专利名称：新构建的l－天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养的制作方法
技术领域：
本发明是关于新构建的L-天门冬酰胺酶工程菌及其发酵培养方法。
本发明是利用现代生物技术、基因工程方法来构建工程菌，并选择合适的培养基及培养方法使得到的酶活力达到最高水平。
L-天门冬酰胺酶[E.C3.5.1.1]，也称L-天门冬酰胺基水解酶，能专一地催化L-天冬酰胺水解成L-天冬氨酸和氨。
1953年，Kidd发现豚鼠血清有抗肿瘤作用，到了六十年代，Broome证实了豚鼠血清的抗肿瘤因子是血清中的L-天门冬酰胺酶。L-天冬酰胺酶能使敏感肿瘤细胞氨基酸、蛋白质和核酸代谢的紊乱，从而抑制肿瘤生长。1964年，Mashburn从大肠杆菌分离得到该酶，从此开始了从微生物中提取L-天门冬酰胺酶，进行生产及临床的研究。许多临床资料表明L-大门冬酰胺酶对急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、急性变慢性白血病以及若干实质性肿瘤有肯定的治疗作用，特别对儿童急性淋巴细胞白血病有很好的疗效。
我们实验室于1970年开始L-天门冬酰胺酶研究，筛选出一株高产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌菌株，经过发酵培养条件试验，酶活力达到4.6iu/ml，以后进行纯化、工厂中试、纯化酶制剂的动物试验、临床试验，在1973年通过了鉴定，并开始在天津生化制药厂进行生产，在医院里得到了应用。
此后，我们用甲基戊二醇方法获得了该酶的结晶，并对该酶作了一系列的性质试验，酶的分子量是144000，由四个相同的亚基组成，单独的亚基不具备酶活性，酶的等电点是pI4.6，酪氨酸残基是该酶活性的必需基团，处于该酶分子的活性部位，对酶分子的N-端氨基酸组成进行了分析。虽然，L-天门冬酰胺酶已使用多年，但在治疗白血病方面，该酶仍被认为是一个有效的药物，只是在应用中产生了一些问题，如作为异体蛋白的酶的长期使用会刺激免疫系统，对人体产生有害的免疫排斥反应，酶在人体中不稳定性，半衰期短；更为重要的是，菌种产酶活性低而引起酶制剂成本太高，一般病人根本承受不起，这些问题不解决，就会大大限制了酶的广泛使用。
提高菌种产酶能力，可以用多种方法，包括重新筛选优良菌种、通过传统的物理化学的方法进行菌种诱变以及用现代遗传育种技术、基因工程方法来提高菌种的产酶能力等。但是通过国内外专利及文献检索，发现的基因工程方面的报道很少，还没有用工程菌来生产该酶。英国的PublicHealth Laboratory Service Board的Atkinson博士从欧文氏菌(Erwinia chrsyanthemi)的DNA基因库中筛选出L-天门冬酰胺酶基因，构建的重组质粒pASN30，在大肠杆菌和欧文氏菌中进行表达。酶的表达量仅为可溶性蛋白的5-6％，酶活力最高只有20iu/ml.该酶的亚基分子量为32000，等电点pI8.5(EP211639)。美国Purdue大学的Harms博士也构建了产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌工程菌(Protein ExpressionPurification,1991 2(2-3),44-50).所分泌出的酶占细胞可溶性蛋白的10-15％。每立升发酵液能得到10-15mg酶。在国内，中国药科大学的刘景晶等人先后构建了二个产L-天门冬酰胺酶的工程菌。在第一个工程菌中，产酶量仅为6.2-31.8iu/ml，酶蛋白占28.3-35.7％(药物生物技术1995,2(4)8-15)。而在第二个工程菌中，使用了同一个酶的基因来源，但构建在不同的表达载体里，使表达水平有了很大提高，在LB培养基里，能达到106iu/ml。只是在1.5L的生物反应器，酶活力高达400iu/ml。酶蛋白占菌体可溶性蛋白48.3％。酶的分子量为140000。(中国药科大学学报，1996,27(11)696-700)。但这些工作离酶的生产应用仍有很大一段距离，因为所采用的表达质粒含Tac启动子，需要有价格昂贵的IPTG诱导及氨苄青霉素作为选择标记，而在大规模生产时，加上IPTG和氨苄青霉素显然是不合适的。
本发明的目的是构建一株高产L-天门冬酰胺酶的工程菌，其发酵培养基易得，培养方法简单可行，不需化学诱导剂诱导及氨苄青霉素作为选择标记，易于工业化生产，产酶能力强，从而大大降低生产成本，提高经济效益。
本发明的L-天门冬酰胺酶工程菌的构建及发酵培养方法，包括如下一些工艺步骤从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA、引物设计和用PCR方法钓取酶的基因、基因序列测定及重组质粒的构建、重组质粒在几种宿主菌中表达、工程菌的发酵培养。本发明重组质粒的构建及工程菌的培养方法的上述各步详细内容如下1．从产L-天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA产L-天门冬酰胺酶的原始菌株，是由本发明人在实验室筛选而得。是几年前筛选出的一株高产L-天门冬酰胺酶的大肠杆菌菌株，后由天津生化制药厂试生产。该菌种名叫IM-602，在7.5％玉米浆，37℃培养8小时，其产L-天门冬酰胺酶的酶活力每毫升培养液最高能达到4.6单位。
从上述菌种中分离提取染色体DNA的方法，是采用已知技术，详见“DNA探针技术”(美国G.H.凯勒和M.M.马纳克著，孙士勇等人译，科学出版社，1992年出版)。该方法主要是将37℃培养过夜的IM-602培养液离心收集菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/ml,0℃作用15min，加RNase至终浓度100μg/ml,37℃ 30min，加蛋白酶K至终浓度100μg/ml，37℃ 2小时后用苯酚∶氯仿(1∶1)将蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸钠至终浓度为0.2mol/L，加入-20℃预冷的无水乙醇，界面形成云雾状沉淀，即沉淀的DNA，用玻棒顺时针缠绕，放至4℃ TE缓冲液中逆时针解旋下DNA，即得到提取的染色体DNA。2．引物设计和用PCR方法钓取酶的基因制备重组质粒重组质粒的L-天门冬酰胺酶的基因是通过已知PCR方法从上述染色体DNA中扩增而得到。两个引物是根据已报导的大肠杆菌L-天门冬酰胺酶的基因序列及表达质粒的多酶切点而设计的，EcoRⅠ在酶基因的5’端，并在其后设置起始密码子ATG,SalⅠ在酶基因的3’端。其中primer-1:5’-TAGAATTCATGGAGTTTTTCAAGAAGACG-3’primer-2:5’-AAGTCGACATTAGTACTGATTGAAGATC-3’两个引物所设置的酶切位点与表达质粒PBV220的EcoRⅠ和SalⅠ相匹配，适合于在大肠杆菌中高表达。表达质粒pBV220经过用EcoRⅠ和SalⅠ酶切，酶切产物经低熔点胶电泳，切下所需的带，进行纯化。
纯化的经EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA连接酶作用下，连接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ，转化在JM105中，从菌落中提取质粒，用EcoRⅠ,SalⅠ进行酶切鉴定。挑出二个含L-天门冬酰胺酶基因的重组质粒，并命名为pASN(见附
图1)。附图1是本发明工程菌重组质粒pASN的构建图。重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ酶切为大小二个片段，其大小分别与酶基因和pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ的片段大小相一致。
PCR反应染色体DNA模板1.5μg,2.5单位Taq聚合酶，100pmol DNA引物，2.5mM dATPdCTPdGTP和dTTP各1μl，终体积25μl，每循环中94℃变性45s,45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最后一次循环延至10min,共36个循环。
所得PCR产物在1％agarose中电泳，产物大小约为1kb。
所采用的表达质粒pBV220是由中国预防医学科学院病毒所构建的，具有以下特点1)整个质粒为3.66kb2)含有PRPL启动子和cI调控基因3)SD序列后面紧跟多酶切点，便于插入外源基因。
4)含有抗氨苄青霉素基因(Ampr)对重组质粒的L-天门冬酰胺酶基因进行DNA序列分析(见图2)。图2是本发明L-天门冬酰胺酶基因系列，其中一指信号肽序列，口是与E.coliK-12不同的碱基和氨基酸。L-天门冬酰胺酶的结构基因全长为1044bp，与已发表的大肠杆菌K-12的L-天门冬酰胺酶基因序列相比较(David T.Bonthron,Gene91(1990)101-105)。全部核苷酸序列中，有33个碱基不同。在编码的氨基酸序列中，有2个氨基酸改变即27位氨基酸，大肠杆菌K-12为Val27，而大肠杆菌IM-602为Ala27,263位氨基酸，大肠杆菌K-12为Thr263，而大肠杆菌IM-602为Asn263。3．重组质粒在宿主菌中表达重组质粒可转化在大肠杆菌TGl、JM105、IM602等宿主菌中，得到可高效表达L-天门冬酰胺酶的工程菌。其转化的方法和条件如下用CaCl2法分别制备各宿主菌感受态细胞(“分子克隆”)。将1μl重组质粒与200μl感受态细胞混合，于冰上放置30min,42℃90s，后放冰上2min，加入800μlLB培养基，于37℃ 100rpm振荡培养1hr，后取100μl铺于LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置过夜，即得到含重组质粒的工程菌pASN-T,pASN-J,pASN-I。
上述三种不同工程菌均可高效表达L-天门冬酰胺酶。其酶活力可达到120-228iu/ml发酵液。4．工程菌的发酵培养工程菌的培养基是5％-10％玉米浆，尤以7.5％玉米浆最好，0.1-0.5％酵母膏，0.1-0.5％蛋白胨，PH7.0-7.5,15磅压力30分钟灭菌。
用过夜培养的工程菌作为种子液，接种量为0.5-3.0％，尤以1.5％较好，在28-30℃培养4-10小时，使培养物的生长浊度在A600达到2.0-4.0，以3.0为最好，然后在42℃开始诱导，诱导时间为2-6小时，以3-4小时为最好。
上述所得的发酵液的L-天门冬酰胺酶酶活力为每毫升120-228单位。
酶活力测定方法取1ml发酵液，6000rpm离心10min，弃上清，用1ml PH8.4、0.1mol/L的硼酸-硼酸钠缓冲液悬浮菌体。测定步骤1ml0.04mol/L L-天门冬酰胺，0.5ml 0.1mol/L硼酸-硼酸钠缓冲液，0.5ml合适的细胞稀释悬浮液，在37℃保温15min，加入0.5ml 15％三氯乙酸终止反应。离心取上清液1ml，加入在2ml奈斯勒试剂和7ml蒸馏水溶液中，15min后，用1cm比色皿在500nm处比色。
酶活力定义在上述条件下，每分钟催化L-天门冬酰胺释放1微克分子氨所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
通过以上的技术实施，本发明得到了一个含L-天门冬酰胺酶基因的重组质粒pASN，该重组质粒在不同宿主菌，包括TG1、JM105、IM602进行转化，特别是在原生产菌株IM602转化所得工程菌，在发酵培养诱导以后，酶活力高达159-228单位/毫升，是原生产菌株的35-50倍。该工程菌产生的酶特征是分子量为144000，它有四个相同的亚基组成，酶的亚基的氨基酸组成及基因序列与已公开发表的有差别。在全长1044bp中，有33个碱基不同，在编码的氨基酸序列中，有两个氨基酸有差异(27位Ala,263位Asn)。
实施例1按照上述四步工艺方法构建L-天门冬酰胺酶工程菌和培养产生该工程菌，一具体实施例如下首先取已知菌种IM-602利用“DNA探针技术”分离提取染色体DNA。主要是将37℃培养过夜的IM-602培养液离心收集菌体，加溶菌酶至终浓度1mg/ml，0℃作用15min，加RNase至终浓度100ug/ml,37℃ 30min,加蛋白酶K至终浓度100ug/ml,37℃ 2小时后用苯酚∶氯仿(1∶1)将蛋白抽提5-6次，移出水相，加入3mol/L乙酸钠至终浓度为0.2mol/L，加入-20℃预冷的无水乙醇，界面形成云雾状沉淀，即沉淀的DNA，用玻棒顺时针缠绕，放全4℃ TE缓冲液中逆时针解旋下DNA，即得到提取的染色体DNA。
然后用PCR方法钓取酶基因并制备重组质粒。方法如下染色体DNA模板1.5ug,2.5单位Taq聚合酶，100pmol/L DNA引物，2.5mmol/LdATP,dCTP,dGTP和dTTP各1ul，终体积25ul，每循环中94℃变性45s，45℃退火1min,72℃延伸1min45s，最后一次循环延至10min，共36个循环。
所得PCR产物经低熔点胶纯化。经EcoRⅠ和SalⅠ酶切的酶基因片段在DNA连接酶作用下，连接在pBV220/EcoRⅠ+SalⅠ大片段上，得到重组质粒。
将此重组质粒转化在大肠杆菌JM105中，方法如下用CaCl2法分别制备大肠杆菌JM105感受态细胞(“分子克隆”)。将1μl重组质粒与200μl感受态细胞混合，于冰上放置30min,42℃ 90s，后放冰上2min，加入800ul LB培养基，于37℃ 100rpm振荡培养1hr，后取100μl铺于LB平板上(100μg/ml Amp)37℃放置过夜，即得到含重组质粒的工程菌。
最后发酵培养工程菌1个装有2ml玉米浆培养基(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.5)的10ml小试管，经15磅30分灭菌后，接上工程菌斜面，37℃振荡培养过夜。
在250ml三角瓶中，装入50ml同种培养基，15磅30分灭菌，接入0.5ml上述过夜培养液，28℃振荡培养5.5hr，使A600达到3左右，42℃诱导3hr，最后发酵液的L-天门冬酰胺酶活力达到153IU/ml。实施例2本实施例中，方法和条件与实施例1相同，不同之处仅在于工程菌的发酵培养在50立升发酵罐中。
将工程菌斜面接入已灭好菌的8个分别装入50ml培养基250ml三角瓶中，(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.5)37℃，培养过夜。
在50L小罐中，装上25L同种培养基，15磅30分灭菌，接上375ml上述过夜培养液。28℃，培养6.5h，使A600达到3.2,42℃，诱导3.5h，最后所得发酵液的L-天门冬酰胺酶活力达到123iu/ml。实施例3在本实施例中，染色体提取，PCR方法和转化方法与实施例1相同，不同之处仅在于将重组质粒转化在大肠杆菌IM-602中，发酵培养工程菌的方法是1个装有2ml玉米浆培养基(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的10ml小试管，经15磅30分灭菌后，用灭菌牙签从工程菌平板上挑入一单菌落，30℃ 230rpm振荡培养过夜。
在250ml三角瓶中，装入50ml同种培养基，15磅30分灭菌，接入0.75ml上述过夜培养液，30℃ 230rpm振荡培养4hr，使A600达到3左右，42℃诱导4hr，最后发酵液的L-天门冬酰胺酶活力达到228IU/ml。实施例4本实施例中，基本方法和条件与实施例3相同，不同之处仅在于工程菌的发酵培养在50立升发酵罐中。
1个装有20ml玉米浆培养基(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的250ml三角瓶，15磅30分灭菌后，用灭菌牙签从工程菌平板上挑入一单菌落，30℃ 250rpm振荡培养过夜。
8个分别装入50ml培养基(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨PH7.4)250ml三角瓶，15磅30分灭菌后，接入2ml上述培养液，30℃ 250rpm振荡培养过夜。
在50L小罐中，装上25L 同种培养基，15磅30分灭菌，接上300ml上述过夜培养液。30℃，培养5h，使A600达到3.1,42℃，诱导4.5h,最后所得发酵液的L-天门冬酰胺酶活力达到159iu/ml。实施例5本实施例中，基本方法和条件与实施例1相同，不同之处仅在于将重组质粒转化在大肠杆菌TG1中。发酵培养工程菌的方法是1个装有2ml玉米浆培养基(7.5％玉米浆，0.2％酵母膏，0.2％蛋白胨，PH7.4)的10ml小试管，经15磅30分灭菌后，用灭菌牙签从工程菌平板上挑入一单菌落，30℃ 230rpm振荡培养过夜。
在250ml三角瓶中，装入50ml同种培养基，15磅30分灭菌，接入0.75ml上述过夜培养液，30℃ 230rpm振荡培养5hr，使A600达到3左右，42℃诱导3hr，最后发酵液的L-天门冬酰胺酶活力达到203IU/ml。
权利要求
1．一种产L-天门冬酰胺酶的工程菌，其特征在于1)该工程菌是由重组质粒pASN在三种宿主菌TG1、JM105、IM602分别转化而得，2)该工程菌在合适的培养基、合适的培养条件下，具有强的产L-天门冬酰胺酶的能力，其酶活力为120-228国际单位/毫升发酵液，3)该工程菌产生的酶不同于已有的大肠杆菌K-12，酶的分子量为144000，由四个相同亚基组成，亚基基因全长为1044bp，其中有33个碱基不同于大肠杆菌K-12，所编码的氨基酸中二个有差别(Ala27和Asn263)。
2．如权利要求1所述的工程菌重组质粒pASN，其特征在于是由以下方法构建的1)从产L-天门冬酰胺酶的原始菌株E.coliIM-602分离提取染色体DNA，2)用PCR方法从上述染色体DNA中钓取酶的基因。3)将酶基因连接在表达质粒pBV220上。
3．如权利要求2所述的酶基因与表达质粒连接的方法，其特征在于1)PCR所采用二个引物是根据与表达质粒pBV220中EcoRⅠ和SalⅠ的酶切位点相匹配而设计的，并在EcoRⅠ位点后设置起始密码子ATG，2)酶基因的5’端连在表达质粒EcoRⅠ位点上，3’端连在SalⅠ位点上，从而构成重组质粒pASN。
4．如权利要求1所述的工程菌合适培养基是指含5-10％(W/V)的玉米浆，最佳为7.5％,0.1-2.0％(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白胨，pH6.5-8.0.
5．如权利要求1所述的工程菌合适培养条件方法，其特征在于接种量0.3-4.0％，起始培养温度28℃-32℃，培养3-10小时，生物量达到A6001.0-6.0，最佳3.0时，然后42℃热诱导2-8小时，最佳4.5小时，可得到L-天门冬酰胺酶酶活力为120-228单位/毫升的发酵液。
6．一种用权利要求1所述工程菌所生产的酶，其特征在于该酶的分子量为144000，由四个相同亚基组成，亚基基因全长为1044bp，其中有33中碱基不同于大肠杆菌K-12，所编码的氨基酸中二个有差别(Ala27和Asn263)。
7．一种如权利要求1或6所述工程菌生产的酶在制备白血病医药方面的使用，其特征在于在含5-10％(W/V)玉米浆、0.1-2.0(W/V)酵母膏，0.1-2.0％蛋白胨及pH6.5-8.0的基质中，接种0.3-4.0％(V/V)的工程菌，在28-32℃培养3-10小时，然后42℃热诱导2-8小时，得到L-天门冬酰胺酶酶活力为120-228单位/毫升的发酵液，继而纯化所得制剂用于治疗白血病。
全文摘要
本发明是关于新构建的产L－天门冬酰胺酶重组菌及其发酵培养的方法。其中包括从产L－天门冬酰胺酶的菌株中分离染色体DNA，引物的设计，用PCR方法钓取酶的基因，酶基因的序列测定，重组质粒的构建，在几种宿主菌的表达，工程菌的发酵培养。本方法中，所得到的酶基因区别于已报道的该酶基因序列，并在个别氨基酸组成上也有差异；工程菌所采用的培养基便宜易得，发酵方法简单可行，每毫升发酵液可达120—228单位。
文档编号A61K38/43GK1237633SQ9810204
公开日1999年12月8日 申请日期1998年6月1日 优先权日1998年6月1日
发明者钱世钧, 王颖达, 孟广震, 叶军 申请人:中国科学院微生物研究所