专利名称：螺旋藻多肽的制备方法及其含有这些多肽的药剂和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及螺旋藻多肽的制备方法及其制剂应用，更具体地说，本发明涉及具有多种生理活性的螺旋藻多肽的其酸加成盐及其复合物。本发明还涉及含有至少一种或多种螺旋藻多肽其酸加成盐或其复合物作为活性成分，或可作药用和保健品之用途。
在螺旋藻中有着高含量的藻红蛋白、藻兰蛋白、变藻兰蛋白、以及高含量胶原蛋白。总称为藻蛋白。
由于这些蛋白为肽化合物，因此通常在消化道分解，且由于它们是大分子量聚集态化合物。因此也难以从消化器官被充分吸收利用。
本发明的目的就是提供对螺旋藻的藻蛋白进行化学和生物酶解，制备出比原有藻蛋白更具有各种生理活性的多种小肽。这种生理活性肽又称功能性肽，具有生理调节作用。
本发明的另一个目的就是提供藻胆蛋白的多种小肽具有降血压，降胆固醇，降血脂，抗肿瘤，预防心血管疾病作用，同时具有降血糖，防止肥胖等多种生理活性功能。
本发明的目的之三就是提供一种药用组合物，它含有至少一种或多种小肽作为活性成分。
本发明人经过深入研究达到了本发明的以上目的多种小肽具有多种生理活性作用，以满足作为功能保健食品或药物的要求。
胆固醇是体内必要生理物质除作为细胞膜的成分外，在体内可转化为胆汁酸，类固醇激素和维生素D3。但胆固醇过多，积蓄在血管壁上，会使血管腔变窄，血流通过受阻，食物中的胆固醇进入体内后，需经酶的作用后，变成胆固酸酯才能在肠道吸收，这一过程需要胆汁酸参与。胆汁酸是表面活性物，它对脂类有乳化作用。本发明小肽的活性基团很容易和胆汁酸结合并排出体外，由于胆固醇周围的胆汁酸消失，这种酶就无法使胆固醇转变成容易被肠道吸收的胆固醇。那么为了保持胆汁酸的正常生理含量，人体就必须在肝脏中将胆固醇转换成胆汁酸，其结果是使血液中的胆固醇含量必然下降，而起降脂，降胆固醇作用。
原发性高血压的治疗原则是限制食盐的摄取，可使约有60％的病人血压下降。近几年临床试验证明，血压升高仅和食盐中的氯离子有关，而与钠离子无关，食盐中的氯离子能使血管紧张素转换酶活化，该酶催化血管紧张素I转变为血管紧张素II，血管紧张素II能促进醛固酮分泌，使体内保留钠和水，以致血容量增加，血压升高。本发明的藻蛋白的小肽能与氯离子相作用，而共同排泄于粪便中，使体内缺少氯离子，血管紧张素转换酶无活性，血管紧张素II减少，从而使血压不再升高，起到调节血管作用。
藻蛋白经化学和酶法处理，制得多种小肽的分子中富含氨基，具有碱性。在与胃酸的反应中可生成铵盐，可使肠内pH向碱性侧位移，改善酸性体质。由于胰蛋白不足会引起糖尿病，其患者体液呈酸性。由于这种螺旋藻小肽把pH调节到弱酸性，就能提高胰岛素的利用率，有利于糖尿病的防治。此外，它还有调节内分泌的功能，使胰岛素分泌正常，抑制血糖上升。这种螺旋藻小肽还可排出体内多余糖分，防止肥胖，有利于防止糖尿病。
藻蛋白中的藻红蛋白(R-phycoerythrin)具有(βa)6γ的亚基组成，其最稳定的聚集态分子量是263，000。其藻兰蛋白(C-phycocyanin)具有(βa)6亚基组成，该最稳定的聚集态分子量为224，000。其变藻兰蛋白(allophycicyanin)具有(βa)3的亚基组成，其最稳定的聚集态分子量为104，000。a亚基多肽具有如下完整的162个氨基酸顺序10-Mel-Lys-Thr-Pro-Ile-Thr-Glu-Ala-Ile-Ala-Ala-Ala20-Asp-Asn-Gln-Gly-Arg-Phe-Leu-Ser-Asn-Thr-Glu-Leu30-Gln-Ala-Val-Asn-Gjy-Arg-Tyr-Gln-Arg-Ala-Ala-Ala40-Ser-Leu-Glu-Ala-Ala-Arg-Ser-Leu-Thr-Ser-Asn-Ala50 60-Glu-Arg-Leu-Ile-Asn-Gly-Ala-Ala-Gln-Ala-Val-Tyr70-Ser-Lys-Phe-Pro-Tyr-Thy-Ser-Gln-Met-Pro-Gly-pro80-Gln-Tyr-Ala-Ser-Ser-Ala-Val-Gly-Lys-Ala-Lys-Cys90-Ala-Arg-Asp-Ile-Gly-Tyr-Tyr-Leu-Arg-Met-Vai-Thr100-Thr-Cys-Leu-Val-Val-Gly-Gly-Thr-Gly-Pro-Met-Asp110 120-Gly-Tyr-Leu-Ile-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Ile-Asn-Arg130-Thr-Phe-Asp-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Tyr-Val-Glu-Ala140-Leu-Asn-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-His-Gly-Len-Ser-Gly150-Gln-Ala-Ala-Asn-Glu-Ala-Asn-Thr-Tyr-Ile-Asp-Tyr160-Ala-Ile-Asn-Ala-Leu-Serβ亚基多肽具有如下完整的172个氨基酸顺序10-Met-Leu-Asp-Ala-Phe-Ala-Lys-Val-Val-Ala-Gln-Ala20-Asp-Ala-Arg-Gly-Glu-Phe-Leu-Ser-Asn-Thr-Gln-Leu30-Asp-Ala-Leu-Ser-Lys-Met-Val-Ser-Glu-Gly-Asn-Lys40-Arg-Leu-Asp-Val-Val-Asn-Arg-Ile-Thr-Ser-Asn-Ala50 60-Ser-Ala-Ile-Val-Thr-Asn-Ala-Ala-Arg-Ala-Leu-Phe70-Ser-Glu-Glu-Pro-Gln-Leu-Ile-Gln-Pro-Gly-Gly-Thr80-Ala-Tyr-Thr-Asn-Arg-Arg-Met-Ala-Ala-Cys-Len-Arg90-Asp-Met-Glu-Ile-Ile-Leu-Arg-Tyr-Val-Ser-Tyr-Ala100-Ile-Ile-Ala-Gly-Asp-Ser-Ser-Ile-Leu-Asp-Asp-Arg110 120-Cys-Len-Asn-Gly-Len-Arg-Glu-Thr-Tyr-Gln-Ala-Leu130-Gly-Val-Pro-Gly-Ala-Ser-Val-Ala-Val-Gly-Ile-Glu140-Lys-Met-Lys-Asp-Ser-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Asn-Asp150-Pro-Ser-Gly-Ile-Thr-Thr-Gly-Asp-Cys-Ser-Ala-Len160-Met-Ala-Glu-Val-Gly-Thr-Tyr-Phe-Asp-Arg-Ala-Ala170-Thr-Ala-Val-Glnγ亚基不含有酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)，它的亚基多肽的氨基酸顺序至今还未完全清楚。
在本说明中，氨基酸，多肽及活性基团等均按国际生物化学联合会(IUPAC)的规则以缩写或代号的形式表示。这些缩写或代号的例子如下Arg精氨酸Ala丙氨酸Asn天冬酰氨Asp天冬氨酸Cys半胱氨酸 Gln谷氨酰胺 Glu谷氨酸 Gly甘氨酸His组氨酸Ile异亮氨酸 Leu亮氨酸 Lys赖氨酸Met蛋氨酸Phe苯丙氨酸 Pro脯氨酸 Ser丝氨酸Thr苏氨酸Trp色氨酸Tyr酪氨酸 Val缬氨酸本发明采用从动物、植物、微生物和基因重组微生物中获得的水解蛋白酶，在酸性，碱性或中性环境中或借助于钙、镁、磷、硒、锌、锰离子参与的条件下，水解温度在20～80℃，最佳温度在30～60℃，采用的水解酶有以下来源如胃蛋白酶、胰蛋白酶、溶菌酶等植物来源木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶等等基因重组微生物如Novo Nordisk公司的Flavorzyme，Alcalase水解蛋白酶等，水解酶与藻蛋白的投料比1∶1～100，最好1∶25～40，水解时间1～50小时，最好4～20小时。对螺旋藻所含有藻蛋白进行一次或多次分步骤水解，以获得具有生理活性的单一或数种多肽混合物，一般肽键数不超过50，多数为2～10小肽。其制备工艺流程按
图1或图2，水解方法，可以一步，也可以为多步骤，或按图1或图2方法交叉使用，以获得最大收率的目的肽。按上述各种方法得到的多肽可按照分离多肽时所常用的方法如溶剂萃取法，分配法及柱层法等进行分离和纯化，从而得到本发明所述的各种多肽及各种多肽混合物。
对本发明所述的各种多肽混合物进行一些分离处理，可得到高F值螺旋藻寡肽。F值(Fischer)是指蛋白质分子中支链氨基酸(Branchcdchainaminoacids，简称BCAA)，与芳香族氨基酸(Aromatic amino acids，简称AAA)的摩尔比值。高F值寡肽是蛋白质水解后形成的一种小分子量的非聚合肽；其中支链氨基酸占有较大比例，从而具有独特的生理功能。从大豆蛋白，乳清蛋白，鱼蛋白和玉米醇溶蛋白中获取高F值寡肽的实验已经有报道。本发明以螺旋藻作为蛋白源制备高F值螺旋藻寡肽，尚未见报道。
如此获得的本发明多肽通常以游离态或其盐的形式存在，且具有与相似应的原始天然多肽相类似的生物活性。因此，它们可用作各种药用制品或保健品。可按常规方法将它们转化成可作药用的酸加成盐或复合物。或者把天然多糖如螺旋藻多糖、香菇多糖或环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶……等枝接在按所述的一组小肽上，这组小肽键数为2～11。这组小肽根据其作用可成为肿瘤细胞亲和肽，它们起一种靶向载体作用，经其运载的抗肿瘤物质在肿瘤细胞内有富集现象，提高了药物的生物利用度，增强了药物的抗肿瘤疗效，使抗肿瘤药物在低剂量水平起到高剂量的抗肿瘤疗效，而又没有高剂量时对人体正常细胞的毒副作用，显著提高治疗安全性和有效性。
用于制备上述成盐的例子有无机酸(氢溴酸、盐酸、磷酸)，有机酸(甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸、烟酸、熊果酸、抗坏血酸、壬二酸、油酸、亚油酸)。通过加入某些类型的使多肽具有更好生理活性的无机式有机物质可以制备出上述复合物。用于形成这些复合物的无机物包括钙、镁、锌、硒、钴等金属的无机化合物，尤其是这些金属的磷酸盐、焦磷酸盐、棕榈酸盐，以及其氢氧化物，其它金属的多磷酸盐。所述有机物的物质的例子有非抗原性白明胶，天然多糖如螺旋藻多糖、黄芪多糖、香菇多糖、肌醇六磷酸、多聚谷氨酸、肌苷等。
根据治疗的目的，药剂的类型可在很宽的范围内选择，药用组合物的例子有片剂，粉末，液体，悬浮液，颗粒，胶囊，栓剂，鼻滴液，口腔粘膜吸收剂(如舌下片剂，可咀嚼片剂，锭剂，以及滴液)，及软膏。
为了将该多糖药物的制剂加工成片剂，可使药用载剂，例如赋形剂，如蔗糖、乳糖、氯化钠、葡萄糖、果糖、尿素、淀粉、碳酸钙、膨润土、纤维素、硅酸等，粘合剂如水、乙醇、糖浆、淀粉溶液、明胶、紫胶、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等，崩解剂如藻酸钠、琼脂粉末、昆布粉末、碳酸钙、碳酸氢钙、聚氧乙烯、山梨糖醇酐脂肪酸酯、硬脂酸单甘酯、十二烷基硫酸钠等，崩解抑制剂如蔗糖、氢化油等，吸收促进剂如季胺盐、十二烷基硫酸钠、十二烷基氮卓酮等，润湿剂如甘油、丙二醇等，润滑剂如硬脂酸盐、聚乙二醇等。在制备片剂时，可用常规的包衣材料再制成片剂包衣片，以制成糖衣片、明胶膜包衣片、肠溶包衣片，还可制成膜包衣的片剂或双层片剂。
为了将该多肽药物制成丸剂，也可使用制药领域已知的载体，赋形剂如乳糖、葡萄糖、淀粉、氢化植物油、滑石粉、高岭土、粘合剂如阿拉伯胶、西黄耆胶、明胶等，崩解剂如，琼脂、昆布等。
为了制成胶囊剂，可收本发明的多肽与上述载体混合，将由此得到的混合物添入药用规格的明胶胶囊内或软质胶囊内，以便制成胶囊剂。
为了加工成注射制剂，要对这些多肽活性组分的溶液，乳液或悬浮液进行灭菌消毒，可加入稀释剂，如水、乙醇、聚乙二醇、吐温40、吐温80等。
为了使所需的制剂渗透到人体血液中，可加入适量的粘合剂、稀释剂、推进剂、吸收剂等制成粉末剂、气溶胶型和液体型或半固体型制剂。
为了加工成乳剂、膏剂或凝胶剂，也可使用该领域内广大的药用辅料，如白凡士林、液体石蜡、甘油、聚乙二醇、硅酮、卡伯胶、十二烷基硫酸钠等。
对上述药物制剂的给药方式没有特殊的限制，可根据制剂形式，患者性别年龄和其他状况，症状的程度等进行选用，例如片剂、丸剂、悬浮剂、乳液、颗粒剂和胶囊剂可口服，注射可静脉给药，或与生理盐水、葡萄糖乳液混合。如果需要可肌肉、皮肉、表皮下给药、滴鼻剂可通过吸入鼻腔内给药、口腔粘膜吸收型可用于口腔粘膜部位。
为了更详细地说明本发明，下面将列举三个实施例，但并不限制本发明的范围。
实施例一按图2方法，酶预处理胰酶、胰蛋白酶U2、木瓜蛋白酶U3按U1∶U2∶U3=1∶3～6∶1，加入去离子水，用9％葡萄糖溶液和0．17％氯化钙溶液处理，在28℃下保温2小时，备用。
取螺旋藻粉1000克，加水6升，充分搅拌，分别用0．1盐酸溶液或5％碳酸钠溶液调pH值至8，煮沸1分钟，冷至45℃。将上述酶溶液按酶与底物浓度比E／S=6000U／g量加入螺旋藻混悬液中充分搅拌，45℃保温2～6小时。得酶解液1。将酶解液1煮沸2～10分钟，调pH值至7，分别收集滤液和滤渣。在该滤渣中加入1．5～4倍的去离子水，调pH值至8，按图1方法，按酶与底物浓度比E／S=6000U／g量加入胰蛋白酶溶液，在45℃充分搅拌，保温2～6小时，得酶解液2。将酶解液2煮沸2～10分钟调pH值至7，分别收集滤液和滤渣。合并酶解液1和酶解液2滤液，调pH值至7，按图1方法，按酶与底物浓度比E／S=4500U／g量加入木瓜蛋白酶溶液在50℃下充分搅拌3小时，得酶解液3。将酶解液3调pH值至7，煮沸2～10分钟，分别收集滤液和虑渣。将酶解液3加入相当于螺旋藻干品重量0．07～0．04％的5％氯化钠溶液煮沸1分钟，搅匀后静置过夜。将充分冷却的滤液下部沉淀物放出留作它用，上部澄清液即为活性多肽原液。将此原液用Dtaflo PM-30型超虑膜分离，所得滤液含低聚肽4～11％。此低聚肽溶液经干燥后可制成为片剂、胶囊，或加入调味剂后可以制作口服液(需浓缩至0．9～1．0比重)或可以中药(中药有效充分)如螺旋藻多糖、黄芪多糖、香菇多糖，或其他药物如琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、水杨酸、苯磺酸、烟酸、熊果酸、抗坏血酸、壬二酸、油酸、亚油酸。通过加入某些类型的使多肽具有更好生理活性的无机式有机物质可以制备出上述复合物。用于形成这些复合物的无机物包括钙、镁、锌、硒、钻等金属的无机化合物，尤其是这些金属的磷酸盐、焦磷酸盐、棕榈酸盐，以及其氢氧化物，其它金属的多磷酸盐。所述有机物的物质的例子有非抗原性白明胶，配伍制剂。
蛋白质浓度测定，用紫外光215nm和255nm吸收差法，可测定溶液中所含低聚肽的浓度。按下式计算蛋白质浓度(mg／ml)=0．144(A215～A255)。蛋白质纯度检验用紫外分光光度法，吸收值A280／A260应为1．75。
实施例二从螺旋藻的藻蛋白中制备具有抗高血压制药的活性肽。
按图2方法，螺旋藻粉1000g，加水6升成溶液用甲酸溶液调至pH5．5，煮沸10分钟。将菠萝蛋白酶(自制，酶活性＞3．5×106μ／gμμ)和木瓜蛋白酶(自制，酶活性＞2500μ／g)分别按1∶5～10比例溶于水中加入菠萝蛋白酶6×106μ和木瓜蛋白酶4×10645℃搅拌保温3h小时，50℃搅拌保温1h，然后将酶鲜液煮沸2～10分钟，调至pH7(用5％碳酸钠)。分别收集滤液和滤渣。滤渣可作为下次酶解的原料。在收集滤液中加入硫酸镁适量，在减压下尿素滤液，将浓缩液进行喷雾干燥成粉。采用该工艺得到的螺旋藻多种多肽混合物具有抗高血压作用，可按常规通用的工业制剂方法制成各种上述制剂。
实施例三按图1方法制备高F值螺旋藻寡肽。
螺旋藻粉1000g，加水6升成溶液用甲酸溶液调至pH7．5，煮沸10分钟。冷至70℃，加入Novo Nordisk公司的Alcalase(2．4L)水解蛋白酶6ML，充分搅拌，保温2小时，煮沸5分钟灭菌，得到水解液1，冷却至50℃，用甲醇溶液(20m Mol／L，pH4．0)，或者5％碳酸钠溶液(视具体情况而定)调水解pH值至6。加入Novo Nordisk公司的Flaborzyme(1000ml)水解蛋白酶4ML，搅匀保温2～8h，升温至85℃灭菌5分钟，趁热抽滤。用枸橼酸加入过滤的水解液中，搅匀，调pH值至4．8，并将水解液冷却至60℃。采用活性炭柱，碳／液=4∶10，温度60，去除芳香族氨基酸，然后用1N氨水和无水乙醇按1∶3比例混合洗脱。收集220nm处有最大吸收的部分洗脱液。将上述洗脱液在80℃下减压浓缩至比重1∶10，经真空干燥，至含水15％以下，再经微波干燥至含水分4．5％以下干粉氨基酸自动分析仪和电泳分析，可测定上述主要产品是由支链氨基酸组成的寡肽混合物，可制成片剂。胶囊剂，口服液等剂型。用于肝昏迷脑患者的营养支持以及大强度运动员的体力恢复，以及大面积烧伤患者，创伤失血者的营养支持。
权利要求
1.采用化学与生物酶解相结合方法，对螺旋藻的藻蛋白进行水解，制备出比原来藻蛋白更具有各种生理活性的多种小肽，和高F值螺旋藻寡肽，作为功能保健食品的功能成分或药物。
2.根据权利要求1，水解藻蛋白时采用化学方法是指，在酸性、碱性或中性环境中，借助镁、钙、磷、硒、锌、锰等离子的水解催化作用。生物酶解的水解蛋白酶是动物来源的如胃蛋白酶、胰蛋白酶，溶菌酶等；植物来源的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，无花果蛋白酶等等基因重组微生物如NovoNordisk公司的Flavorzyme，Alcalase水解蛋白酶等。
3.根据权利要求书1和2，水解温度在20～80℃，最佳在35～65℃，水解酶与蛋白酶的投料比1∶1～100，最好是1∶25～40，水解反应时间1～50小时，最好4～20小时。
4.根据权利要求1、2和3所得的小肽，其酸加成盐和其复合物是具有降血压，抗肿瘤，降胆固醇、降血脂、降血糖，预防心血管疾病作用，又有减肥，防止肥胖，用于肝昏迷脑患者的营养支持，大强度运动员的体力恢复，以及大面积烧伤患者，创伤失血者的营养支持等，多种生理活性的药物组合物。
5.根据权利要求1，2，3和4的小肽药物组合物，其特征在于其含有至少一种小肽，其酸加成盐或其混合物作为权利要求4所述生理活性作用。
全文摘要
本发明涉及螺旋藻多肽的制备方法及其制剂应用,更具体地说,本发明采用从动物、植物、微生物和基因重组微生物中获得的水解蛋白酶,在酸性,碱性或中性环境中或借助于镁、钙、磷、硒、锌、锰离子参与的条件下,水解螺旋藻蛋白,得到具有多种生理活性的螺旋藻多肽,或其酸加成盐及其复合物,或作为活性成分,可作药用和保健之用途。
文档编号A61K38/01GK1204651SQ9810240
公开日1999年1月13日 申请日期1998年6月8日 优先权日1998年6月8日
发明者童朗, 刘毅 申请人:刘毅, 童朗