Western免疫印迹分析按照Burnette(1981)的方法将在丙烯酰胺凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将凝胶浸透在印迹缓冲液(0.192M甘氨酸，0.025MTris-Cl[pH8.4]，20％甲醇)中10分钟，以除去SDS。将剪切得符合凝胶的一片硝酸纤维素膜(Schleicher和Shuell,Willowdale，安大略)也浸透在印迹缓冲液中。用Bio-Rad Transblot装置在450 mA于3小时内将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。水冷却系统用来阻止印迹缓冲液的升温和分解。
在电泳转移之后，将硝酸纤维素膜浸透在在TTBS缓冲液(0.02MTris-C1[pH7.5],0.5M NaCl,0.05％Tween-20)中的3％明胶中30分钟，以封阻膜。将硝酸纤维素膜转移到1/500稀释的在1％明胶中的第一抗体上，在室温轻轻振荡下温育一夜。然后用TTBS缓冲液洗涤膜两次(每次15分钟)，将膜置入第二抗体溶液(1/2000稀释)中1小时。第二抗体是在1％明胶中的山羊抗-兔或山羊抗-牛IgG-碱性磷酸酶缀合物(Bio-Rad)。将膜用TTBS缓冲液洗涤两次(每次洗涤15分钟)，然后用NBT缓冲液(0.1MTris-C1[pH9.5],0.1M NaCl,50mM MgCl2)洗涤两次(每次洗涤5分钟)。然后将膜置入100μl各试剂5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP，在二甲基甲酰胺中的25mg/ml；西格玛)和氮蓝四唑(NBT，在70％二甲基甲酰胺中的50mg/ml；西格玛)的显色溶液中。使颜色出现，直到获得所需可见度的区带。通过用水洗涤膜终止颜色反应。将膜通风干燥。
e)T7蛋白质表达用Tabor和Richardson(1985)的方法分析由重组质拉鳊码的蛋白质。将tbpA基因克隆进质粒载体pBluescipt。将该重组质粒转化进大肠杆菌JM109(DE3)，该菌株是具有整合进染色体的T7 RNA聚合酶基因和lac启动子控制下的T7聚合酶基因的大肠杆菌JM109菌株(Yaninsch-Perron等，1985)。
在转化之后，将细胞在包含1.0％酪蛋白氨基酸，0.4％葡萄糖和适当的抗生素的Davis基本培养基中在37℃培养一夜。制备在20ml相同培养基中的1/50传代培养物，在37℃下培养另外的3-4小时，直到OD550=0.6。通过在14,000 xg下离心5分钟收集细胞，将沉淀重悬于具有0.4％葡萄糖的Davis基本培养基中。将样品在37℃下温育90分钟，然后加入100μl5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。在于37℃培养细胞20分钟后，加入利福霉素(400μg/ml的终浓度)。将样品在37℃温育30分钟，然后用5μCi[35S]-甲硫氨酸(“Trans-Label”ICN Biomedical，魁北克)标记60分钟。细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并且于微量离心机中在14,000 xg下离心5分钟收集。将沉淀重悬于2X SDS-PAGE样品缓冲液中。
用SDS-PAGE分离蛋白质，以考马斯蓝R250染色凝胶。然后将凝胶浸透在AmplifyTM(Amersham,Oakville，安大略)中30分钟，并且在真空下干燥。暴露放射自显影图18-48小时。结果Ⅰ．推定的tbpA,tbpB基因的初步克隆克隆tbpA基因的第一阶段是经聚合酶链反应筛选溶血巴斯德氏菌A1基因。合成对Tbp1蛋白质的N端氨基酸序列特异性的寡引物。溶血巴斯德氏菌A1密码子表(Lo,1992)用来优化引物序列。Tbp1引物与基于克隆载体pBR322的连接序列的引物一起使用(表1)。获得0.8 kbp PCR产物(图1)，克隆进M13载体并测序。这一PCR产物的序列分析显示头20个氨基酸与由Tbp1的N端氨基酸测序获得的序列相匹配。
表1．用于PCR的寡核苷酸引物
*下划线序列是HindⅢ位点**下划线序列是EcoRⅠ位点然后放射性标记0.8kb PCR产物，并用于经Southern杂交筛选含有溶血巴斯德氏菌A1基因文库的大肠杆菌克隆的特异性探针。两重组体克隆9和10与tbpA探针强烈杂交。通过限制性内切酶作图分析各重组体克隆的质粒DNA(图2)。确定溶血巴斯德氏菌A1的插入物对质粒9和10分别约为8.7kb和2.3kb。质粒的初始序列分析确认两个质粒的DNA共有一个重叠区。质粒9包含整个tbpA基因，但是tbpA的直接上游区不同于质粒10的上游区。质拉9中的插入DNA从基因组分离区的两个DNA片段形成是可能的。在质粒10中，tbpA的直接上游区包含相应于tbpB基因的附加开放读框。因此这一质粒不仅包含tbpA基因的5’区，而且在tbpA基因的直接上游也包含tbpB基因的一部分区。
第三个重组体克隆482包含整个tbpB基因。这一质粒与质粒10共有一个重叠区(图2)。在质拉482中的插入DNA是利用对Tbp2蛋白质的氨基酸序列特异性的引物从溶血巴斯德氏菌A1基因组DNA获得的PCR产物。然后将这一PCR产物克隆进载体PCRⅡ。
从质粒9测序3.0kbp tbpA基因(从BgⅢ位点开始)。从质粒482和10测序2.1kbp tbpB基因与thpA和tbpB之间的91bp序列。Ⅱ．序列分析测序5.2kbp DNA，显示含有串联排列的两个开放读框，具有上游于tbpA的tbpB(图3)。这一遗传组构与在其它细菌中的铁摄取系统是一致的，在其它细菌中所说的基因经常排列在操纵子中(Payne,1988)。基于推定的Tbp1蛋白质的序列分析，观察到推定的28个氨基酸的前导肽。在推定的Tbp2蛋白质中观察到脂蛋白的推定的切割序列。tbpA和tbpB密切近似和在tbpA中缺乏启动子区说明两种蛋白质可以协同表达。在tbpB的启动子区中的Fur共有序列说明蛋白质可以以类Fur方式被调节。在溶血巴斯德氏菌tbpB中的Fur共有序列类似于在淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌tbpB中发现的共有序列(图4)。Tbp1和Tbp2的等电点由PCGene(Chargpro)计算分别为9.16和9.71，使它们为碱性蛋白质。Ⅲ．预测蛋白质拓扑结构序列分析程序Gene Runner(Hastings软件)用来分析溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2蛋白质的物理特征和预言二级结构。利用Kyte和Doolittle(1982)的方法产生Tbp1和Tbp2的亲水性图。Tbp1的头28个氨基酸形成疏水区，这是所有信号序列的特征。在所述蛋白质中有六个其它疏水区，这可以是蛋白质的跨膜结构域。蛋白质的亲水区域可以暴露在细胞表面或在外周质中。也产生淋病奈瑟氏球菌的亲水性图。淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白质似乎不如溶血巴斯德氏菌Tbp1疏水，但某些疏水区的位置是类似的。例如，两种蛋白质都具有围绕200,400，以及780氨基酸残基的疏水区。在疏水区中的相似性说明两种蛋白质共有重要程度的同源性，并且可以具有一种类似的结构。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Kyte-Doolittle图揭示在该蛋白质的中心的几个大的疏水区和在各末端的两个较小的亲水区。与淋病奈瑟氏球菌Tbp的亲水性图的这一明显不同说明两种蛋白质可以具有不同的结构。
采用Emini表面概率方法(Emini等，1985)确定Tbp1和Tbp2的表面暴露区。图表上的峰相应于具有暴露最高概率的区。各种蛋白质的表面暴露区可以涉及到配体结合和可以是抗原性的。溶血巴斯德氏菌Tbp1的Emini图说明邻近蛋白质的330,410,460,560,610和820的氨基酸的亲水区可以暴露在细胞表面。淋病奈瑟氏球菌Tbp1的Emini图显示与溶血巴斯德氏菌Tbp1的几个共同的暴露区(在330,580,810区)。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Emini图说明在氨基酸140,160和620的亲水区具有暴露的最大概率。淋病奈瑟氏球菌Tbp2的Emini图显示仅在160,330的暴露区类似于溶血巴斯德氏菌Tbp2的表面区。
利用Chou-Fasman(1978)的方法，预测Tbp1和Tbp2的二级结构。溶血巴斯德氏菌Tbp1的Chou-Fasman图预测蛋白质主要是β-折叠与β-转角结构。淋病奈瑟氏球菌Tbp1的Chou-Fasman图预测一种类似的结构。这些预测与其它铁-相关外膜蛋白质的其它拓扑结构预测是一致的，所说的外膜蛋白质也是由两亲性β-折叠组成的(Moeck等，1994)。注意到两个Tbp1Kyte-Doolittle图中β-折叠的位置相应于疏水结构域的位置也是有意义的。
溶血巴斯德氏菌Tbp2的Chou-Fasman图表明它也是主要由β-折叠与β-转角组成的。β-折叠的所预测的模式不同于淋病奈瑟氏球菌Tbp2，后者也具有β-折叠区。这些结果增加了Tbp2蛋白质具有不同结构的证据。Ⅳ．tbpA在溶血巴斯德氏菌和相关物种中的分布进行Southern杂交分析以确定是否所有的十六种血清型溶血巴斯德氏菌携带有编码Tbp1蛋白质的基因。用限制性内切核酸酶消化来源于每种血清型的染色体DNA，并且以溶血巴斯德氏菌A1的tbpA基因的5’末端探查。在胸膜肺炎放线杆菌CM％和shope 4074和猪放线杆菌3714上进行类似的杂交实验。
用溶血巴斯德氏菌A1 tbpA探针的高严格性杂交(50％甲酰胺)显示在溶血巴斯德氏菌的所有十六种血清型中存在tbpA同源的序列(图5,6)。此外，在A和T生物型之间与探针杂交的片段的大小上存在明显的不同。注意到在图5中血清型7 DNA(用Southern杂交其不给出反应带)的质量上存在问题是重要的。这一血清型的反应应与血清型1的相同。一个类似的问题在图6中发现，其中血清型12和16的DNA被不适当地消化。这些血清型的反应应该与血清型1的相同。
与tbpA探针的低严格性杂交(25％甲酰胺)显示猪放线杆菌3714，胸膜肺炎放线杆菌CM5和Shope 4074基因组DNA与溶血巴斯德氏菌tbpA探针杂交(图7)。胸膜肺炎放线杆菌的两个菌株都属于血清型1，并以相同的方式杂交。溶血巴斯德氏菌A1，猪放线杆菌和胸膜肺炎放线杆菌中tbpA,tbpB区的基本限制性酶切图在图8中显示。Ⅴ．同源性研究将溶血巴斯德氏菌Tbp1的预测的氨基酸序列与Neisseria spp和胸膜肺炎放线杆菌运铁蛋白结合蛋白以及几个大肠杆菌TonB-依赖性受体蛋白质的预测的序列比较。所有比较均按照Higgins和Sharp算法(Higgins和Sharp,1988)进行。
发现溶血巴斯德氏菌Tbp1的预测的氨基酸序列具有与淋病奈瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌Tbp1蛋白质(Comelissen等，1992；Legrain等，1993)高度的同源性(图9)。发现包括相同和保守氨基酸的同源性为41％。这一结果与蛋白质拓扑结构研究一致，说明溶血巴斯德氏菌和Neisseria spp.Tbp1蛋白质共有一种类似的结构。溶血巴斯德氏菌Tbp1和胸膜肺炎放线杆菌血清型7和血清型1 TfbA蛋白质(Gerlach等，1992a；Gerlach等，1992b)之间的同源性比较揭示仅有低程度(22％)的同源性(图10)。在巴斯德氏菌属，奈瑟氏球菌属和放线杆菌属运铁蛋白结合蛋白之间的遗传相关性程度在图11中以树形图形式显示。注意到溶血巴斯德氏菌Tbp1对奈瑟氏球菌属Tbp1的相关性比对放线杆菌属运铁蛋白结合蛋白的相关性更密切是有意义的。
溶血巴斯德氏菌Tbp1也有与大肠杆菌TonB依赖性外膜受体同源的局部区(图12)。与这些蛋白质的同源性意味着溶血巴斯德氏菌Tbp1也是一种TonB依赖性受体蛋白质。第一个同源的结构域包含TonB盒，这在TonB和受体蛋白质之间的直接相互作用中涉及到(BeⅡ等，1990)。其它的同源结构域的意义不清楚，然而，它们也牵涉到TonB相互作用是可能的。Ⅵ．Tbp1的T7表达进行T7表达以表达由tbpA编码的蛋白质(图13)。在铁-耗尽和铁-充分的条件下通过大肠杆菌maxi-细胞分析来表达tbpA的尝试是不成功的(数据未显示出)。T7表达不产生任何在100 kDa的反应带。30 dDa阳性对照在第1泳道上显示。在携带tbpA的质粒和pBluescript单独的载体之间没有任何区别(图13，第2和3道)。Ⅶ．Western免疫印迹分析制备在铁-有限和铁-充分条件下生长的溶血巴斯德氏菌A1和大肠杆菌HB101细胞的内和外膜组分，并用Western免疫印迹法分析。这些实验的目的是鉴别铁-调节蛋白质是否与针对可溶性溶血巴斯德氏菌抗原制备的抗血清发生抗原性反应。将所说的内与外膜组分与兔＂抗-自身＂抗血清一起免疫印迹，所说的抗血清是抗可溶性溶血巴斯德氏菌A1(在补充有兔自身血清(避免包含血清蛋白质的抗体)的RPMI 1640中培养的)抗原产生的。用大肠杆菌HB101细胞预吸收所说的抗血清，以最大限度地减小与大肠杆菌抗原的反应性。在铁-有限条件下生长的溶血巴斯德氏菌A1细胞的外膜组分中没有观察到相应于运铁蛋白结合蛋白的免疫活性带(图14，第3泳道)。
也将内与外膜组分与牛血清一起免疫印迹，所说的牛是用Presponse作为第一抗体接种过的(图15)。用大肠杆菌HB101细胞预吸收所说的抗血清，以限制大肠杆菌免疫反应性物质的量。在溶血巴斯德氏菌细胞(在铁-有限条件下培养的)外膜中观察到71,77和100 kDa的带(图15，第3泳道)。这些蛋白质带相应于溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白大小。如果这些抗原带是运铁蛋白-结合蛋白，则，这一结果说明这些肽在牛中是抗原性的，也是免疫原性的。讨论Ⅰ．基本序列分析溶血巴斯德氏菌tbpA和tbpB的基本核苷酸序列在图3中显示。溶血巴斯德氏菌tpbB的启动子区在图4中显示。
基于克隆DNA的基本序列分析，发现两个tbp基因串联排列，tbpB直接在tbpA的上游。这一遗传组构与在其它细菌(如Neisseria spp)中的铁摄取系统是一致的，在其它细菌中所说的基因经常排列在操纵子中(Anderson等，1994)。很可能在溶血巴斯德氏菌A1铁摄取中牵涉到的基因也排列在操纵子中。tbpA基因仅仅是核糖体结合序列，而tbpB基因之前是核糖体结合位点，并且在它的启动子区中具有Fur共有序列。
推定的Fur共有序列的存在意味着两个基因可以被铁浓度协同调节，以及溶血巴斯德氏菌A1中存在Fur同系物。在病原性Neisseria Spp.中Fur同系物已被克隆和测序(Berish等，1993；Thomas和Sparling,1994)。如果溶血巴斯德氏菌A1 Fur同系物存在，则它可以牵涉到其它抗原(白细胞毒素)的调节作用。Strathdee和Lo(1989)报道在铁-有限条件下，产生的白细胞毒素的量减小。这一点在diptheria毒素的情形下相反(Boyd等，1990)，其中当细胞在铁-有限条件下培养时，毒素的产生增加。在溶血巴斯德氏菌白细胞毒素产生中Fur充当正调物是可能的。这一点与Gentry等(1986)在包含铁的介质中增加毒素产生的早期观察是一致的。脑膜炎奈瑟氏球菌也产生铁-调节蛋白质，其与外蛋白质的RTX家族相关(Thompson等，1993)。
在tbpA序列中的头28个预测的氨基酸形成推定的信号序列。信号序列对在横跨膜的转运的过程中将前体蛋白质插入到膜中来说十分重要。信号序列还在前体蛋白解蛋白切割为其成熟形式中充当识别位点(vonHeijne,1983；Benson和Silhavy,1983)。信号序列的存在证实Tbp1位于胞质膜以外，但是它不含有任何排序信息。Tbp1的预测氨基酸序列在蛋白质的羧基末端具有末端苯丙氨酸残基。苯丙氨酸是疏水芳香族氨基酸，有利于在膜中分配疏水环境。末端苯丙氨酸残基的存在显示对外膜定位来说是重要的(Struve等，1991)，并且说明溶血巴斯德氏菌Tbp1位于外膜中。
tbpB的序列分析揭示脂蛋白的推定的切割序列。脂蛋白具有特征性切割序列Leu-X-Y-Cys，其中X和Y是小的中性氨基酸(Wu,1987)。这说明Tbp2是被加工的和被脂质修饰的。注意到Tbp2缺乏牵涉到外膜定位的末端苯丙氨酸残基是有意义的。类似的运铁蛋白结合脂蛋白在流感嗜血菌，淋病萘瑟氏球菌和脑膜炎奈瑟氏球菌(Legain等，1993)Anderson等，1994)中发现。Griffiths等(1993)已阐明在淋病萘瑟氏球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌和流感嗜血菌b型中的Tbp2蛋白质中的共同的抗原结构域。
一种蛋白质的等电点(pI)被定义为所说的肽具有0净电荷时的pH值。pI的计算假定没有干扰电离状态的任何三维结构。因此，计算的pI值仅仅是近似值，并且可以不同于实验结果。溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2的pI被计算出分别为9.16和9.71。已说明阳离子多肽增加体内膜相互作用。Tbp1的碱性性质提高与宿主运铁蛋白蛋白质相互作用是可能的。奈瑟氏球菌属的Tbp1(Cornelissen等，1992)和Fbp(Berish等，1990)蛋白质也是碱性蛋白质。在嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)中，碱性表面蛋白质起作用抑制噬溶酶体(phagolysosomal)融合(Cianociotto等，1989)。
Ⅱ．蛋白质拓扑结构的初步预测利用Kyte和Doolittie的方法(1982)产生Tbp1和Tbp2的亲水性图。在溶血巴斯德氏菌Tbp1的亲水性图中，第一个峰位于第1至30位氨基酸。这代表所有信号序列共同的疏水核心(Hayashi和Wu,1990)。其它的疏水区可以是跨膜结构域。疏水结构域可以是暴露在细胞表面或外周质的蛋白质的区。在溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白质中跨膜区的位置类似于许多在淋病奈瑟氏球菌Tbp1中预测的跨膜区。这说明Tbp1蛋白质可以具有一种类似的结构，以及它们在氨基酸水平上共有一定程度的同源性。溶血巴斯德氏菌Tbp2蛋白质具有在蛋白质的中心的疏水前导序列以及几个大的疏水区，并且明显不同于对淋病奈瑟氏球菌Tbp2预测的亲水性图。这意味着两种蛋白质在结构上不同。
利用Emini表面概率方法预测Tbp1和Tbp2的表面暴露区。向细胞表面暴露的Tbp1和Tbp2的区可以牵涉到配体相互作用，并且可以是抗原性的。
Chou-Fasman法一般用于预测蛋白质的二级结构。该方法基于各氨基酸具有的对α-螺旋、β-折叠或β-转角的倾向。Chou-Fasman法预测溶血巴斯德氏菌Tbp1由许多β-折叠与β-转角组成。这些β-折叠重复横越外膜和间插序列构成表面或外周质暴露环是可能的。Chou-Fasman法也预测淋病奈瑟氏球菌Tbp1也是由β-折叠组成的。对大肠杆菌外膜蛋白质如FepA(Moeck等，1994)，这一结构已经提出。溶血巴斯德氏菌和淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白质共有一种共同的结构，它意味着它们也可以有从宿主运铁蛋白分子除去铁的一种类似的机理。溶血巴斯德氏菌Tbp2的Chou-Fasman图也预测明显不同于对淋病奈瑟氏球菌Tbp2预测的占优势的β-折叠与β-转角结构。Ⅲ．tbpA在溶血巴斯德氏菌和相关物种中的分布十六种溶血巴斯德氏菌血清型基因组DNA与tbpA探针的Southern杂交显示高度同源的基因存在于A生物型内。结果也说明遗传组构或tbpA基因在T生物型中明显不同。这支持了Murray等(1992)的观察结果，Murray等指出，A和T生物型的铁-调节蛋白质在抗原性上是不同的。以前在溶血巴斯德氏菌抗原决定簇上的工作说明，唾液酸糖蛋白酶，血清型特异性抗原，三种脂蛋白以及LPS生物合成基因在T生物型中是丧失的或具有一种不同的遗传组构(Burrows，博士论文，1993)。A和T生物型确实共有表型和生化特性(Holt,1977)，但是基于DNA:DNA杂交，它们仅仅是远缘相关的(Bingham等，1990)。Sneath和Stevens(1990)提出生物型T血清型重新命名为物种海藻巴斯德氏菌。
在运铁蛋白结合蛋白的遗传组构中的多样性也在胸膜肺炎放线杆菌TfbA(Gonzalez等，1990；Gerlach等.,1992b)和脑膜炎奈瑟氏球菌Tbp2(Legrain等，1993；Rokbi,1993)中显示。在胸膜肺炎放线杆菌中，血清型1和血清型7 TfbA蛋白质在氨基酸水平上共有仅55％的同源性(Gerlach等，1992b)。基于它们的分子量，序列相似性，以及抗原不均一性，脑膜炎奈瑟氏球菌Tbp2蛋白质划分成两类(Robki等，1993)。在物种之内的运铁蛋白结合蛋白的多样性可以有利于结合不同的血清型，以避免抗异源菌株的宿主免疫反应(Gerlach等，1992b)。
Southern杂交实验显示来源于胸膜肺炎放线杆菌菌株CM5和Shope4074的染色体DNA仅在低严格性条件下与tbpA探针杂交。这说明溶血巴斯德氏菌和胸膜肺炎放线杆菌运铁蛋白结合蛋白仅共有低程度的同源性。这一结果由对溶血巴斯德氏菌Tbp1和胸膜肺炎放线杆菌TfbA蛋白质的氨基酸序列的同源性研究证实。
猪放线杆菌基因组DNA也与tbpA探针杂交，这说明它可以具有类似运铁蛋白结合蛋白。结果也说明猪放线杆菌运铁蛋白结合蛋白对Tbp1和溶血巴斯德氏菌的相关性可以比对胸膜肺炎放线杆菌TfbA的相关性更为密切。Ⅳ．同源性研究所有蛋白质序列由PCGene(Clustal)进行序列对比，PCGene根据Higgins和Sharp的方法比较序列(1988)。在这一方法中的第一个步骤是计算所有逐对序列的相似性。然后从第一步骤产生的相似性基础产生树型图。图11中的树型图是用巴斯德氏菌属，放线杆菌属和奈瑟氏球菌属运铁蛋白结合蛋白的Higgins与Sharp序列对比产生的。
a)Neisseria spp溶血巴斯德氏菌tbpA的预测的氨基酸序列具有与淋病奈瑟氏球菌tbpA预测的氨基酸序列的同源性区。这说明运铁蛋白结合蛋白在结构上类似，并且与蛋白质拓扑结构研究中的观察结果一致。Ogunnariwo和Schryvers(1990)报道溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1在大小和性质上类似于淋病奈瑟氏球菌Tbp1蛋白质。两物种都产生在SDS-PAGE之后不能结合运铁蛋白的100 kDa受体蛋白质，这说明在运铁蛋白结合中天然蛋白质构象是重要的。然而，两种蛋白质在它们的结合特异性方面是不同的淋病奈瑟氏球菌Tbp1仅结合人运铁蛋白，而溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1结仅合牛运铁蛋白。这说明两种tbpA序列之间的区别可以是编码铁来源的特异性的区。
b)胸膜肺炎放线杆菌溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1的预测的氨基酸序列与胸膜肺炎放线杆菌TfbA的序列具有低程度的同源性。这一结果由Southern杂交实验证实，该实验说明胸膜肺炎放线杆菌菌株CM％和Shope 4074的染色体DNA仅在低严格性条件下与tbpA探针杂交。这是有意思的，因为两种细菌都属于巴斯德氏菌科，预期具有一种类似的运铁蛋白结合蛋白。以前的工作曾说明两种蛋白质在功能上类似但是在结构上不同。在胸膜肺炎放线杆菌中的TfbA蛋白质表现出是脂蛋白(Gonzalez等，1990)，而100 kDa溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1不是(Ogunnariwo和Schryvers,1990)。胸膜肺炎放线杆菌能够区别铁-饱和和铁-耗尽运铁蛋白(Gerlach等，1992a)，而脑膜炎萘瑟氏球菌不能(Tsai等，1988)。注意到胸膜肺炎放线杆菌TfbA具有与也是脂蛋白的淋病奈瑟氏球菌Tbp2的同源性是有意义的。这说明TbpA蛋白质类似于Tbp2，胸膜肺炎放线杆菌的Tbp1目前还没有鉴别。
cTonB依赖性-受体蛋白质溶血巴斯德氏菌Tbp1序列也具有与大肠杆菌TonB依赖性受体蛋白质组共同的氨基酸。这一发现说明溶血巴斯德氏菌A1属于这一家族，TonB同系物存在于巴斯德氏菌属的物种中。第一个同源的结构域或＂TonB盒＂在受体蛋白质和TonB之间的直接相互作用中牵涉到(BeⅡ等，1990,Brewer等，1990)。其它的同源的区的意义不清楚，但是它们对TonB相互作用可以是所需的，或对外膜定位来说可以是必要的。溶血巴斯德氏菌Tbp1，如同许多其它TonB-依赖性蛋白质一样，是铁-调节的跨膜蛋白质，并且牵涉到铁利用中(Mietzner和Morse,1994)。如同对大肠杆菌FepA(Rutz等，1992)所提出的，溶血巴斯德氏菌Tbp2可能起门控通道的作用。淋病奈瑟氏球菌(Cornelissen等，1992)和流感嗜血菌(Jarosik等，1994)两者的Tbp1也都属于TonB-依赖性受体蛋白质家族。
Ⅴ．提出的溶血巴斯德氏菌铁摄取模型许多类似蛋白质在奈瑟氏球菌属，巴斯德氏菌属和嗜血菌属中的存在说明一种共同的机理可被铁获取所利用。铁获取的假设模型已经对奈瑟氏球菌属提出(Chen等，1993)，其可以用作溶血巴斯德氏菌A1的模型。铁丧失激活类Fur调节系统的铁-调节蛋白质的转录。宿主运铁蛋白通过由两种或多种蛋白质组成的特异性铁受体复合物结合到细菌细胞表面。铁被从运铁蛋白除去，并且利用TonB提供的能量横跨细菌外膜。在外周质中，铁短暂复合到外周质组分Fbp上，该组分向胞质膜通透酶运输它。铁通过外周质结合蛋白转运系统横跨胞质膜。在胞质中，铁还原成Fe2+，并且由细胞同化。
对溶血巴斯德氏菌A1铁摄取可以是唯一的一个特征是第三铁-调节外膜蛋白质的存在(71 kDa)，其可以形成受体复合物的一部分(Ogunnariwo和Schryvers,1990)。此外，溶血巴斯德氏菌没有在SDS-PAGE和电印迹之后能够结合运铁蛋白的受体蛋白，而淋病奈瑟氏球菌有(Schryvers和Morris,1988)。这说明溶血巴斯德氏菌受体复合物的结合机理可以与淋病奈瑟氏球菌中的受体复合物稍有不同。
在巴斯德氏菌科中已经鉴别了类似于淋病奈瑟氏球菌Fbp的蛋白质。在流感嗜血菌中已鉴别了一种40 kDa的周质蛋白质，发现它的N端序列81％同源于淋病奈瑟氏球菌Fbp(Harkness等，1992)。在溶血巴斯德氏菌A3中，描述了35 kDa周质铁-调节蛋白质，但是还没有发现其任何功能(Lainson等，1990)。此外，已经采用亲和性方法从溶血巴斯德氏菌A1分离了一种37 kDa铁调节蛋白质(Ogunnariwo和Schryvers,1990)。基于大小和位置相似形，这两种蛋白质类似于淋病奈瑟氏球菌Fbp是可能的。
Ⅵ．T7蛋白质表达Tbp1基因产物的T7 RNA聚合酶-依赖性产生在大肠杆菌JM109(DE3)中是不成功的(图13)。一种可能的解释是tbpA的核糖体结合位点是低效能的。或许所说的基因可以克隆进载体，这种载体携带一个功能性核糖体-结合位点。另外，Tbp1蛋白质可以是不稳定的，并且需要其它蛋白质或因子的存在，以正确产生。当它们单独被合成时，异源二聚蛋白质组分经常不稳定。
Ⅶ．Western免疫印迹分析对在铁-充足和铁-有限条件下生长的溶血巴斯德氏菌A1细胞内和外膜组分进行Western免疫印迹(图14和15)。铁-有限条件通过添加铁螯合剂EDDA模拟，EDDA是在培养介质中限制铁可用性的普通的合成铁螯合剂。选择EDDA用于这些研究，这是由于其对铁的特异性和其缺乏对细菌的毒副作用(Neilands,1981)。
由抗可溶性抗原的兔抗血清免疫染色的溶血巴斯德氏菌A1膜组分不与铁-调节蛋白质反应(图14)。在这一免疫印迹中既没有观察到100 kDa也没有观察到77 kDa铁-调节蛋白质，可能是因为原始溶血巴斯德氏菌A1培养物(用于兔的超免疫)在铁有限条件下不能生长。所使用的介质包含7％的血清，以避免包含血清蛋白质的抗体。相反，可以是铁-调节蛋白质的肽与用Presponse接种的牛抗血清反应(图15)。Presponse是由在无血清RPMI培养基1640中生长至后对数期的溶血巴斯德氏菌A1细胞产生的(Shewen和Wilkie,1987；Shewen等，1988)。这一培养基的低铁浓度诱导运铁蛋白结合蛋白产生是可能的。牛对由溶血巴斯德氏菌(其在鼻咽中是共生体)产生的运铁蛋白结合蛋白反应也是可能的。对运铁蛋白结合蛋白的抗体的存在说明这些蛋白质是免疫原性的。实施例2细菌菌株。用于这一研究中的细菌菌株在表2中列出。溶血巴斯德氏菌菌株h173,h174,h175和h176是患有肺巴斯德氏菌病的反刍动物的场分离物，由Frank Milward博士(Rhone Merieux,Lyon，法国)提供。溶血巴斯德氏菌h44-h46菌株是牛临床A1型分离物，来源于从S.Lundberg，兽医实验室，Regional Agricultaral Building,Airdrie,Alberta获得的患肺炎的牛。h44以前已有描述(26)。溶血巴斯德氏菌菌株h93-h97是来源于患肺炎的牛的牛临床A1型分离物，从兽医和传染病组织(VIDO)，Saskatoon的A.Potter博士获得。菌株h98-h107是ATCC溶血巴斯德氏菌菌株(5)，也是从A.Potter博士获得的。马驹放线杆菌(Actinobacillusequuli)(马驹嗜血菌)菌株h50从兽医实验室，Regional AgriculturalBuilding,Airdrie,Alberta的Jane Pritchard博士获得。新物种海藻巴斯德氏菌(34)。
表2．包括在这一研究中的菌株表物种 菌株血清型宿主 来源物种溶血巴斯德氏菌h44 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h45 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h46 A1 牛 S.Lunberg,Airdrie溶血巴斯德氏菌h93(ph21)A1 牛 A.Potter.VIDO溶血巴斯德氏菌h94(ph24)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h95(ph27)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h96(ph45)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h97(ph46)A1 牛 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h196 A1 牛 R.Lo,U.of Guelph溶血巴斯德氏菌h98(ATCC33366) A2 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌*h99(ATCC33367) T3 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌*h100(ATCC33368) T4 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h101(ATCC33370) A6 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h102(ATCC33371) A7 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h103(ATCC33372) A8 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h104(ATCC33373) A9 绵羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h105(ATCC33369) A5 绵羊 A.Potter,VCDO溶血巴斯德氏菌*h106(ATCC33374) T10 绵羊 A.Potter,VlDO溶血巴斯德氏菌h107(ATCC33375) A11 山羊 A.Potter,VIDO溶血巴斯德氏菌h173(77020-15184)未分型 山羊 F.Milward RhoneMerieux溶血巴斯德氏菌h174(90020-16266)A7 山羊 F.Milward,RhoneMerieux溶血巴斯德氏菌h175(84020-15786)A7 绵羊 F.Milward,RhoneMeriewr溶血巴斯德氏菌h176(84020-15792)A9 绵羊 F.Milward,RhoneMerieux马驹放线杆菌 h50 马 J.Pritchard,Airdric*T-型菌株现在被认为是新菌株，海藻巴斯德氏菌(34)。生长条件。所有细菌菌株在-70℃下贮存在30％甘油中。将冰冻的分离物划线到巧克力琼脂平板上，并且在37℃下5％CO2的温箱中进行温育。通过在补充2μg/ml硫胺素一磷酸和3μg/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)并包含铁螯合剂乙二胺二羟苯乙酸(EDDHA，西格玛)的人脑心脏灌输肉汤(BH1,Difco实验室)或O’Reilly Niven肉汤(25)(最终浓度100μM)上培养细菌完成铁-有限生长。如前所述完成利用不同运铁蛋白作为铁源的生长实验(26)。
运铁蛋白和衍生物的制备。牛运铁蛋白从西格玛获得。马、羊(绵羊)和公山羊(山羊)运铁蛋白的制备(2),30％或100％饱和运铁蛋白的铁装载(22)和辣根过氧化物酶(HRP)与运铁蛋白(37)的缀合实质上如前所述。在牛，绵羊，公山羊和马运铁蛋白(HRP-bTf,HRP-oTf,HRP-cTf和HRP-eTf)缀合物的制备中，在化学缀合之后，将HRP和运铁蛋白的混合物进行凝胶过滤。将显示最大活性的组分收集起来，透析和冰冻等份样，并且存储在-70℃。
固相结合分析。固相结合分析在本质上是从上述方法衍生出来的(32)。将完整细胞悬液或粗制整膜制品等份点样在硝酸纤维素/乙酸纤维素膜(HA纸，Millipore公司，Bedfbrd,MA)上，并且在干燥之后用包含0.5％脱脂牛奶的缓冲液(封闭溶液)封闭HA纸。对于运铁蛋白结合分析来说，将所用的纸放在包含450 ng/ml HRP-缀合运铁蛋白的封闭溶液中，洗涤并且实质上如前所述(32)用HRP底物混合物进行显影。对于估计完整细胞结合抗-受体抗体来说，除了第一种结合溶液包含抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的1/1000稀释液外使用类似的方法洗涤后，将膜暴露于包含HRP-缀合山羊抗-兔抗体制剂1/3,000稀释液的第二种结合液中。
运铁蛋白结合蛋白(TbpA和TbpB)的亲和分离。根据制造商说明，利用包含3.5 mg/ml铁-饱和运铁蛋白的溶液分别将牛，绵羊，公山羊和马运铁蛋白与CNBr-激活琼脂糖凝胶4B相偶联。通过添加乙醇胺来封闭激活基团。非偶联运铁蛋白通过用10至20倍柱体积的包含6.0M盐酸胍的50mMTrisHCl,1M NaCl,pH8.0缓冲液洗涤除去，进一步洗涤后，结合的运铁蛋白在0.1M柠檬酸钠/0.1M NaHCO3pH8.6缓冲液中用包含5μg/mlFeCl3的溶液重新与铁装上。
如前所述(32)从溶血巴斯德氏菌或马驹放线杆菌制备的铁-缺乏总膜(200mg蛋白质)用包含1.0M NaCl的50mM Tris pH8.0稀释成2mg/ml。分别添加EDTA和十二烷基肌氨酸钠(sarkosyl)至10mM和0.75％的终浓度将稀释的膜溶解，在室温下将混合物在轻微振荡下温育15-30分钟。溶液在10,000rpm下离心10分钟以便除去不溶碎片。将包含溶解膜的上清液加到1.5×10cm运铁蛋白-亲和柱，然后用包含1.0 M NaCl,10mMEDTA,0.75％十二烷基肌氨酸钠的50mM Tris pH8.0充分(至少10倍柱床体积)洗涤以便除去非特异性结合的蛋白质。在使用低盐洗涤条件的实验中洗涤缓冲液包含100mM NaCl(代替了1M NaCl)。在一些实例中，用2-3倍柱床体积包含0.2M盐酸胍的缓冲液进行附加洗涤以便尽可能地除去污染蛋白质。
两种运铁蛋白结合蛋白(TbpA和TbpB)的共洗脱是通过应用2-3倍柱床体积的在50mM Tris pH8.0(包含1.0M NaCl、1mM EDTA、0.01％十二烷基肌氨酸钠)中的2.0M盐酸胍完成的。收集洗脱剂用于立即对50mMTris pH5.0透析。以更高浓度的盐酸胍进一步处理通常不会导致受体蛋白质的更高的产率。以2倍柱床体积每种包含0.2、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0和3.0盐酸胍的缓冲液分别通过顺序洗脱得到TbpA和TbpB单个分离物。对洗脱物在18小时期间用3种不同的3升50mM Tris pH8.0进行透析，并且用超滤法进行浓缩。在SDS-PAGE分析之后，收集来自0.5到0.75M盐酸胍洗脱缓冲液的组分，作为TbpB制剂，同时收集来自1.5到2M盐酸胍洗脱缓冲液的组分，作为TbpA的制剂。分析方法。采用如前所述(32)的SDS-PAGE和接下来的银染分析蛋白质样品。对于Western印迹分析来说，在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离大约1-2.m纯化受体蛋白质或40.m来自铁-缺乏细胞的外膜蛋白质。蛋白质通过在20mM Tris,pH7.5,150mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS中15V下的电泳一夜转移到硝酸纤维素(Millipore,Bedford,MA)上。滤膜用在20mM Tris,pH7.5,500mM NaCl(TBS)中的0.5％脱脂牛奶在室温下封闭30分钟。将封闭溶液中适当抗体的1/300稀释液在室温下用到纸上1小时，接着进行两次10-分钟的TBS洗涤。使第二抗体(来自BioRad的山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶缀合物)的1/3000稀释液在室温下结合一小时。在TBS中，经过三次10-分钟的洗涤除去缀合物，并且利用HRP-底物混合物进行显影。受体特异性比较以前的研究已经显示了来自各种反刍动物的病原细菌物种的运铁蛋白受体对不同反刍动物运铁蛋白(即牛、绵羊和山羊)在特异性上是不同的(38)。这可能反映出牵涉配体的受体蛋白质区域的不同，并且指出对于反刍动物病原体来说，这些区域不能成为广谱运铁蛋白受体为基础的疫苗的基础。然而，不排除一群相关反刍动物病原体(如各种巴斯德氏菌属物种)可能具有能为产生交叉保护性应答提供基础的共同配体结合结构域。这样，确定来自一组的代表性巴斯德氏菌属分离物的运铁蛋白受体是否具有对反刍动物病原体相同的特异性是重要的。
作为受体特异性的初步分析，一组代表性分离物用来估计它们利用各种反刍动物运铁蛋白作为供生长的铁源的能力(表2)。利用上述方法部分所述的简单的平板测定。来自反刍动物(牛、公山羊和绵羊)但不是来自非反刍动物(马)宿主的Fe-饱和运铁蛋白刺激所有溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的代表性反刍动物分离物的生长。马运铁蛋白刺激马病原体马驹放线杆菌(菌株h50)的生长表明溶血巴斯德氏菌菌株没有利用马运铁蛋白作为铁源的能力不是因为制剂中缺乏该蛋白。
表3在不同运铁蛋白上的生长。物种 菌株 血清型宿主生长用Tf来源bTfoTfcTfeTf溶血巴斯德氏菌h44 A1牛 + + + -溶血巴斯德氏菌h173未分型山羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h174A7羊 + + + -溶血巴斯德氏菌h175A7绵羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h176A9绵羊+ + + -溶血巴斯德氏菌h106TI0 绵羊+ + + -马驹放线杆菌 h50 马 - - - +作为受体特异性的进一步估计，利用运铁蛋白的辣根过氧化物酶(HRP)缀合物通过简单结合分析来估计用完整细胞或分离膜对运铁蛋白的结合。缀合物从牛，绵羊和公山羊运铁蛋白中制备，并且检验它们与分离自溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的几个代表菌株的铁-缺乏细胞的全膜的结合能力。结果说明所有选择的菌株都能结合三种反刍动物(牛，公山羊和绵羊)运铁蛋白，但是不能结合马运铁蛋白(图16)，这与生长研究结果相一致(表3)。为了确定观察到的所有三种反刍动物运铁蛋白的结合是因为选择物种的相同受体，进行竞争性结合分析，其中检验非标记反刍动物运铁蛋白封闭标记运铁蛋白结合的能力。在这些实验中，各种反刍动物运铁蛋白的交互抑制作用同样有效，这表明它们结合具有类似亲和性的相同受体(数据未显示)。
生长和结合研究结果表明牛、绵羊和公山羊运铁蛋白能够与在溶血巴斯德氏菌中铁获取所涉及的受体组分相互作用。将在方法部分所述的亲和性方法通过使用牛、绵羊或公山羊运铁蛋白-琼脂糖凝胶树脂来确定与反刍动物运铁蛋白相互作用的蛋白质。如图17中所说明的，当使用牛(泳道A和B)、绵羊(泳道C)或公山羊(泳道D)运铁蛋白亲和柱任何一种时，用来自牛分离物(h44)，公山羊分离物(h173)或绵羊分离物(h175)的膜制剂分离出一种大约100,000分子量的占优势的受体蛋白质。这种蛋白质与在其它细菌病原体(18,27,30,31)中发现的具有相似大小的受体蛋白质类似，它通常称作运铁蛋白结合蛋白1(Tbp1)。另一种名称TbpA被推荐使用，以便与现有命名惯例相一致(21)。
第二种大约60,000分子量的蛋白质利用牛分离物(h44)膜在通过反刍动物运铁蛋白(泳道B,C和D)亲和层析分离的样品中也很明显。这种蛋白质可与从其它病原细菌物种(18,27,30,31)分离的更低的分子量的受体蛋白质，即运铁蛋白结合蛋白2(Tbp2)相比较。对于上面暗示的理由，已经推荐为另一个名称(TbpB)。这一分子量的蛋白质在从公山羊分离物(h173)和绵羊分离物(h175)获得的大多数样品中也是可以检测的，但是这一组分的存在和产率对分离条件很敏感。在这些物种中所观察的相对TbpA(Tbp1)的TbpB(Tbp2)典型低产率不是细菌受体蛋白的一般性质，并且甚至反映相关物种TbpB的共同性质。
当马运铁蛋白-琼脂糖凝胶用于亲和性分离方法时，蛋白质全都不能分离(泳道E)，具体地说，这表明它们的分离是因为反刍动物运铁蛋白的存在。在亲和性分离方法中，当利用更不严格的洗涤条件时，当利用来自牛(h44)，公山羊(h173)或绵羊(h175)分离物的膜时，大约38,000和70,000分子量的附加蛋白质由亲和性柱(泳道A)保留。一种大约77,000分子量的附加蛋白质在用牛分离物膜所获得的样品中也很明显。受体蛋白质的免疫学性质比较。
牛、公山羊和绵羊运铁蛋白竞争相同受体的观察结果表明至少在受体结合区域是保守的。为了确定共同免疫学表位的存在上是否也具有相似性，制备抗一种菌株纯化的受体蛋白质的抗血清以估计它们与来自其它分离物的受体蛋白质的交叉反应性。TbpA和TbpB的亲和性纯化制品从菌株h44中获得(参见方法部分)，并且用于在兔中产生单特异性抗血清。然后，试验这些抗血清对不同血清型代表菌株分离物的受体蛋白质(包括牛，绵羊和山羊的分离物)的作用。图18中A组的结果说明抗-TbpB抗血清与大约60,000分子量(TbpB)的蛋白质强烈反应，后者是由所有代表菌株的bTf-琼脂糖凝胶亲和性分离的。类似地，抗-TbpA抗血清与分离自所有七个代表菌株的TbpA进行交叉反应(图16,B组)。对反刍动物分离物(表2)的附加血清型的进一步分析继续显示与两种受体蛋白质相当大的交叉反应性(未显示数据)。这些数据表明两种受体蛋白质在牛、绵羊和山羊中引起肺巴斯德氏菌病的溶血巴斯德氏菌的不同血清型中都是保守的。
虽然图18中说明的免疫学交叉反应表明在来自不同物种的受体蛋白质中具有保守表位，但没有指出任何这些表位是否在细菌表面，在表面上它们能作为宿主免疫效应物机制的有效靶。为了说明这一点，将固相结合分析用来估计抗受体抗体被完整细胞的结合。这一分析显示当检验牛A1型分离物时，铁-缺乏而不是铁-充足条件下所生长的细胞具有强的结合能力(数据未显示)。当检验对不同血清型绵羊分离物的选择时，具有不同程度的反应性(图19)。溶血巴斯德氏菌菌株A类型的其它血清型(h98和h105，图19)显示了与抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的相当大反应性。相反地，T-型菌株(海藻巴斯德氏菌h99,h100和h106)显示出仅仅对两种抗-受体抗血清很弱的反应性。然而，标记bTf也具有弱结合性的事实表明在这一实验中所用铁-缺乏生长条件下限制了受体蛋白质的生产。这样，缺乏抗-受体抗血清的反应性不能归因于在这些物种的受体蛋白质中缺乏外露的交叉反应性表位。
实施例3A1型菌株的运铁蛋白受体基因的克隆。
下列材料与方法用于本实施例所述的研究中材料和方法细菌、质粒、噬菌体和培养条件。溶血巴斯德氏菌和大肠杆菌菌株来自发明人实验室保藏处。已经描述了在pBR322中的溶血巴斯德氏菌A1 DNA的质粒克隆库(Lo等，1985)。从G.Weinstock获得包含溶血巴斯德氏菌A1 DNA的第1克隆库。溶血巴斯德氏菌A1菌株H196来自兽医传染病组织(VIDO,Saskatoon,Saskatchewan，加拿大)。所有细菌菌株贮存在-70℃30％甘油中。将冰冻分离物划线到巧克力(溶血巴斯德氏菌)或Luria-Bertani加抗生素(大肠杆菌)琼脂平板上，并且在5％CO2中37℃下温箱里温育。
PCR扩增。根据制造商说明在应用生物系统模型390E合成仪上合成PCR引物并且进行纯化。利用推荐的PCR共反应物与Taq DNA聚合酶在Perkin-Elmer Cetus 480热循环仪上在薄壁500ml试管中进行PCR。PCR条件包括95℃2分钟，随后分别在95℃(1分钟)、52℃(1分钟)和72℃(2分钟)下变性、退火和延伸30个循环。在每个PCR循环中包括不含有模板DNA的阴性对照。
基因组中tbp区域的作图。用许多限制酶消化来自溶血巴斯德氏菌A1的基因组DNA，由琼脂糖凝胶电泳进行分离，印迹在硝酸纤维素膜并且与对上述tbpA或tbpB的不同区域有特异性的DNA探针杂交。比较限制性酶切图与从重组体质粒以及测序的区域获得的图谱，以便确定tbp基因的正确位置。
运铁蛋白和衍生物的制备。从西格玛获得牛运铁蛋白(bTf)。采用在其它地方描述的方法(Mazurier和Spik,1980)产生bTf的apo-型。简言之，bTf用0.1M乙酸钠，0.1M磷酸钠，25mM EDTA 溶解成0.5-1.0％的浓度，并且通过加入浓冰乙酸调至(pH5.5)。将溶液在4℃下平衡一夜，并且利用以乙酸钠/磷酸钠低pH缓冲液平衡的丙烯酰胺凝胶柱除去铁。利用以50mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的丙烯酰胺凝胶柱交换低pH缓冲液。最后，利用Amicon滤器浓缩蛋白质。如所述产生bTf的N-和C-端衍生物(Yu和Schryvers,1994)。简言之，80mg ConA纯化的bTf在室温下利用2mg蛋白酶K在40ml 0.1M Tris-HCl(pH8.2),25mM CaCl2中消化20小时。为了停止反应，将苯甲基磺酰氟(PMSF)加至0.1 mg/ml。将5ml浓缩制剂加到以50mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的葡聚糖凝胶G-100柱上，使N-片段和C-片段组分对50mM乙酸钠(pH6.9),1mM CaCl2,1mMMgCl2,1mM MnCl2透析，并且加到ConA-琼脂糖凝胶柱(结合bTf的糖基化C-片段但不结合bTf的N-片段)上。将用刚描述的缓冲液洗涤柱的洗脱液作为包含N-片段的组分保持。利用包含0.2M甲基-a-D-甘露吡喃糖苷的相同缓冲液洗脱包含C-片段的组分。C-片段和N-片段组分都以50mM Tris-HCl(pH8.0)进行透析，由超滤进行浓缩，并且以等份样在70℃下冻结。
重组体受体蛋白质的表达。携带适当重组质粒的大肠杆菌菌株(对于TbpB为DH5αF/pCRIIPHtbpB，对于TbpA为DH5αF/pCRIIPHtbpA)用于接种包含0.2％的麦芽糖和150 mg/ml氨苄青霉素的50ml LB-肉汤起子培养物。在37℃生长几小时后，培养物用于接种1升同样的培养基使起始OD600为0.05。一旦OD600达到0.4，就添加葡萄糖至4mg/ml并且培养至OD600为0.7-0.8为止。此时，添加10mM的MgSO4和100ml 1010pfu/ml的CE61噬菌体悬液。细胞培养物另外在37℃下温育2小时，然后通过离心收获。将细胞沉淀重悬于5ml冰冷的50mM Tris-HCl pH8.0,1MNaCl中，供亲和性分离，SDS-PAGE以及Western免疫印迹分析。
运铁蛋白结合蛋白的亲和分离和分析方法。根据制造商说明利用包含3.5 mg/ml的铁-饱和bTf的溶液将牛运铁蛋白连接到CNBr-激活琼脂糖凝胶4B(Pharmacia)上。通过添加乙醇胺封闭激活基团。用包含6.0M盐酸胍的10至20倍柱体积的50mM TrisHCl,1M NaCl,pH8.0缓冲液洗涤除去非结合运铁蛋白。进一步用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤之后，结合运铁蛋白用在0.1M柠檬酸钠/0.1M NaHCO3(pH8.6)中包含5mg/mlFeCl3的溶液与铁一起重新装上。再次用50mM Tris-HCl(pH8.0)洗涤之后，在进行亲和性实验之前，用50mM Tris-HCl(pH8.0)，1M NaCl预平衡bTf-琼脂糖凝胶树脂，将在50mM Tris-HCl(pH8.0)/1M NaCl中重悬浮的包含重组质粒的大肠杆菌细胞溶解到20mM EDTA,2％Sarkosyl中，并且在室温下温育2小时。混合液在8,000rpm下离心15分钟(4℃)，同时细心地倒出包含溶解受体的上清液。上清液用50mM HCl(pH8.0)，1MNaCl缓冲液稀释4次，并且在室温下与过量(1mg/ml)的以相同缓冲液稀释的每种下列运铁蛋白一起预温育30分钟载铁bTf，山羊或公山羊运铁蛋白(cTf)，绵羊运铁蛋白(oTf)，以及人运铁蛋白(hTf)；apo-bTf；C-片段bTf和N-片段bTf。仅仅在阳性对照实验中添加缓冲液。在预温育之后，将上清液加到以50mM Tris-HCl(pH8.0),1M NaCl预平衡和在室温下温育15分钟的bTf琼脂糖凝胶柱上。每柱至少以12倍柱体积的50mMTris-HCl(pH8.0),1M NaCl,10mM EDTA,0.5％十二烷基肌氨酸钠，接着以10倍柱体积的仅包含0.05％十二烷基肌氨酸钠的溶液充分洗涤，以除去非特异性结合的蛋白质。最后用50mM Tris-HCl(pH8.0),0.5MNaCl进行洗涤。
在非还原条件和没有煮沸下运用1倍柱床体积的2×SDS-PAGE样品缓冲液完成重组TbpB的洗脱。在微量离心机中13,000×g下离心包含树脂的混合物5分钟后收集每种洗脱剂(上清液)。每种上清液(洗脱剂)的等份样进一步进行SDS-PAGE，同时电印迹到Immobilon PVDF(Millipore)膜上(在20mM Tris,pH7.5,150mM甘氨酸，20％甲醇以及0.1％SDS中15V下一整夜)。膜在室温下在20mM Tris(pH7.5),500mM NaCl(TBS)中用0.5％脱脂牛奶封闭30分钟。在1小时内，把抗-TbpB血清在封闭溶液中的1/1,000稀释液涂到膜上，其后都在TBS中经过两个10-分钟洗涤涤。使第二抗体(山羊抗-兔IgC-辣根过氧化物酶缀合物)的1/3000稀释液在37℃下结合1小时。在TBS中经过三个10分钟的洗涤除去缀合物，并且用HRP-底物混合物(氯代苯酚/过氧化氢)显影。
N端氨基酸序列分析。将来自H196的亲和纯化和依次洗脱的TbpA和TbpB样品进行SDS-PAGE，在PVDF(Immobilon-P,MilliporeIPVH00010)膜上进行电印迹，以考马斯蓝简短染色，并且从膜上切去包含个体蛋白质区带的带用于N端氨基酸序列分析。
抗-TbpA和抗-TbpB单特异性兔血清的制备。将在亲和性方法中从适当组分获得的大约500mg溶血巴斯德氏菌菌株H44的纯化的TbpA和TbpB，在透析和浓缩后与弗氏完全佐剂混合，并且分别肌内注射两只白色雌性新西兰兔。兔在3周间隔内以相同剂量的加弗氏不完全佐剂的抗原加强免疫两次。最后加强两周后，收集血液，在点印迹装置中利用点分析确定各自抗原的血清滴度。兔要么进一步加强免疫(如果滴度不令人满意)，要么最终放血(如果滴度令人满意)。利用与HRP缀合的山羊抗-兔IgG作为第二抗体通过SDS-PACE和Western免疫印迹分析检查对来自H44的TbpA和TbpB的血清的特异性。预期TbpA和TbpB抗血清都能分别与来自菌株H196的TbpA和TbpB进行交叉反应。
核苷酸序列分析。tbp区域测序采取两个不同的策略。一种方法主要包括亚克隆重组质粒的片段进入M13载体，然后利用载体引物对通过双脱氧链终止法制备的随后分离的单链DNA进行测序。在有限数量的情况下，基于克隆插入物所形成的序列合成寡核苷酸引物，并且将这些引物用于完成克隆插入序列。在这个分析中，用Pustell程序(IBI)编排和分析核苷酸序列。
另一种方法主要包括由PCR扩增从染色体DNA获得的克隆插入物的连续序列测定。在前面序列分析基础上合成寡核苷酸引物。将PCR扩增产物克隆到pCRⅡ克隆载体(Invitrogen)中。利用合成寡核苷酸，荧光染料标记的双脱氢核苷酸三磷酸终止子通过寡核苷酸引物直接方法采用纯化重组体质粒进行双链DNA测序，并用Taq聚合酶循环测序。在应用生物系统(ABI)373A型自动荧光测序仪上分析序列反应产物。比较来自连续测序的运行结果，同时利用SeqEd程序通过比较层析谱确定出复合序列。这一序列随后与利用Mac-DNASIS程序通过单链测序获得的序列比较。此外，通过将所有三种读框中的预测的蛋白质序列与几个不同物种的Tbp的序列比较分析所说的序列。任何通过这种分析鉴别的不确定度区域应重复进行序列分析。结果克隆运铁蛋白受体基因。获得抗-受体抗血清和N端氨基酸序列，以便利于克隆溶血巴斯德氏菌运铁蛋白受体基因。通过用溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株(H44)的亲和性纯化受体蛋白质TbpA和TbpB免疫兔获得单特异性抗血清。纯化的天然H196 TbpA的电印迹制剂的氨基酸序列分析产生出20个氨基酸的一种可读序列(图20的顶端)。一种用纯化的TbpB进行的类似分析不能提供说明可能封闭这一蛋白质N末端的任何序列信息。
纯化TbpA的头八个氨基酸的序列，用于设计以溶血巴斯德氏菌优选密码子用法表(tbpA引物023，表4)为基础的寡核苷酸引物。对于来自溶血巴斯德氏菌质粒库(Lo等，1985)的部分tbpA基因的聚合酶链反应(PCR)扩增，这一引物用来与两种载体引物(RL2和RL3，表4)的任何一种相结合。由于预料的氨基酸包含与N端氨基酸序列相同的序列，并且显示与其它TbpA蛋白质的同源性，所以用载体引物RL2和023获得800 bp PCR产物，同时通过序列分析检验它的可靠性。克隆PCR产物用作限制内切酶消化的H196溶血巴斯德氏菌染色体DNA Southern分析和质粒库筛选的杂交探针。Southern分析提供了tbp区域染色体DNA的限制性酶切图，供比较从质粒库获得的克隆插入物。
表4寡核苷酸引物引物编号描述(基因/区域-位置) 方向*序列023 tbpA-5末端，第1个8N端aa’s5’-3’ GGAAGCTTACTGAAAATAAAAAAATCGAAGAA088 tbpA-5末端， 3’-5’*CACTACTTTCCCCAAGCCAGRL2 pBR322-BamHⅠ位点的上游 3’-5’*GGAATTCCCTCCTGTGGATC198 tbpA-3’末端 3’-5’*GCIGCII(G/C)IGCICGIAA(T/C)T(T/A)(T/C)190 tbpB-5’末端，前导肽区5’-3’ CAAAGCTTGCTTG(TC)TCIGGIGG352 tbpB-5’末端的上游5’-3’ AGATCTG-GATTCTAAATCAGACCGCTTGTATITTAG192 tbpB-邻近3’末端的保守aa序列 5’-3’ GTI(T/A)(A/G/C)IGGIGGITT(C/T)TA(T/C)GG401 tbpB-5’末端 5’-3’ TAAATTAAAGGAGACATTATGTTTAAACT350 tbpB-3’末端，侧翼NcoⅠ位点 3’-5’*CGACGCCCATGGTTATTTTTATTTGACGTGTTTTCC199 tbpB-3’末端，侧翼 HindⅢ位点 3’-5’*GCGCAAGCTTTTATTTTTCTATTTGACG349 tbpA-5’末端，rbs上游的 5’-3’ GGATTCAGATCTTAAAGGAGACCCTATCTAATGATAATGBamH1/BgⅢ位点255 tbpA-5’末端，起始密码子NdeⅠ位点5’-3’ CCCTATCATATGATAATGAAATATCATC256tbpA-3’末端，终止密码子后的HindⅢ位点3’-5’*TAGCGCAAGCTTCTAAAACTTCATTTCAAAT*相对于有关基因编码链的取向的方向。
最初，从大肠杆菌克隆鉴别出两个强杂交菌落。质粒P**(克隆9)包含9kb插入物(包括具有邻近下游区的大多数tbpA基因)但不与来自另一个染色体基因座的DNA融合(图20中的fis)。第二种质粒，P**(克隆10)，仅仅包含1.2 kb的插入物，该插入物主要位于tbpA基因的5末端周围。
在质粒pRYCL9中人工连接使人想起了所观察的类似的人工制品，当试图克隆脑膜炎球菌tbpB基因并且遇到困难(23)时，将考虑对于克隆溶血巴斯德氏菌TbpB区的另一些策略。一种策略是以观察在其它物种中，tbpB基因定位在tbpA基因的上游(19,20,23)以及在各自TbpB预料的序列中具有氨基酸的短的骨架等同性为基础的。邻近TbpB羧基末端的氨基酸保守序列用来设计简并寡核苷酸引物(引物192，表4)以获得TbpA基因的其余部分，基因间区域和tbpB基因的3’末端的部分。这种引物用于与以来自tbpA基因的5’末端的序列为基础的引物(引物088，表4)相结合以便扩增来自H196染色体DNA的700 bp片段。这种插入物的序列能够设计以tbpB基因3’末端的真实序列为基础的寡核苷酸引物(引物199，表4)，用于与用于PCR扩增的基于已知TbpB(oligo 190，表4)的前导肽区中的保守氨基酸序列的简并寡核苷酸相结合。当H196染色体DNA用作模板时所获得的2.4 kb PCR产物包含tbpB基因真实3’末端。当这种PCR片段是在pCRⅡ载体中克隆并且用于利用T7启动子的表达实验时，产生一个完整的重组体TbpB，这表明核糖体结合位点和tbpB基因的起点包含在插入物之中。
第二种策略利用锚定的PCR，其中PstⅠ-消化的pBluescript质粒连接到PstⅠ-消化的H196染色体DNA上，并且用作PCR反应的模板，其中利用tbpB基因的3’末端引物(oligo 190，表4)和载体的M13反向引物。所得3.5 kb产物亚克隆进入PCRⅡ载体，产生包含整个tbpB基因和邻近上游区相当大数量的质粒(图20中的ORF和RNaseT)。
进一步亚克隆tbp基因进入表达载体涉及采用互补于基因的5＇和3＇末端与包含适当的限制酶切位点的寡核苷酸引物的PCR扩增。用于扩增tbpA基因的一套引物(引物349和256，表4)涉及就在预料核糖体结合位点上游(rbs)引入BamHⅠ和BglⅡ位点，以使外源启动子因为天然rbs的存在引起表达。另一种5＇引物牵涉到在起始密码子位点引入NdeⅠ位点(255，表4)，以便克隆到pT7-7表达载体(其供给适当位置的核糖体结合位点)是可能的。因为表达实验在tbpB基因起始的明确鉴定之前，亚克隆tbpB基因通过采用上游测序引物(引物352，表4)以及包含NcoⅠ位点分开的真实3＇末端的引物(引物350，表4)的PCR扩增而获得。
运铁蛋白受体基因的特征。如图20所说明的，tbp基因看来似乎在操纵子排列中，具有定位在tbpA基因的上游的tbpB基因。比较序列分析揭示了tbpB基因之前是编码蛋白质的开放读框(ORF)，所述蛋白的序列与来自大肠杆菌和流感嗜血菌的RNaseT具有高度相同性。这一ORF依次位于编码与在流感嗜血菌和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中鉴别的假设蛋白质具有相当大的等同性的蛋白质的另一个ORF之前。tbpA基因的下游是编码蛋白质的ORF，该蛋白的序列与来自流感嗜血菌和大肠杆菌的倒位因子刺激(FIS蛋白质-重组增强子)蛋白质具有70％的相同性。这为运铁蛋白受体蛋白质基因操纵子有效地划分了界线，并且表明没有涉及这种铁获取途径的直接邻近的基因。
在编码RNaseT同系物的ORF末端和tbpB基因的起始端之间具有420bp的区域，在最后62碱基对之内具有潜在的核糖体结合位点，启动子位点以及调节位点(图20)。余下的358 bp间插区可能大概包含RNaseT基因转录终止信号，和潜在地牵涉tbp操纵子调节的序列。对于大肠杆菌s70-35和-10启动子区，推定的启动子区分别含有5/6和6/6共有碱基。
以前的研究曾显示在培养基中的可供使用的铁的水平调节溶血巴斯德氏菌运铁蛋白受体蛋白质的表达(26)。重叠tbpB启动子(图20)的-10位点的推定的Fur盒的鉴定表明可能是在溶血巴斯德氏菌中的转录水平上通过Fur同系物的作用来进行铁调节。推定的Fur盒与大肠杆菌Fur结合位点共有序列具有12/19碱基的相同性(Litwin和Caldenuood,1993)。
在tbpB和tbpA基因之间具有96 bp基因间区域，它在tbpA基因上游含有推定的核糖体结合位点但是没有明显的启动子。此外，在这一区域中没有任何明显的转录终止子。tbpA基因终止密码子以及编码FIS同系物的基因终止密码子的下游是没有明显转录终止子的98 bp的区域。
血清型A1溶血巴斯德氏菌菌株H196的tbpA基因区序列分析揭示鳊码具有预测分子量106,921 Da的蛋白质的2,790 bp ORF(图22)。通过与成熟蛋白质的已知N端氨基酸序列比较确认(图22的顶端)在28位残基的推定的信号肽酶切割位点。将TbpA的预测的氨基酸序列与脑膜炎萘瑟氏球菌(23)、淋病萘瑟氏球菌(8)、流感嗜血菌(20)和朋膜肺炎放线杆菌(19)的TbpA序列比较。将这些蛋白质(粗下划线氨基酸，图22)之间的相同氨基酸的定位与以Tommassen预料的模型为基础的这些氨基酸区段的提出的拓扑结构(28)比较。明显的是，大多数相同的氨基酸在对应于短的跨膜β-折叠的区或与跨膜片段直接邻近的内部和外部的环区段中簇集。注意到在提出的外部环4,6和7中有半胱氨酸的保守对并且在溶血巴斯德氏菌TbpA的环10上有唯一的半胱氨酸对是有意义的。这些很可能代表二硫键为外环提供结构稳定性。
血清型A1溶血巴斯德氏菌菌株H196的tbpB基因中的序列分析揭示了鳊码具有预测分子量63,419 Da的蛋白质的1,752 bpORF(图23)。将TbpB的这种预测的蛋白质序列与脑膜炎萘瑟氏球菌(23)、淋病萘瑟氏球菌(1)、流感嗜血菌(20)和胸膜肺炎放线杆菌(14)的TbpB的出版的序列比较。这一预测的氨基酸序列包括18个氨基酸的前导肽，以半胱氨酸为成熟蛋白质的预测的N端氨基酸的信号肽酶Ⅱ识别序列。N端半胱氨酸的存在(显示了在其它物种中已经脂化(14,24))可以解释这种蛋白质不能获得N端氨基酸序列，并且可以用作向外膜锚定蛋白质的主要手段。近来由Gerlach等(36)确定的与胸膜肺炎放线杆菌TbpB(TfbA)推定结合区对比的区域被双下划线显示。
明显的是，在整个氨基酸序列长度中发现了几个具有同源性的区域，包括相同氨基酸的几个短的骨架(图24)。在进行密切检查时，明显的是，在蛋白质的N端与C端部分的区域之间有一些同源性，表明可能有蛋白质的下划线的双片段结构，与运铁蛋白所观察到的有相似性。这样，序列YKGYW(aa 185-189)和YRGTW(aa 449-453),FTADFANK(aa 237-244)和FDVDFVNK(aa 480-487),GNRFSG(aa 276-281)和GNGFGG(aa 513-518)，以及LEGGFFG(aa 300-306)和FECGFYG(aa 546-552)代表了在蛋白质的N端与C端部分的等同位置中同源氨基酸的连续骨架。
重组体受体蛋白质的表达和分析。从H196染色体DNA PCR扩增完整的tbpB与tbpA基因并且亚克隆进用于重组蛋白质产生的表达载体。就tbpB基因表达的初始的尝试来说，亚克隆tbpB基因是通过采用上游引物(352，表4)以及包含侧翼于NcoⅠ位点的真实3末端的引物(350，表4)由PCR扩增获得的。当PCR扩增片段亚克隆进pCRⅡ载体时，最终形成的五个克隆都有相同的取向；T7启动子的下游和lac启动子的相反方向。由于lac启动子在高拷贝数载体中不是紧密调节的，这一结果表明插入物在大肠杆菌中的表达可以选择。一旦这一区的序列可供使用，那么很明显引物352就在RNaseT基因上游，同时这个基因或tbpB基因的表达都应对选择性压力起作用。以CE6λ噬菌体感染来完成来自T7启动子的TbpB的表达，所说噬菌体编码T7 RNA聚合酶。在感染两小时之后对于TbpB预测分子量的蛋白质是明显的，同时这一蛋白质在电印迹之后与抗-TbpB抗血清进行反应。
通过表达TbpB蛋白质的固定化完整细胞可以检测对标记牛运铁蛋白(bTf)的结合，这个水平上的结合不能明显地由细胞的预超声处理增加(数据未显示)。虽然这可以解释为在异源大肠杆菌系统中适当的加工和TbpB蛋白向细胞表面输出，但通过外源蛋白抗原的过量表达破坏外膜完整性同样是一种似乎可能的解释。初步结合研究表明产生了一种功能性TbpB蛋白质，这表明进一步分析或许能够估计这一蛋白质的功能性性质，并且可以确定它对天然受体复合物的以前特征化的性质的贡献。这样，从表达TbpB的细胞中制备粗制膜，并且用于设计来估计它的结合特性的亲和性分离实验中。这些实验表明重组TbpB能够由固定化的bTf亲和性分离，同时过量的牛，绵羊或公山羊Tf能够抑制这一分离，说明其具有有效地结合到所有这三种反刍动物Tfs上的能力。人运铁蛋白以及apo-bTf不能抑制重组TbpB通过固定化载铁的bTf的亲和性分离。这一分析也揭示了bTf的N-片段和C-片段都能有效地抑制重组TbpB结合到固定化的bTf上。
为了表达tbpA基因，用一套保留预测的核糖体结合位点(图21)的引物(寡核苷酸349和256，表4)完成PCR扩增。在亚克隆PCR产物进pCRⅡ载体之后，用CE6噬菌体(编码T7 RNA聚合酶)感染后没有重组TbpA表达。一个克隆的序列分析揭示切除几个碱基对，其除去了核糖体结合位点。其它利用255和256引物(参见表4)试图亚克隆来自PCR的tbpA基因进pT7-7载体(提供了一个理想位置的核糖体结合位点)的NdeⅠ位点是失败的。
讨论在说明溶血巴斯德氏菌中运铁蛋白受体存在的初始研究(26)中，用亲和性方法仅仅分离出一种单一受体蛋白质(TbpA)，而在其它物种中产生两种受体蛋白质(TbpA和TbpB)(32)。这种受体蛋白质最初假定为很大程度上介导利用来自牛运铁蛋白的供生长的铁的能力(26)和结合反刍动物运铁蛋白(39)的特异性。在尔后的研究中，显示牛运铁蛋白的结合区域定位到C-片段上(41)，用一种改进的亲和性方法分离到两种受体蛋白质(TbpA和TbpB)，虽然TbpA的产率大大地超过TbpB。这样，把该受体的观察到的结合特性断然归因于任一受体蛋白质(以及特别是不归因于TbpB)是不可能的。
tbp基因的克隆与重组TbpB的表达能够估计它的特异性结合特征。这些研究曾显示TbpB与天然受体复合物(TbpA和TbpB)具有一种类似的宿主特异性，由于它特异性结合几个反刍动物物种Tfs。相对地，不同于天然受体复合物，重组TbpB能够识别在bTf的N-片段和C-片段上的结合决定族，表明在以前的研究(Yu和Schryvers,1994)中，TbpA和TbpB之间的相互作用也可以影响TbpB结合到bTf的N-片段上的能力。
在溶血巴斯德氏菌固定化膜(TbpA和TbpB)的竞争性结合分析中，对于bTf的载铁或apo形式没有任何明显的优先选择(30)，这类似于在大多数其它细菌物种中观察到的(Blanton等，1990；32；Tsai等，1988；32,37)，除粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)以外(Yu和Schryvers,1993)。在本研究中，重组TbpB对bTf的载铁形式明显地显示出一种强的优先选择。在增加体内铁获取的效率中，TbpB的这种优先选择与功能有关。
实施例4重组Tbp2和真实Tbp1的疫苗潜力由于下列原因，运铁蛋白结合蛋白Tbp1与Tbp2是具有吸引力的目标a)由于对细菌生存来说，运铁蛋白的铁的获得可能是十分重要的，对这些抗原的抗体应答应该是保护性的。
b)不同溶血巴斯德氏菌A1分离物内的编码Tbp1与Tbp2基因看来很保守。
本研究在实验性溶血巴斯德氏菌攻击模型中用于单独以及组合检验重组Tbp2和真实Tbp1的疫苗潜力。方法利用本文描述的标准技术通过亲和性层析进行亲和纯化分别来自溶血巴斯德氏菌和重组大肠杆菌外膜的Tbp1与Tbp2蛋白质。利用专用矿物油基佐剂(VSA3)配制疫苗，以使每一剂量为包含下列量的每一抗原的2ccTbp2-45 mg；单独利用时Tbp1-85mg或与Tbp2结合时Tbp1 100mg。此外，制备的安慰剂疫苗包含替代抗原的无菌稀释剂。包括在试验中的五个组包括一个在攻击前十天接受Tbp2激发的单一免疫的组以及接受用Tbp2,Tbp1+Tbp2，安慰剂，或Tbp1两次免疫的组。初次和第二次免疫之间的间隔是三周，在Southern Saskatchewan的农场上进行所有接种。疫苗通过皮下途径用药。大约攻击前十天，将动物运送至Saskatoon，并且收容在VIDO研究站。除了接收Tbp1的以外(包含六只动物)，所有的组包含十只动物。接受Tbp1的组没有遵循原计划，而且增加以便确定Tbp1自身的保护能力。此外，一只接受以Tbp2制剂一次免疫的小牛显示出与接种不相关的疾病临床征兆，并且因此排除在试验外。表5中总结疫苗组的组合。
表5．疫苗组的组合疫苗组抗原 免疫动物/组1 Tbp2一 92 Tbp2二 103 Tbp1和Tbp2 二 104 安慰剂 二 105 Tbp1二 6小牛经过气溶胶途径激发，首先将它们暴露在包含大约2.5×106PFU/ml的牛疱疹病毒-1菌株108的悬液中，接着在4天后用含大约5×108CFU/ml的巴斯德氏菌的气溶胶处理。由兽医和动物保键技术员每日检查动物，同时记录下列数据体重，温度，鼻伤痕，抑郁，力量，呼吸窘迫和疾病。每个这样的参数(除重量和温度外)划分为0-4级。
利用酶连免疫吸附剂测定(ELISA)测量对接种的血清学反应。血清样品收集的时间是初次和第二次免疫时间再加上用BHV-1进行攻击的天数。滴度以血清稀度的倒数表示，其导致等同于背景加两标准偏差的光密度。测量对Tbp1,Tbp2和溶血巴斯德氏菌白细胞毒素(leukotoxin)的反应。后者作为一种诊断检验法被包括进来以确定动物是否曾天然接触所说的有机体。
结果a)接种反应没有动物显示出对用任何配方接种的不利的反应。利用ELISA方法(测量对Tbp1,Tbp2和溶血巴斯德氏菌白细胞毒素的血清抗体水平)确定对接种的血清学反应。包括后一抗原以保证没有动物由于与细菌的天然接触而增加滴度。表6中显示了对每种抗原的滴度，同时可以看到对白细胞毒素的滴度在初次接种(血1)，第二次接种(血2)时，以及在激发时(血3)是可比较的。滴度低于3,000的动物认为是干净的。有趣的是，没有动物对Tbp1抗原明显程度的阳转。以发明人经验，预期用来自其它有机体的Tbp1，滴度应该低一点，但是未曾预料到的是，在抗体水平上不能检测其显著增加。所有接受Tbp2的组很好地对接种作出反应，虽然接受Tbp1+2的组具有的滴度大约是Tbp2组滴度的1/2，这一区别是不显著的。
表6．对接种的血清学反应ELISA抗原接种组 滴度-血1滴度-血2滴度-血3白细胞毒素 Tbp2(1个剂量) 101013502156Tbp2 113615472656Tbp1和2115912391137安慰剂 168818342782Tbp1 980 12821339Tbp1 Tbp2(1个剂量) 113 364 229Tbp2 203 206 296Tbp1和2150 388 367安慰剂 140 130 226Tbp1 57 55 139Tbp2 Tbp2(1个剂量) 408 639 9871Tbp2 397 12154 66697Tbp1和2119 783827515安慰剂 360 269 378Tbp1 359 433433 478利用在第一次免疫时(血1)，第二次免疫时(血2)，以及用牛疱疹病毒-1激发的那一天(血3)采取的血清样品测定对白细胞毒素、Tbp1和Tbp2的ELISA滴度。数量以等于一个阴性对照加上两标准偏差的稀释度的倒数表示。
b)死亡率实验疾病模型予以校准以便在正常条件下获得60-70％死亡率。然而，死亡率在这一试验中比一般的高，可能由于动物在激发后的整个期间放置在极端冷的温度下。日低温在-40℃范围内，同时所有动物在试验期间放置在户外。表7显示了组死亡率，并且仅有接受Tbp1和Tbp2的组显示出显著性保护。这与Tbp2本身50％的死亡率和Tbp1 100％的死亡率形成对比。用Tbp1的单一免疫不具有任何作用。
表7．试验期观察的组死亡率。
接种组 死亡率(％)Tbp2(1个剂量)78Tbp2 50Tbp1和2 10安慰剂 90Tbp1 100c)疾病临床征兆表8中分组总结了临床结果。应该注意，表8含有试验所有天的临床结果，包括那些在第四天溶血巴斯德氏菌感染前的那些。因此，仅仅从第4-10天的结果用来决定疫苗配方的保护能力。在这一试验期间所观察的高死亡率具有降低各组的大小至某一点的作用，在该点上所有测定的临床参数中观察到的不同不具有统计学显著性。然而，很明显同时接受Tbp1和Tbp2的组显示在大多数种类中第5和7天之间的分数较低。虽然在幸存者中它们不如组合组，然而单独地接受Tbp2两次免疫的组显示了降低的疾病临床征兆。目前还不清楚Tbp1对保护作用的贡献，这是因为没有出现对这一抗原的任何抗体应答。
d)Postmortem结果在死于试验期间的动物上进行尸检(Necropsies)。在所有情况中，培养来自肺脏的溶血巴斯德氏菌，并且所观察的病理学与溶血巴斯德氏菌引起的纤维性肺炎相一致。结论两次包含溶血巴斯德氏菌Tbp1和Tbp2的配方的接种提供了抵抗实验性牛肺巴斯德氏菌病的明显保护作用。由于不出现对Tbp1蛋白质的任何血清学应答，Tbp1对这一保护作用的确切贡献还不清楚。有益的作用可能是因为细胞介导的免疫应答。
Tbp2两个剂量的免疫提供某种程度的保护作用，通过试验包含更大量的抗原或不同佐剂的疫苗配方增加这种作用是可能的。对Tbp2的免疫学应答给出用组合疫苗所见的大部分保护作用是很可能的。
Tbp2一个剂量的或Tbp1两个剂量的接种在实验性激发之后，没有任何有益的作用。
表8分组平均临床得分，在第0天用BHV-1和第4天用溶血巴斯德氏菌激发动物平均重量(kg)组第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天 第8天 第9天第10天Tbp2(1个剂量) 232.4231.6228.1225.9222.9223.1223.6225.7256.0256.0256.0Tbp2 211.4209.3205.3202.4201.2181.5197.3195.5198.8197.7197.2Tbp1＆2 217.8218.1216.0212.9211.2208.8207.5208.3207.7207.8208.3pacabo223.1221.2215.7213.8206.5206 2194.4177.0158.0161.0158.0Tbp1 225.3225.8219.8216.7212.7208.2200.0183.0191.0190.0N/A平均温度组第0天第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天第8天第9天第10天Tbp2(1个剂量) 39.0638.9640.9240.5340.5340.0039.4039.5039.8538.8539.30Tbp2 39.0539.2640.2040.5040.4440.5140.1939.6739.8839.3339.10Tbp1＆2 39.1938.3640.1040.0040.2140.2039.4839.4939.1439.2639.48Placebo 39.0339.1040.3040.4140.8340.2439.9640.3539.5039.1040.70Tbp1 39.1538.7840.5240.1240.4740.8540.9541.6040.9041.00N/A平均鼻得分组第0天第1天 第2天第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.00 0.110.33 0.611.171.331.401.250.000.000.00Tbp2 0.00 0.050.30 0.851.201.451.561.440.830.330.20Tbp1＆2 0.00 0.100.45 0.601.051.700.901.000.700.330.44Placebo 0.00 0.150.35 0.951.101.781.401.501.000.000.00Tbp1 0.00 0.080.33 0.670.831.081.000.001.002.00N/A平均抑郁得分组第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.000.000.000.11 0.220.671.601.750.000.000.00Tbp2 0.000.000.150.15 0.000.500.891.670.671.330.40Tbp1＆2 0.000.000.000.00 0.000.601.201.100.600.330.56Placebo 0.000.000.050.15 0.601.332.202.001.000.000.00Tbp1 0.000.000.170.17 0.501.831.502.002.003.00N/A平均力量得分组第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.000.000.000.000.00 0.671.601.750.000.000.00Tbp2 0.000.000.000.000.00 0.400.781.670.501.000.40Tbp1＆2 0.000.000.000.000.00 0.300.501.100.600.220.11Placebo 0.000.000.000.000.00 0.671.601.501.000.000.00Tbp1 0.000.000.000.000.00 1.170.501.002.003.00N/A平均呼吸窘迫得分组第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.000.000.000.000.000.111.402.000.000.000.00Tbp2 0.000.000.000.000.000.100.441.220.330.670.00Tbp1＆2 0.000.000.000.000.000.000.300.400.500.110.11Placebo 0.000.000.000.000.000.671.001.000.000.000.00Tbp1 0.000.000.000.000.001.170.501.001.003.00N/A平均疾病得分组第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.000.000.560.780.890.892.002.250.000.000.00Tbp2 0.000.000.900.901.001.001.001.890.831.170.40Tbp1＆2 0.000.000.600.500.901.100.901.200.700.330.44Placebo 0.000.000.701.001.201.802.712.671.000.001.00Tbp1 0.000.000.830.501.002.832.753.002.004.00N/A累积死亡率组第0天 第1天 第2天 第3天第4天 第5天 第6天 第7天 第8天 第9天 第10天Tbp2(1个剂量) 0.000.000.000.000.000.000.440.780.780.780.78Tbp2 0.000.000.000.000.000.000.100.300.400.400.50Tbp1＆2 0.000.000.000.000.000.000.000.000.000.100.10Placebo 0.000.000.000.000.000.400.500.800.800.900.90Tbp1 0.000.000.000.000.000.330.670.870.830.831.00实施例5各种反刍动物血清型运铁蛋白受体的比较就结合反刍动物运铁蛋白和利用运铁蛋白铁供生长，分析一组分离自牛、绵羊和山羊的各种血清型溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株。研究的某些目的是确定来源于不同宿主物种的运铁蛋白受体的普遍性，以估价对不同反刍动物运铁蛋白的特异性，并确定来源于不同菌株(在牛中引起船热、在绵羊和山羊中引起肺炎和在羔羊中引起败血病)的所说表面受体之间是否存在抗原相关性。材料细菌菌株。用于本研究中的细菌菌株列于表9中。来源于患肺炎的牛的溶血巴斯德氏菌临床A1型分离物(h93-h97)(9)和代表性ATCC菌株(h98-h107)由Andrew Potter博士(VIDO,Saskatoon)提供。海藻巴斯德氏菌菌株h174是患有肺巴斯德氏菌病的山羊的场分离物，由FrankMilward博士(RhoneMerieux,Lyon，法国)提供。溶血巴斯德氏菌菌株h44是来源于患肺炎的牛的牛临床A1型分离物，以前已有描述(26)。菌株h196从Lo博士(Guelph大学，安大略，加拿大)获得。
表9细菌菌株，血清型和来源
生长条件。所有细菌菌株于-70℃冷冻贮存在30％的甘油中。将来源于冻结贮存的分离物划线到巧克力琼脂平板上，并于37℃在二氧化碳温箱中培养。通过在心脑输注肉汤(BH1,Difco实验室)或O’Reilly-Niven肉汤(25)中培养细菌获得铁-有限生长，所说的培养基补充有3.0 g/ml烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)，并且含有终浓度为100M的铁螯合剂乙二胺二羟苯基乙酸(EDDA，西格玛)。使用不同的运铁蛋白作为铁源的生长实验如前所述进行(26)。制备运铁蛋白和衍生物。牛运铁蛋白从西格玛获得。绵羊和公山羊(山羊)运铁蛋白的制备(2),30％或100％饱和的运铁蛋白的铁装载(Herrington等1985)，和辣根过氧化物酶(HRP)与运铁蛋白的缀合(37)基本上如前所述。在制备牛，绵羊和公山羊的运铁蛋白的缀合物(HRP-bTf,HRP-oTf和HRP-gTf)中，HRP和运铁蛋白的混合物在化学缀合之后进行凝胶过滤。收集显示最大活性的组分，透析，将等分样冻结并贮存在-70℃下。运铁蛋白结合测定。运铁蛋白的固相结合测定基本上如前所述进行(32)。在膜或浓缩的洗脱物点样到HA纸(Millipore公司，Bedford,MA)上和用0.5％脱脂奶封闭后，将所述纸暴露在含有450 ng/ml HRP-缀合的运铁蛋白的封闭溶液中。基本上按照如前所述(32)进行HRP底物混合物的温育、洗涤和显影。运铁蛋白结合蛋白的亲和性分离。根据制造商的说明，采用含有3.5mg/ml铁-饱和的运铁蛋白的溶液将牛、绵羊和公山羊的运铁蛋白分别连接到CNBr-活化的琼脂糖凝胶4B上。通过添加乙醇胺封闭活化的基团。经过用10-20倍柱体积的包含6.0M盐酸胍的50mM TrisHCl,1MNaCl(pH8.0)缓冲液洗涤除去未结合的运铁蛋白，并且在进一步洗涤后，采用在0.1M柠檬酸钠/0.1M NaHCO3(pH8.6)缓冲液中的含有5 mg/ml FeCl3的溶液用铁再装载结合的运铁蛋白。
按照如前所述(32)制备的溶血巴斯德氏菌或海藻巴斯德氏菌的铁-缺乏总膜(200mg蛋白质)用包含1.0 M NaCl的50mM Tris pH8.0稀释至2mg/ml。通过加入EDTA和sarkosyl分别至10mM和0.75％的终浓度，接着于室温在轻轻振荡下温育混合物15-30分钟使所稀释的膜溶解。在10,000rpm下离心溶液10分钟，以除去不溶解的碎片。将包含可溶性膜的上清液用到1.5×10cm运铁蛋白亲和性柱上，然后用含有1.0 M NaCl,10mM EDTA,0.75％Sarksosyl的50 mM Tris pH 8.0充分洗涤(至少10倍柱床体积)，以除去非特异性结合的蛋白质。在利用低盐洗涤条件的实验中，洗涤缓冲液包含替代1M NaCl的100mM NaCl。在一些实例中，用2-3倍柱床体积的包含0.2M盐酸胍的洗涤缓冲液另外洗涤对除去污染蛋白质是必需的。
通过使用2-3倍柱床体积的在含有1.0M NaCl,1mM EDTA,0.01％sarkosyl的50mM Tris pH8.0中的2.0M盐酸胍获得两种运铁蛋白结合蛋白(TbpA和TbpB)的共洗脱。收集洗脱剂供立即对50mM Tris pH8.0透析。以盐酸胍的更高的浓度进一步处理通常不引起任何受体蛋白质更高的产率。通过分别用2倍柱床体积的各种包含0.2,0.5,0.75,1.0,1.5,2.0和3.0盐酸胍的缓冲液依序洗脱达到单独的TbpA和TbpB的分离。将洗脱物对3次更换的3升50 mM Tris pH8.0透析18小时，并经超滤浓缩。在SDS-PAGE分析后，发现用0.5和0.75M盐酸胍洗脱缓冲液洗脱的组分仅含有TbpB，收集这些组分用作TbpB制剂，并收集1.5和2M盐酸胍洗脱缓冲液洗脱的组分作为TbpA的制剂。抗-TbpA和抗-TbpB单特异性兔血清的制备。将如上所述所制备的约500μg溶血巴斯德氏菌h44菌株的纯化的TbpA或TbpB制剂与弗氏完全佐剂混合，并肌内注射到两只白色的雌性新西兰兔中。以3周的间隔用相同量的在弗氏不完全佐剂中的抗原加强免疫所述的兔后，在最终加强免疫后2周收集免疫血清。在SDS-PAGE和受体蛋白质的免疫印迹以及利用作为第二抗体的山羊抗-兔IgG缀合HRP后，试验抗TbpA和TbpB的血清的特异性。分析方法。如前所述(32)经SDS-PAGE，接着经银染分析蛋白质样品。对于Western印迹分析，从铁-有限细胞得到的约1-2μg纯化的受体蛋白质或40μg外膜蛋白质在10％聚丙烯酰胺凝胶上分离。在15V下在20 mM Tris,pH 7.5,150 mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS中，将蛋白质电泳过夜转移到硝酸纤维素(Millipore,Bedford,MA)上。在室温下，采用在20mMTris pH7.5,500mM NaCl(TBS)中的0.5％脱脂奶把滤膜封闭30分钟。在室温下，将膜暴露在以封闭溶液1/1000稀释的适当的抗体下1小时，用TBS洗涤两次，然后暴露在1/3000稀释的第二抗体(来源于BioRad的山羊抗-兔IgG-辣根过氧化物酶缀合物)下。除去缀合物，以TBS洗涤三次，然后与HRP-底物混合反应。对于全细胞测定，将铁-缺乏或铁-充分(对照)细胞直接点样在HA纸上。在干燥之后，将HA纸用封闭溶液处理，并且以TBS洗涤，然后如上所述试验与抗TbpA或TbpB抗血清的反应性。点样细胞的对照组用HRP-牛运铁蛋白处理1小时，然后在用TBS洗涤后与HRP-底物反应。tbp基因的PCR扩增和限制性内切核酸酶消化分析。通过Saris等(1990)的方法用完整细胞完成溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA和tbpB的扩增。用寡核苷酸tbpA 5’和tbpA 3’(#255和#256，表2)进行tbpA的扩增。寡核苷酸#401和#199(表10)用来扩增tbpB。反应条件为94℃1分钟，45℃1分钟和74℃2分钟，30个循环。经1％琼脂糖凝胶电泳用0.5X TBE缓冲液(45mM Tris-硼酸盐，1mM EDTA,pH8.3)分离PCR产物，并且以在相同的缓冲液中的溴化乙锭(每毫升0.5mg)染色。对于Sau3A限制性内切核酸酶(Gibco BRL)消化，将PCR产物进行苯酚氯仿和乙醇沉淀，然后以Sau3A消化。然后用0.5X TBE缓冲液以7.5％丙烯酰胺凝胶分析消化物，并以与上述琼脂糖凝胶相同的方法可视化。结果受体结合的特异性。在一个以前的研究中已说明在病原细菌物种的代表性分离物中的运铁蛋白受体在它们与山羊，绵羊和牛运铁蛋白的相互作用上是不同的(Yu和Schryvers 1996)。因此估价了一组来源于牛，绵羊以及山羊的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的代表性分离物(表9)与不同反刍动物运铁蛋白的相互作用。所有这些菌株都能够利用牛，公山羊或绵羊运铁蛋白作为生长的铁源(数据未显示)。在固相结合测定中，固定化的铁-缺乏细胞对结合所有三种运铁蛋白是阳性的(图25)。在交互的竞争结合测定中，三种运铁蛋白在阻断对细胞的结合上是等效的(未示出)。此外，分子量分别为100Kda以及60Kda的TbpA和TbpB两者被含有牛(图26,A组)，公山羊或绵羊运铁蛋白(未示出)的亲和性树脂有效地分离。这些结果表明在这组相关菌株之内的运铁蛋白-结合的特异性是不能区别的。对运铁蛋白受体蛋白的免疫学分析。牛，公山羊和绵羊运铁蛋白竞争相同的受体的观察结果说明至少在受体的结合域中具有保守性。然而，不同的血清型的个体受体蛋白质之间的相似性的程度不清楚。为了阐明这一问题，分别抗TbpA和TbpB产生抗体，并在兔中利用纯化的受体蛋白质作为复合物(来源于牛菌株h44的TbpA和TbpB)。然后将这些抗血清针对不同血清型代表性菌株(包括从牛，绵羊和山羊获得的分离物)的受体蛋白质进行试验。
图26,B组的结果显示抗溶血巴斯德氏菌血清型A1菌株h44的纯化的TbpA和TbpB受体产生的抗血清与所有代表菌株的类似纯化受体强烈反应。因为从各种菌株获得的受体蛋白质的产率上存在差异(图26,A组)，这很可能说明一些菌株的抗血清的反应性上所观察到的轻微的区别(图26,B组)。这样，这些结果说明两种受体蛋白质在引起牛，绵羊和山羊巴斯德氏菌病的溶血巴斯德氏菌的不同的血清型之间是保守的。
虽然这一分析表明在运铁蛋白受体蛋白质上具有交叉反应性表位，当它不提供在细胞表面是否具有交叉反应性表位(对宿主免疫效应机制可及的)的任何信息。作为试图阐明这一问题的第一步，试验了来源于不同物种的完整的铁-缺乏细胞对单特异性抗-受体抗血清的反应性(图27)。这些实验显示抗溶血巴斯德氏菌A1型菌株的TbpA以及TbpB所制备的单特异性抗血清与A1型菌株(h44和h196，图26,B组)，几个其它A血清型(h98,h103,h105，和h107)反应，与几个海藻巴斯德氏菌菌株(h99,h100,h106)发生中等强度的反应。抗菌株h44的TbpA和TbpB制备的单特异性抗血清与广泛收集的A1性菌株(其中两个(h44,h196)在图27中说明)的铁-有限全细胞发生强烈的反应(数据未示出)。与溶血巴斯德氏菌(h98,h103,h105和h107)和海藻巴斯德氏菌(h99,h100和h106)内的其它血清型具有不同程度的反应性。用标记的bTf(图27)所获得的信号与用不同的菌株的抗-TbpA与抗-TbpB抗血清(图27)获得的信号之间的相互关系说明在完整细胞中所观察到的反应性主要是因为受体蛋白质。当用对照抗血清时观察到的无反应性(数据未示出)和在铁缺乏细胞中的降低的反应性(图26,C组)也支持这一结论。运铁蛋白受体蛋白基因的遗传分析。作为对免疫学研究的补充，估价了来源于不同溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbp基因的可变性。利用血清型A1菌株tbpA基因获得的序列信息(28)，为所述基因的5＇和3’末端制备特异性引物(引物#255和#256，表10)。这些引物能够从所有检验的菌株扩增完整的tbpA基因，虽然对菌株h100仅一致地获得小的产量。然后将完整的基因(除h100的外)进行Sau3A限制性内切核酸酶消化，所形成的片段在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析。在A1型菌株(h44和h196，图28,A组)中观察到特定模式，并且与所试验的所有七个A1菌株中的相同(数据未显示)。这一模式在大多数其它血清型溶血巴斯德氏菌(h105,h104和h98，图28)中也存在。对其它A型菌株(h103和h107)和在T菌株(h106和h99)内观察到在模式方面细小的变化，涉及一个或多个片段，很可能是由于单一位点的改变。
限制性消化分析不能鉴别A1分离物中的tbpA基因之间的任何区别。这样，采取了另一种迅速和简捷的检查tbpA基因间的差异的方法。这一方法基于具有TbpA(和LbpA)蛋白质片段的观察结果，说明是表面环，这显示不同的物种蛋白质间氨基酸序列方面的最大的变异(21和Legrain等1996)。具体地说，具有一个大的预测的环，通过与单克隆抗体反应性说明在表面上(21)，其中，当对比两种脑膜炎双球菌菌株，一种淋病双球菌菌株和四种流感嗜血菌菌株的TbpA时，观察到氨基酸序列上的最大的差异(1；Loosemore等1996；Schryvers和Gonzalez 1996)。基于在溶血巴斯德氏菌A1型这一区中的已知氨基酸序列(VEDTCPTLD)制备一种寡核苷酸引物(#450，表10)，并且将它与5＇特异性引物(#255，表10)组合用于以各种菌株进行的菌落PCR扩增反应。如图29 A组中所说明的，这一寡核苷酸对在高严格条件下易于从所有菌株(除菌株h100外，其中共迁移带几乎看不清楚)扩增预期的800 bp PCR产物。这些结果说明在溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌的不同的血清型中具有相当大的同源性，即使是在TbpA的非保守氨基酸区中。
为了评价tbpB基因中的差异，首先尝试利用对该基因5’和3’末端特异性的引物(引物#401和#199，表10)从各种菌株扩增完整的基因。这些引物从所有试验的菌株容易地扩增完整的tbpB基因(表11)。限制酶消化分析揭示一种相同的消化模式在试验的所有七种A1菌株(参见图28 B组中的h44和h196)和其它组的一些菌株(h105,h104和h98)中观察到。仅在几种其它菌株(h103,h107,h99,h106，图28,B组)中检测到模式上微小的区别。这祥，使用采用可变区的寡核苷酸引物的基于PCR的方法，看在其它研究中发现的可变区是否在溶血巴斯德氏菌中出现差异。在报道的tbpB的保守区(26)外与5’引物(#401，表10)一起试验反向寡核苷酸引物(#397，表10)。类似地，将其它可变区的正向引物(#400)与3’末端寡核苷酸引物(#199)组合使用。从所有试验的A和T菌株(除了一种T菌株h99(图29B和表11)外)获得预期的tbpB部分产物，表明不仅在所述基因的5’和3’末端，而且在其它物种的已知的大量的可变区中确实存在相当大的同源性。
表10寡核苷酸引物# 描述 方向 序列255 tbpA-5＇末端，在起始密码子上的NdeⅠ位点 正向 CCCTATCATATGATAATGAAATATCATC256 tbpA-3＇末端，在终止密码子后的 反向 TAGCGCAAGCTTCTAAAACTTCATTTCAAATHindⅢ位点450 tbpA-可变区 反向 TAATGTTGGGCAAGTATCTTCCAC401 tbpB-5＇末端 正向 TAAATTAAAGGAGACATTATGTTTAAACT199 tbpB-3＇末端，侧翼HindⅢ位点 反向 GCGCAAGCTTTATTTTTCTATTTGACG397 tbpB-可变区，接近3’端 反向 CTGTTGGCAAATCTGCCAGAG400 tbpB-可变区，接近中部正向 AGGTAATCGCTTTTCTGGTAAAGC*相对于有关基因编码链的取向的方向表11．溶血巴斯德氏菌不同血清型的tbpA和tbpB基因片段的PCR-扩增
<p>注+=获得预期大小的产物，可与对照(h196)比较+/-=获得预期大小的产物，但是在强度上比对照弱得多-=没有获得产物讨论发现一组其它反刍动物的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌分离物能够从牛，绵羊和公山羊运铁蛋白获取铁(数据未显示)，这被认为是由特异性结合反刍动物运铁蛋白的表面受体所介导(A1-Sultan和Aitken1984)。牵涉到这一研究中的一组溶血巴斯德氏菌(生物型A)和海藻巴斯德氏菌(生物型T)包括不同的血清型(表9)，说明受体介导的铁获取机理在这些物种内相当普遍。在用于结合测定的标准条件下所试验的各种菌株中，在运铁蛋白结合活性的表达方面具有一些可变性。在结合缀合的宿主运铁蛋白(HRP-hTf)的能力上的类似的变化在流感嗜血菌菌株中已观察到(Robki等1993)。这可以部分归因于不同菌株的改变的生长特征。然而，结合测定的高度敏感性和特定的性质使得能够最终鉴别在所试验的菌株中受体活性的存在。
竞争性结合实验和亲和性分离实验表明，与所有三种反刍动物运铁蛋白的相互作用受到相同的受体蛋白质的调节，这些蛋白质在所分析的各种菌株中显示相对大的相似性。这一结论进一步由从各种溶血巴斯德氏菌菌株制备的受体蛋白质的免疫学分析所证实(图26 B组)，所说的菌株具有对TbpA和TbpB的单特异性的血清。因为免疫学分析包括在生物型A和T之内的各种不同的血清型，所以会出现，在反刍动物的溶血巴斯德氏菌疾病分离物中运铁蛋白受体蛋白质是相当保守的。虽然在各种不同溶血巴斯德氏菌菌株中的两种受体蛋白质之间具有相对大的免疫学交叉反应性，但这一交叉反应性应当包括存在于体内表面的表位。完整细胞/抗体分析的初步结果(图27)说明这样的表面表位的存在。任何给定菌株的完整细胞/HRP-btf和完整细胞/抗-Tbp反应性所观察到的一致的模式(图27)，以及在铁充足细胞中的两种反应所观察到的极大地降低活性说明所观察到的反应性是抗铁调节蛋白的。
在开发抗任何细菌物种的有效疫苗中的一个重要的考虑事项是疫苗抗不同血清型/生物型感染细菌物种的抗菌谱。在脑膜炎萘瑟氏球菌中，虽然TbpA蛋白质是相对同源的，但基于它们的TbpB蛋白质(18)的分子量和抗原性的不同在所说的物种中两个家族的鉴别规定了代表两个家族的异源Tbp疫苗的配方。
用Schryver和Morris(32)的亲和性纯化方法鉴别了来源于溶血巴斯德氏菌血清型A1(26)的牛菌株的100Kda运铁蛋白受体蛋白质(TbpA)。如方法部分所述的这一方法的修改使得我们可以鉴别溶血巴斯德氏菌中的60Kda第二运铁蛋白结合蛋白，其类似于其它的细菌物种中的TbpB(32和Robki等1993)。亲和性纯化方法分离来源于所检验的所有溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的类似分子量的TbpA和TbpB(图26,A组)。我们在溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌中的结果显示，抗血清型A1菌株h44的这两种纯化的受体蛋白质产生的抗血清特异性地识别其它A1菌株(h196，图26,B组)和其它A血清型的受体蛋白质。这些包括已知在其与抗35Kda和70Kda铁调节外膜蛋白质的恢复期血清的反应性上不同于其它A型的A11血清型(h107)。T菌株h99以及h100(图26,A组)的纯化受体的量以及它们的抗血清(图26,B组)与大多数A菌株比较表现出降低。与T菌株的抗体反应性的降低也在完整细胞测定中观察到(图27)。然而，在这些菌株中的完整细胞-抗体反应性上的降低和它们与HRP-bTf的降低的反应性一致(图27)。这说明与抗-TbpA和抗-TbpB抗血清的观察到的更低的反应性很可能是由于在用于这些实验的标准生长条件下的受体蛋白质的表达上的不同。
编码TbpA和TbpB蛋白质的基因，tbpA以及tbpB在血清型A1(在牛中引起肺巴斯德氏菌病)内是相当同源的，在广泛的A型(在绵羊和山羊中引起肺炎)中有很大程度的同源性(图28)。通过将限制酶消化分析扩展到海藻巴斯德氏菌菌株，我们发现仅有边际的区别(图28)。用特异性5’和3’寡核苷酸引物和来源于高变区的引物(图29，表11)进行的PCR-扩增实验的结果进一步支持这样的结论溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌内的tbp基因同源性是比较高的。这些与已从流感嗜血菌和脑膜炎萘瑟氏球菌(1和Loosemore等)所观察到的区别相反，但需要由从大量血清型的代表性菌株分离的基因的序列分析证实。
在tbp基因中明显的遗传异质性的缺乏和各种溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的Tbp蛋白质的表观免疫学交叉反应性标志着它们是预防反刍动物中传染病的广谱疫苗抗原。
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详细的图例说明图1．PCR分析结果a)PCR方法的示意图-各个环代表重组pBR322质粒和可能的PCR反应。Tbp1引物，左引物和右引物分别用t,1和r表示。在pBR322质粒上的EcoRⅠ位点用字母E表示。在上部质粒中，Tbp1引物和左引物扩增相应于粗线的PCR产物。类似地，在下部的质粒中，由Tbp1引物和右引物扩增的PCR产物用粗线表示。
(b)由Tbp1引物和左引物扩增的0.8 kb PCR产物图2.tbp质粒9,10和482的限制性内切核酸酶图谱。空心方框-pBR322线性化的。带斜线的方框-PCRⅡ线性化的。tbpA,tbpB的位置和取向如黑箭头所示。
图3．溶血巴斯德氏菌tbpA和tbpB的基本核苷酸序列。推定的信号序列切割位点由箭头表示。起始密码子(ATG)有下划线。
图4．溶血巴斯德氏菌tbpB的启动子区(PHTBPB)。推定的Fur共有序列由星号表示。也表示了淋病萘瑟氏球菌tbpB(NGTBPB)和脑膜炎奈瑟氏球菌tbpB(NMTBPB)的Fur共有序列。
图5．用ClaⅠ消化的和用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因组DNA的Southern杂交。泳道1-16代表溶血巴斯德氏菌血清型1到16。泳道M代表用Hind Ⅲ消化的和与分别作为大小标记的放射性标记的λDNA杂交的λDNA。
图6．以HindⅢ和BamHⅠ消化的并且用tbpA基因探查的溶血巴斯德氏菌基因组DNA的Southern杂交。泳道1-16代表溶血巴斯德氏菌血清型1-16。分子大小如左所示。
图7．以各种限制性内切核酸酶消化的并且用溶血巴斯德氏菌tbpA探查的猪放线杆菌3714、胸膜肺炎放线杆菌CM5和shope 4074基因组DNA的Southern杂交。泳道M代表用Hind Ⅲ消化和与分别作为大小标记的放射性标记的λDNA杂交的λDNA。
图8．溶血巴斯德氏菌A1，胸膜肺炎放线杆菌CM5,Shope 4074和猪放线杆菌3714中的tbpA、tbpB区的限制性酶切图。泳道1代表用于图15中的tbpA探针。泳道2代表用于图16和17中的tbpA探针。
图9．溶血巴斯德氏菌A1的Tbp1(PHTBP)和淋病奈瑟氏球菌的Tbp1(NGTBP1)与脑膜炎奈瑟氏球菌的Tbp1(NM1)的氨基酸的序列对比。右边的编号表示氨基酸位置。星号表示在序列对比中完全相同的位置，小黑点表示类似的氨基酸残基。引入间隙以便最多地比较序列，并用破折号(-)表示。
图10．溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1(PHTBPI)和胸膜肺炎放线杆菌血清型1和7 TfbA蛋白质(APL,APL7)之间的序列对比。星号表示在序列对比中完全相同的位置，小黑点表示类似的氨基酸残基。引入间隙以便最多地比较序列，并用破折号(-)表示。
图11．说明溶血巴斯德氏菌Tbp1(PHTBP)，淋病奈瑟氏球菌Tbp1(NGTBP1)，脑膜炎奈瑟氏球菌Tbp1(NM1)和胸膜肺炎放线杆菌血清型1和7 TfbA蛋白质(APL1,APL7)之间的遗传相关性的图示。
图12．溶血巴斯德氏菌A1 Tbp1和大肠杆菌TonB-依赖性外膜受体之间的肽对比。星号表示在序列对比中完全相同的氨基酸，小黑点表示类似的氨基酸残基。引入间隙以便最多地比较序列，并用破折号(-)表示。
图13．溶血巴斯德氏菌Tbp1蛋白质的T7分析。以kDa为单位的分子量标记表示在左边泳道1-阳性对照重组质粒。泳道2-含有tbpA的重组质粒。泳道3-载体质粒pBluescript(SK)。
图14．溶血巴斯德氏菌A1和大肠杆菌HB101的内和外膜的Western免疫印迹。第一抗体是抗溶血巴斯德氏菌A1可溶性抗原产生的兔抗血清，第二抗体是山羊抗-兔碱性磷酸酶缀合物。泳道M代表以kDa为单位的分子量标记。泳道1-4代表外膜组分，泳道5-8是内膜组分。6μg的蛋白质加入到各泳道上。泳道1和5-来源于生长在LT上的细胞的大肠杆菌蛋白质。泳道2和6-来源于生长在BHIB上的细胞的蛋白质。泳道3和7-来源于生长在BHIB加100μM EDDA上的细胞的蛋白质。泳道4和8-来源于生长在BHIB加100μM EDDA与1 mM FeSO4上的细胞的蛋白质。
图15．采用在小牛中用Presponse接种抗可溶性抗原产生的血清获得的溶血巴斯德氏菌A1和大肠杆菌HB101的内和外膜的Western免疫印迹。第二抗体是山羊抗-牛碱性磷酸酶缀合物。泳道M代表以kDa为单位的分子量标记。泳道1-4代表外膜组分，泳道5-8是内膜组分。6μg的蛋白质加入到各泳道上。泳道1和5-来源于生长在LT上的细胞的大肠杆菌蛋白质。泳道2和6-来源于生长在BHIB上的细胞的蛋白质。泳道3和7-来源于生长在BHIB加100μM EDDA上的细胞的蛋白质。泳道4和8-来源于生长在BHIB加100μM EDDA与1 mM FeSO4上的细胞的蛋白质。
图16．由铁-缺乏细菌膜结合标记的运铁蛋白。将从所示的细菌菌株的铁-缺乏细胞制备的总膜等分样(4μg蛋白质)点样在硝酸纤维素/醋酸纤维素纸条上，封闭后，将纸条暴露于含有450ng/ml所述的HRP-缀合的运铁蛋白的混合物中。随后洗涤滤纸并用方法部分中描述的HRP底物混合物展开。h173,h174,h175,h176和h44是溶血巴斯德氏菌的代表性菌株，它们的血清型和来源在表1中列出。h50-牛，绵羊，公山羊和马运铁蛋白的马驹放线杆菌HRP-bTf,-oTf,-cTf和-eTf-HRP缀合物。
图17．用运铁蛋白亲和柱分离受体蛋白质。用从溶血巴斯德氏菌菌株h44(顶部组)，h173(中部组)和h175(底部组)制备的铁-缺乏总膜完成亲和分离实验。采用方法部分所描述的标准洗涤条件(泳道B-E)或低盐洗涤条件(泳道A)，用牛运铁蛋白-琼脂糖凝胶(泳道A和B)，绵羊运铁蛋白-琼脂糖凝胶(泳道C)，公山羊运铁蛋白-琼脂糖凝胶(泳道D)或马运铁蛋白-琼脂糖凝胶(泳道E)进行实验。将用含有2M盐酸胍的缓冲液洗脱的样品透析、浓缩和用如方法部分描述的SDS-PAGE和银染进行等分样分析。
图18．来源于牛、绵羊和山羊的不同血清型溶血巴斯德氏菌的受体蛋白质的免疫学分析。如方法部分所述，将来源于代表性血清型的溶血巴斯德氏菌的纯化的受体蛋白质等分样进行SDS-PAGE，电印迹，然后用特异性抗-TbpB血清(A组)或用抗-TbpA血清(B组)探查。下列所示的血清型的溶血巴斯德氏菌菌株包括在分析中泳道1-菌株h44(A1)，泳道2-h173(未分型)，泳道3-h175(A7)，泳道4-h176(A9)，泳道5-h100(T4)，泳道6-h106(T10)，和泳道7-h107(A11)。左边的数字代表标准蛋白质的分子量(×1000)。
图19．由完整的细胞结合标记的运铁蛋白和抗-受体抗体。所示的菌株在铁-有限条件下生长，经离心回收，重悬于50 mM TrisHCl,150 mMNaCl,pH 7.5缓冲液中至A600为1-2。将5μl的悬液等分样用于HA膜上，干燥该膜，封闭，然后与含有标记的运铁蛋白(HRP-bTf)或抗受体抗体(抗-TbpA，抗-TbpB)的封闭溶液接触。洗涤后来的膜，随后在用底物展开之前与标记的第二抗体接触。
图20．溶血巴斯德氏菌tbp操纵子(顶端)和调节序列(底端)的图。tbpA和tbpB分别是编码TbpA和TbpB的基因；p是在tbpB前的推定的启动子区，在底部以-35和-10位点表示；推定的Fur盒以在底部序列相反方向的两个箭头表示；rnaseT和fis是两个ORF，它们侧翼于溶血巴斯德氏菌tbp操纵子，分别编码高度同源于大肠杆菌和流感嗜血菌RNase转移酶和倒位因子刺激蛋白质的蛋白质。此外也用粗体表示了推定的核糖体结合位点或Shine-Dalgarno(SD)共有序列，转录起始密码子(Met)和终止密码子(SC)。
图21．溶血巴斯德氏菌菌株H196 tbpA基因的DNA序列。
图22．溶血巴斯德氏菌菌株H196的TbpA蛋白质的预测的氨基酸序列。斜体的氨基酸相应于实验确定的成熟蛋白质的N端氨基酸。由透线表示的残基构成前导肽区。在脑膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血菌和胸膜肺炎放线杆菌的TbpAs中相同的残基以粗体和下划线表示。表示了基于Tommassen提出的拓扑学模型(28)所建议的为内部区段(浓阴影)、内膜b-链(淡阴影)或外区段(无阴影)的区。
图23．溶血巴斯德氏菌菌株H196 tbpB基因的DNA序列。
图24．溶血巴斯德氏菌菌株H196的TbpB蛋白质的预测的氨基酸序列。斜体的氨基酸相应于预测的成熟蛋白质的N端氨基酸。由透线表示的残基构成前导肽区。同源的区用阴影表示，在脑膜炎奈瑟氏球菌，淋病奈瑟氏球菌，流感嗜血菌和胸膜肺炎放线杆菌的TbpBs中相同的残基以粗体和下划线表示。
图25．固相HRP-Tf结合测定。将所示溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的总膜制剂点样在硝酸纤维素-醋酸纤维素纸上，在与HRP-bTf,-oTf或-gTf一起温育之前，用脱脂奶封闭。如方法部分所述，用氯萘酚试剂检测结合。左边的字母表示菌株，而顶端的字母表示不同的HRP-标记的反刍动物运铁蛋白。
图26．用溶血巴斯德氏菌血清型A1的抗-TbpA和抗-TbpB抗血清进行的Western印迹交叉反应性研究。经SDS-PAGE和银染(A组)分离所示的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的亲和纯化的受体蛋白等分样，或者如方法部分所述进行Western印迹(B组)。如方法部分所描述的，通过与抗-TbpB(1/1000)和抗-TbpA(1/1000)兔抗血清混合物一起温育鉴别Tbp蛋白质。左边的数字代表以kDa为单位的标准蛋白质的分子量(X 1000)。
图27．用抗完整细胞的溶血巴斯德氏菌血清型A1的单特异性抗-TbpA和抗-TbpB抗血清进行的交叉反应性研究。将所示溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的铁-有限完整细胞的等分样点样到HA硝酸纤维素纸上，封闭后，将膜暴露在HRP-标记的bTf，抗-TbpA抗血清或抗-TbpB抗血清下。随后如方法部分所述，通过标记的山羊抗-兔抗体检测结合的抗体。将在铁充足下生长的完整的溶血巴斯德氏菌菌株h44(A1型)细胞(以h44-Fe+表示)的制剂点样到膜上并用作对照。
图28．PCR扩增的溶血巴斯德氏菌和海藻巴斯德氏菌菌株的tbpA(A组)和tbpB(B组)基因的限制性内切核酸酶消化模式。用Sau3A1限制性内切核酸酶消化所示菌株的由集落PCR扩增的tbp基因。如方法部分所述，将所形成的消化物在7.5％聚丙烯酰胺凝胶上电泳。在泳道上的字母表示用于PCR的源菌株模板DNA，而左边的字母表示以kDa为单位的分子量标准。用Hewlett-Parkard ScanJetⅡp进行成像。在图29B中，来源于溶血巴斯德氏菌tbpB基因非保守区的引物#s 397和400用于分别与相反引物(#s401(5＇)和199(3＇)组合。
图29．tbpA和tbpB基因可变区段的PCR扩增。对tbpA基因而言，从tbpA高变区的推定的氨基酸序列制备的寡核苷酸引物#450用于与5’特异性引物(#255)组合，以扩增各种溶血巴斯德氏菌菌株的基因区段。然后在1％琼脂糖凝胶上分析产物，接着用溴化乙锭染色。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申请人(A)名称LO,Reggie,Y.C.
(B)街道Birch街4号(C)城市Guelph(D)州安大略(E)国家加拿大(F)邮区代码N1G 2N3(A)名称SCHRYVERS,Anthony,B.
(B)街道Edforth路39号(C)城市Calgary(D)州Alberta(E)国家加拿大(F)邮区代码T3A 3V8(A)名称POTTER,Andrew,A.
(B)街道521 Dalhousie Cres.
(C)城市Saskatoon(D)州Saskatchewan(E)国家加拿大(F)邮区代码F7H 3S5(ⅱ)发明名称溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白和包含该蛋白质的疫苗(ⅲ)序列数4(ⅳ)通讯地址(A)收信人BERESKIN＆PARR(B)街道40 King Street,West(C)城市多伦多
(D)州安大略(E)国家加拿大(F)ZIPM5H 3Y2(ⅴ)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0,#1.30版(ⅵ)当前申请的数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅶ)在先申请的数据(A)申请号US 60/008,569(B)申请日1995年12月1日(ⅶ)在先申请的数据(A)申请号CA 2,164,274(B)申请日1995年12月1日(ⅷ)律师/代理人信息(A)姓名Kurdydyk,Linda M.
(B)注册号34,971(C)卷号6580-82(ⅸ)电讯信息(A)电话(416)364-7311(E)传真(416)361-1398(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度2784个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅵ)原始来源(A)有机体溶血巴斯德氏菌(tbpA基因)(B)菌株H196(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1:ATGATAATGA AATATCATCA TTTTCGCTAT TCACCTGTTG CCTTAACAGT GTTATTTGCT 60CTTTCTCATT CATACGGTGC TGCGACTGAA AATAAAAAAA TCGAAGAAAA TAACGATCTA120GCTGTTCTGG ATGAAGTTAT TGTGACAGAG AGCCATTATG CTCACGAACG TCAAAACGAA180GTAACTGGCT TGGGGAAAGT AGTGAAAAAT TATCACGAAA TGAGTAAAAA TCAAATTCTT240GGTATTCGTG ATTTAACTCG CTATGACCCT GGTATTTCGG TGGTGGAACA AGGTCGCGGT300GCAAGTAGTG GCTATGCCAT TCGAGGTGTA GATAAAAACC GTGTCAGCTT ACTTGTTGAT360GGGCTACCAC AAGCGCACAG TTATCATACG CTAGGTTCAG ATGCTAATGG TGGTGCAATT420AATGAGATTG AGTATGAAAA CATTCGTTCA ATTGAGTTAA GCAAAGGAGC AAGTTCTGCG480GAATATGGCT CTGGTGCGCA TGGTGGTGCT ATTGGTTTTC GTACTAAAGA TGCGCAGGAT540ATTATTAAAG AGGGGCAGCA TTGGGGCTTA GATAGTAAGA CCTCTTATGC CAGCAAAAAT600AGCCATTTTT TACAGTCTAT CGCAGCGGCT GGTGAGGCGG GTGGTTTTGA AGCACTTGTT660ATTGCAACTC ACCGACACGG TAAAGAGACC AAAATTCATT CCGAGGCAAA TAAATTAAAA720CATAATATTC GGCGTATAAC CGGCTTTGAA AATCGCTACG ACTTTACCCA AATTCCGCAC780AGAATGCTCC 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Ser Asn Ser Val Phe Met Lys Phe Gly Tyr His Phe Asn Ser340 345 350Ser His Tyr Leu Gly Ala Ile Leu Glu Asp Thr Lys Thr Arg Tyr Asp355 360 365Ile Arg Asp Met Gln Thr Pro Ala Tyr Tyr Thr Lys Asp Asp Ile Asn370 375 380Leu Ser Leu Arg Asn Tyr Val Tyr Glu Gly Asp Asn Ile Leu Asp Gly385 390 395 400Leu Val Phe Lys Pro Arg Ile Pro Tyr Gly Leu Arg Tyr Ser His Val405 410 415Lys Phe Phe Asp Glu Arg His His Lys Arg Arg Leu Gly Phe Thr Tyr420 425 430Lys Tyr Lys Pro Glu Asn Asn Arg Trp Leu Asp Ser Ile Lys Leu Ser435 440 445Ala Asp Lys Gln Asp Ile Glu Leu Tyr Ser Arg Leu His Arg Leu His450 455 460Cys Ser Asp Tyr Pro Val Val Asp Lys Asn Cys Arg Pro Thr Leu Asp465 470 475 480Lys Ser Trp Ser Met Tyr Arg Thr Glu Arg Asn Asn Tyr Gln Glu Lys485 490 495His Arg Val Ile His Leu Glu Phe Asp Lys Ala Leu Asn Ala Gly Gln500 505 510Gly Val Phe Asn Gln Thr His Lys Leu Asn Leu Gly Leu Gly Phe Asp515 520 525Arg Phe Asn Ser Leu Met Asp His Gly Asp Met Thr Ala Gln Tyr Thr530 535 540Lys Gly Gly Tyr Thr Ser Tyr Arg Gly Arg Gly Arg Leu Asp Asn Pro545 550 555 560Tyr Ile Tyr Arg Arg Asp Pro Arg Ser Ile Glu Thr ValSer Leu Cys565 570575Asn Asn Thr Arg Gly Asp Ile Leu Asn Cys Glu Pro Arg Lys Ile Lys580 585 590Gly Asp Ser His Phe Val Ser Phe Arg Asp Leu Val Ile Ser Glu Tyr595 600 605Val Asp Leu Gly Leu Gly Val Arg Phe Asp Gln His Arg Phe Lys Ser610 615 620Asp Asp Pro Trp Thr Leu Ser Arg Thr Tyr Arg Asn Trp Ser Trp Asn625 630 635 640Gly Gly Ile Thr Leu Lys Pro Thr Glu Phe Val Ser Leu Ser Tyr Arg645 650 655Ile Ser Asn Gly Phe Arg Val Pro Ala Phe Tyr Glu Leu Tyr Gly Lys660 665 670Arg Asp His Ile Gly Leu Lys Asp Asn Glu Tyr Val Gln Arg Ala Gln675 680 685Arg Ser His Gln Leu Glu pro Glu Lys Ser Thr Asn His Glu Ile Gly690 695 700Val Ser Phe Lys Gly Gln Phe Gly Tyr Leu Asp Val Ser Tyr Phe Arg705 710 715 720Asn Asn Tyr Lys Asn Met Ile Ala Thr Ala Cys Lys Arg Ile Ile Gln725 730 735Lys Ser His Cys Phe Tyr Asn Tyr His Asn Ile Gln Asp Val Ala Leu740 745 750Asn Gly Ile Asn Leu Val Ala Lys Phe Asp Leu His Gly Ile Leu 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(ⅰ)序列特征(A)长度1755个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型DNA(基因组的)(ⅵ)原始来源(A)有机体溶血巴斯德氏菌(TbpB基因)(B)菌株H196(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:ATGTTTAAAC TTAAAAGTAG TTTTGTACTG CTTAATGCGG CGCTACTTGC TGCTTGTTCC 60TCAAATGGTG GAAGCTTTGA TGTTCAATCT GCCAAAGTTG AATCTCAAAC GCAAACTACC 120CCCAAAAAGC CAAGTTTACA AGATGATAAT AGTAACGCAA GACGTACAGT AAGCGCTTCT 180GAAACTGAAG CTTTATTGCA GCCGGGGTTT GGTTTTTCAG CCAAAATTCC GCGTCGTAAT 240CTCCTTCCGC AGGGGAAGGA AGATGTAGCC CCTATTGGTG ATATAAAAGA GATTACTGGA 300GATCTGCCAA AAATTCCGTA TGAAGAAGAG GTTAAAGCGT GCGGTAGTAG TGCTGATGGA 360TTTAGCCATA CTCATGATAG AAATCATAAG TTGTATACAA GAGATTTTAA TTTTGTTCGT 420TCCGGCTATG TTGTGCATTC TGGTCCAAAA CCTGAAATAA AGCCTAAAGA AATTTTGAGA 480ACAGGTGCAC ATGGGTATGT TTACTATTTA GGTATAGAGC CGCCCAAAGC AATACCTACC 540CAAAAACTAA CTTATAAAGG ATATTGGGAT TTTACTACCT ATGCGGCTAA GGGGAGAGAT 600AGTAATATTT TTCTAATTCC CGCAGGCATC AATAGTGGCG CCATACCGGA AAATAGTCAC 660GATATTAATG TTGATGATTC TGAAAAACCA ATGGGGCATA CAGGAGAATT TACGGCTGAT 720TTTGCTAATA AAACTTTAAC TGGAACATTG GTTCGTAATG GGTATGTTAG TCGTAGCAAA 780GAGCAAAAAA TTACAACAAT TTACGATATT GATGCGAAAA TTAAAGGTAA TCGCTTTTCT 840GGTAAAGCAA ACCCAAAAAA ACCGATGATC CTTATTTTTG GGAAAAGCTC CACGACACTT 900GAAGGTGGAT TTTTTGGTGG GGAGGCTCAA GAACTTGCCG GTAAATTCTT AGCTGATGAT 960AAGTCGGTAT TTGTTGTTTT TGCTGGCACA CGAGATGCTA AAAAAGATGA TAGTGAATCT1020GCCTTTGATG CTTTCCCAAT TAAACTTAAA GATTTAAATA AATCTGAGAT GGATACTTTC1080GGGAATGCGA CACATTTGAT TATTAACAAT AAGCAGATTC CACTTATTGC GGAAGCCACA1140AAAAGCTTTG CCGAGATGAA ATTTGATGAT TTGGTTACCC GTACTATTGA TGGAAAAACG1200TATCGAGTTT CAGTCTGCTG TAATAATTTA GATTATGTCA AATTTGGGAT TTATAGCGAG 1260GGAAATAATA GTGATACTGC TCTCCAAGAA TATTTAGTAG GAGAACGTAC AGCTCTGGCA 1320GATTTGCCAA CAGGGACAGT AAAATATCGA GGTACTTGGG ACGGGGTAAT GTACAGTAAA 1380TCTGGCTCGG CAGGGGTTGA ATCGCCAAGT AACAGCGAAA GTGGTACTCG TTCACTATTC 1440GATGTAGATT TTGTCAATAA AAAAATTAAT GGCAAGCTGA TTGCTAATGA TGGTGTTGAA 1500GAACGCCCAA TGCTGACACT GGAAGGCAAT CTGAAAGGGA ATGGTTTTGG AGGCACAGCC 1560AAAACGGGCA ATTCTGGTTT TAATCTTGAT CCCAAAAGTA CGAATGGTGG CACGGTAGGG 1620CATATAAATA CTCAATTTGA AGGGGGCTTT TATGGCCCTA AGGCGACGGA ATTAGGTGGT 1680ATTGTACAAA ATACAGAAAC GGATAAAGAT AGAGTCAGTA TTACATTCGG CGGAAAACGT 1740CAAATAGAAA AATAA1755(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特征(A)长度584个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线型(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅵ)原始来源(A)有机体溶血巴斯德氏菌(TbpB蛋白质)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Met Phe Lys Leu Lys Sar Ser Phe Val Leu Leu Asn Ala Ala Leu Leu1 5 10 15Ala Ala Cys Ser Ser Asn Gly Gly Ser Phe Asp Val Gln Ser Ala Lys20 25 30Val Glu Ser Gln Thr Gln Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ser Leu Gln Asp35 40 45Asp Asn Ser Asn Ala Arg Arg Thr Val Ser Ala Ser Glu Thr Glu Ala50 55 60Leu Leu Gln Pro Gly Phe Gly Phe Ser Ala Lys Ile Pro Arg Arg Asn65 70 75 80Leu Leu Pro Gln Gly Lys Glu Asp Val Ala Pro Ile Gly Asp Ile Lys85 90 95Glu Ile Thr Gly Asp Leu Pro Lys Ile Pro Tyr Glu Glu Glu Val Lys100 105 110Ala Cys Gly Ser Ser Ala Asp Gly Phe Ser His Thr His Asp Arg Asn115 120 125His Lys Leu Tyr Thr Arg Asp Phe Asn Phe Val Arg Ser Gly Tyr Val130 135 140Val His Ser Gly Pro Lys Pro Glu Ile Lys Pro Lys Glu Ile Leu Arg145 150 155 160Thr Gly Ala His Gly Tyr Val Tyr Tyr Leu Gly Ile Glu Pro Pro Lys165 170 175Ala Ile Pro Thr Gln Lys Leu Thr Tyr Lys Gly Tyr Trp Asp Phe Thr180 185 190Thr Tyr Ala Ala Lys Gly Arg Asp Ser Asn Ile Phe Leu Ile Pro Ala195 200 205Gly Ile Asn Ser Gly Ala Ile Pro Glu Asn Ser His Asp Ile Asn Val210 215 220Asp Asp Ser Glu Lys Pro Met Gly His Thr Gly Glu Phe Thr Ala Asp225 230 235 240Phe Ala Asn Lys Thr Leu Thr Gly Thr Leu Val Arg Asn Gly Tyr Val245 250 255Ser Arg Ser Lys Glu Gln Lys Ile Thr Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Ala260 265 270Lys Ile Lys Gly Asn Arg Phe Ser Gly Lys Ala Asn Pro Lys Lys Pro275 280 285Met Ile Leu Ile Phe Gly Lys Ser Ser Thr Thr Leu Glu Gly Gly Phe290 295 300Phe Gly Gly Glu Ala Gln Glu Leu Ala Gly Lys Phe Leu Ala Asp Asp305 310 315 320Lys Ser Val Phe Val Val Phe Ala Gly Thr Arg Asp Ala Lys Lys Asp325 330 335Asp Ser Glu Ser Ala Phe Asp Ala Phe Pro Ile Lys Leu Lys Asp Leu340 345 350Asn Lys Ser Glu Met Asp Thr Phe Gly Asn Ala Thr His Leu Ile Ile355360 365Asn Asn Lys Gln Ile Pro Leu Ile Ala Glu Ala Thr Lys Ser Phe Ala370 375 380Glu Met Lys Phe Asp Asp Leu Val Thr Arg Thr Ile Asp Gly Lys Thr385 390 395 400Tyr Arg Val Ser Val Cys Cys Asn Asn Leu Asp Tyr Val Lys Phe Gly405 410 415Ile Tyr Ser Glu Gly Asn Asn Ser Asp Thr Ala Leu Gln Glu Tyr Leu420 425 430Val Gly Glu Arg Thr Ala Leu Ala Asp Leu Pro Thr Gly Thr Val Lys435 440 445Tyr Arg Gly Thr Trp Asp Gly Val Met Tyr Ser Lys Ser Gly Ser Ala450 455 460Gly Val Glu Ser Pro Ser Asn Ser Glu Ser Gly Thr Arg Ser Leu Phe465 470 475 480Asp Val Asp Phe Val Asn Lys Lys Ile Asn Gly Lys Leu Ile Ala Asn485 490 495Asp Gly Val Glu Glu Arg Pro Met Leu Thr Leu Glu Gly Asn Leu Lys500 505 510Gly Asn Gly Phe Gly Gly Thr Ala Lys Thr Gly Asn Ser Gly Phe Asn515 520 525Leu Asp Pro Lys Ser Thr Asn Gly Gly Thr Val Gly His Ile Asn Thr530 535 540Gln Phe Glu Gly Gly Phe Tyr Gly Pro Lys Ala Thr Glu Leu Gly Gly545 550 555 560Ile Val Gln Asn Thr Glu Thr Asp Lys Asp Arg Val Ser Ile Thr Phe565 570 575Gly Gly Lys Arg Gln Ile Glu Lys580
权利要求
1．一种纯化的与分离的核酸分子，该分子包含编码溶血巴斯德氏菌运铁蛋白结合蛋白的序列。
2．按照权利要求1的纯化的与分离的核酸分子，该分子包含编码溶血巴斯德氏菌TbpA的序列。
3．如权利要求2所要求的纯化的与分离的核酸分子，该分子编码具有如图22和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的蛋白质。
4．如权利要求2所要求的纯化的与分离的核酸分子，该分子具有这样的序列，该序列包括(a)如图21和SEQ ID NO:1所示的核酸序列；b)互补于(a)的核酸序列；(c)至少80％同源于(a)的核酸序列；或(d)至少15个碱基，并且在严格杂交条件下能杂交到(a)或(b)上的(a)或(b)的片段。
5．按照权利要求1的纯化的与分离的核酸分子，该分子包含编码溶血巴斯德氏菌TbpB的序列。
6．如权利要求5所要求的纯化的与分离的核酸分子，该分子编码具有如图24和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的蛋白质。
7．如权利要求5所要求的纯化的与分离的核酸分子，该分子具有这样的序列，该序列包括(a)如图23和SEQ ID NO:3所示的核酸序列；b)互补于(a)的核酸序列；(c)至少80％同源于(a)的核酸序列；或(d)至少15个碱基，并且在严格杂交条件下能杂交到(a)或(b)上的(a)或(b)的片段。
8．一种天然存在的核酸分子，其特征在于其具有在严格杂交条件下杂交到如权利要求2所要求的纯化的与分离的核酸分子上的能力。
9．一种天然存在的核酸分子，其特征在于其具有在严格杂交条件下杂交到如权利要求5所要求的纯化的与分离的核酸分子上的能力。
10．一种寡核苷酸，其包含如权利要求2所要求的核酸分子的至少15个邻接的碱基，该寡核苷酸的特征在于其具有在严格杂交条件下杂交到如权利要求2所要求的纯化的与分离的核酸分子上的能力。
11．一种寡核苷酸，其包含如权利要求5所要求的核酸分子的至少15个邻接的碱基，该寡核苷酸的特征在于其具有在严格杂交条件下杂交到如权利要求5所要求的纯化的与分离的核酸分子上的能力。
12．一种适于转化宿主细胞的重组表达载体，该载体包含如权利要求2所要求的核酸分子以及有效连接到该核酸分子上的一个或多个转录和翻译元件。
13．一种适于转化宿主细胞的重组表达载体，该载体包含如权利要求5所要求的核酸分子以及有效连接到该核酸分子上的一个或多个转录和翻译元件。
14．一种含有如权利要求12所要求的重组表达载体的宿主细胞。
15．一种含有如权利要求13所要求的重组表达载体的宿主细胞。
16．一种纯化的与分离的TbpA蛋白质。
17．如权利要求16所要求的纯化的与分离的TbpA蛋白质，该蛋白质具有如图22和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或其能够结合运铁蛋白的片段。
18．一种纯化的与分离的TbpB蛋白质。
19．如权利要求18所要求的纯化的与分离的TbpB蛋白质，该蛋白质具有如图24和SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或其能够结合运铁蛋白的片段。
20．一种用于制备TbpA蛋白质的方法，该方法包括(a)将按照权利要求12的重组表达载体转移到宿主细胞中；(b)选择转化的宿主细胞，使其与未转化的宿主细胞分离；(c)在使得TbpA可以表达条件下培养转化的宿主细胞；和(d)分离重组TbpA。
21．一种用于制备TbpB蛋白质的方法，该方法包括(a)将按照权利要求13的重组表达载体转移到宿主细胞中；(b)选择转化的宿主细胞，使其与未转化的宿主细胞分离；(c)在使得TbpB可以表达条件下培养转化的宿主细胞；和(d)分离重组TbpB。
22．一种多克隆或单克隆抗体，其具有抗TbpA或TbpB表位的特异性。
23．一种用于预防和治疗由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所说的疫苗包含免疫有效量的溶血巴斯德氏菌TbpA和TbpB中的至少一种和一种药学上可接受的载体。
24．按照权利要求23的疫苗，其中所说的感染由溶血巴斯德氏菌引起。
25．一种用于预防和治疗由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所说的疫苗包含免疫有效量的TbpA和TbpB以及一种药学上可接受的载体。
26．一种用于预防和治疗由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所说的疫苗包含免疫有效量的TbpB和一种药学上可接受的载体。
27．按照权利要求26的疫苗，其中所说的TbpB具有如图24和SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。
28．一种用于预防和治疗由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所说的疫苗包含免疫有效量的按照权利要求12的重组表达载体和一种药学上可接受的载体。
29．一种用于预防和治疗由Pasteurella spp.引起的感染的疫苗，其中所说的疫苗包含免疫有效量的按照权利要求13的重组表达载体和一种药学上可接受的载体。
全文摘要
本文公开了来源于溶血巴斯德氏菌的运铁蛋白结合蛋白和编码该蛋白质的核酸分子。也公开了抗该蛋白质的抗体。本发明也涉及包含本发明的蛋白质的疫苗。本发明也提供了用于鉴别影响运铁蛋白结合到所说蛋白质上的物质的方法,以及用于筛选所说蛋白质与运铁蛋白结合的兴奋剂或拮抗剂的方法。
文档编号A61P31/04GK1219969SQ96199846
公开日1999年6月16日 申请日期1996年11月29日 优先权日1995年12月1日
发明者R·Y·C·洛, A·B·施莱维斯, A·A·波特 申请人:R·Y·C·洛, A·B·施莱维斯, A·A·波特