含人参皂甙Re组分的药物组合物,其制备方法及应用的制作方法

专利名称：含人参皂甙Re组分的药物组合物,其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有人参皂甙Re组分的药物组合物，其制备方法以及在治疗或预防组织缺血性损伤中的应用。
人参(panax gingseng)、西洋参(panax quinguefolium)和三七(panax notoginseng)等五加科人参属植物的几乎所有部分，例如根、根茎、茎叶、花和果实均含有丰富的人参皂甙。
近二十年来，已对人参属植物的皂甙进行了十分深入地研究，相继分离并纯化了近20种人参属皂甙单体，并对这些单体和/或含有这些单体的组分进行了广泛的生物学活性和药理学作用研究。
人们通常是使用硅胶薄层层析技术，依据总人参皂甙中各组分的荷电性和其极性的不同，在硅胶极上分离出不同的单体成分。并且，一般说来，基于硅胶薄层层析的结果，可将人参总皂甙分为两个不同的组分，其中Rf值在人参皂甙单体Re的Rf值以下的为极性较大的组分1,Rf值在Re处及其以上的为极性较小组分11。组分1主要由人参皂甙-Ro、-Rb1、-Rb2、-Rb3、-Rc及-Rd中的任何几种或所有单体组成，而组分11则主要由人参皂甙-Re、-Rf、-RF11、-Rg1、-Rg2、-Rg3、-RT5，以及极微量的-Rh1和-Rh2中的任何几种或所有单体组成。
因此，在人参皂甙的研究与生产实践中，常常将人参皂甙单体Re作为鉴定人参的品质和检测人参皂甙或制剂中皂甙含量的标准对照物。
人参皂甙是最早鉴定并分离的，并且是性质最明确的人参皂甙单体之一。现已知道，人参皂甙-Re在结构上为一种属于达玛烷型20(s)原人参三醇型的四环三萜化合物。进一步的结构分析证实，其为20(s)-原人参三醇-6-
-20-0-β-D葡萄糖苷。
人参皂甙-Re广泛存在于五加科人参属植物中，例如人参的根、茎叶、花蕾、果实中，三七的根、根茎、芦头中，以及西洋参的根、叶、果实中。其中人参果实、花和花蕾中含量较高，分别为大约6％和大约2.94％。
从人参皂甙的化学和药理学研究角度来说，一般可从上述的不同天然来源制备人参总皂甙，然后再进一步从中分离和纯化人参皂甙单体成分。然而，从医药工业的生产实践角度看，与其以高成本低收率刻意制备医药上有用的人参皂甙单体成分，倒不如以相对较为简便的方法和相对较低的成本制备主要含有某种单体，并且含有少量其他单体或其混合物的组合物，条件是所说的其他单体成分或其混合物对所说组合物中的主要单体成分的理化性质和/或药理学活性没有任何不利影响，并且最好它们之间还具有某些协同或辅助作用。
例如，本发明人的待批中国专利申请98100070号和98100068号分别公开了改良的制备和分离原人参二醇组和原人参三醇组皂甙的方法，以及含有原人参二醇组和三醇组皂甙的药物组合物及其应用。使用这些专利申请中公开的制备方法，可明显地提高从人参总皂甙中分离和制备原人参二醇组皂甙和三醇组皂甙的产物回收率，大大简化生产步骤并降低生产成本。从药物应用角度来看，虽然原人参二醇组和三醇组各自均由六种或六种以上的单体组成，但由于所说的两个组分中的各单体成员在化学结构和物理学性质上的相似性，从而决定了它们各自在药理学和生物学活性上的相近性。例如，大量的药理学研究表明，原人参二醇组皂甙主要具有抗突变、抗自由基、抗氧化及保护生物膜和细胞结构的功能，而原人参三醇组皂甙则主要具有抗辐射和促进合成代谢及抗组织损伤的作用。因此，可在不必分离和纯化单体化合物的情况下，将按所述方法制备的原人参二醇组或原人参三醇组皂甙混合物，加入适当的药学上可接受的载体或赋形剂，以及一种或多种天然或合成的其他活性成分制成用于特定治疗或预防目的的药物组合物。
同众所周知的许多天然药物一样，从包括人参属植物在内的天然植物、动物和矿物及微生物材料中提取的单体化合物的活性常常是与某些相关的次要或辅助成分协同作用并进而联合对靶组织或器官发挥其生物学功能的。因此，在许多情况下，为了更好地保留有效成分的生物学活性，降低天然药物的生产成本，简化生产工艺，常常是将其作为天然药物来源的某些组分，或某个组分或其亚组分，得到与单体化合物有相同或更好的药理学活性的药物组合物，所说的组合物中可以另外加入一种或多种天然或合成的其他活性成分或其混合物。
中国专利申请87108992号(申请日1987年11月24日)公开了从人参果汁中制备人参皂甙-Re单体的方法，该方法包括用乙醇沉淀人参果汁的浓缩溶液后回收乙醇，并用乙醚萃取所得到Re单体粗制品。然后，用硅胶G柱进一步纯化并从甲醇/水(1∶1)中重结晶，得到基本上纯的人参皂甙-Re单体化合物。另外，日本专利申请特开平7-89863号(申请日1993年9月24日)公开了从人参根、叶或花蕾中制备人参皂甙-Re的方法及按所述方法制得的人参甙-Re或其药物组合物在治疗心律不齐中的应用。该专利申请中描述的制备人参皂甙的方法包括浓缩所述药用植物的含水甲醇或含水乙醇或水提取物，将该提取物过柱(D101)并用含水甲醇或乙醇洗脱。将所得洗脱液减压浓缩后得到粗结晶。然后用70％甲醇水溶液重结晶得到人参皂甙-Re纯品。但该专利申请并没有明确说明产物的纯度。
本发明的一个目的是提供一种基本上由人参皂甙-Re组分和医药上可接受的载体和/或赋形剂组成的药物组合物。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，所说的人参皂甙-Re组分含有约占总人参皂甙重量至少80％的人参皂甙Re单体，并且所说的组分中另外含有约占组合物中总人参皂甙重量10％的人参皂甙-Rg2。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说的组合物还含有或不含有一种或多种天然或合成的其他与人参皂甙-Re有协同或辅助作用的活性成分。
本发明的另一个目的是提供一种制备如上文限定的药物组合物的方法，该方法包括提供基本上由人参皂甙-Re和人参皂甙-Rg2组成的人参皂甙-Re组分；然后将所说的人参皂甙-Re组分与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
根据本发明这一目的的一个优选实施方案，其中所说人参皂甙-Re组分的制备方法包括将作为原材料的人参属植物或其部分在低级烷基醇的水溶液中浸提12-72小时；过滤并浓缩所说的浸提液后，用碱金属氢氧化物和适当的吸附材料除去其中的杂质及色素，用高浓度乙醇水溶液沉淀以除去糖和蛋白质，过滤后用适当的有机溶剂萃取并经重结晶后得到所需的人参皂甙-Re组分。
根据本发明的这一优选实施方案，其中所说的人参属植物是人参，且其中所说的植物部分是人参果实。
根据本发明的这一优选实施方案，其中省略重结晶前用有机溶剂萃取的步骤。
根据本发明的这一优选实施方案，其中所说的碱金属氢氧化物是CaOH2或生石灰水溶液(石灰乳)；且其中所说的吸附材料可选自活性碳、硅藻土、高岭土、漂白土及活性氧化铅。
根据本发明的这一优选实施方案，其中所说的用于萃取结晶态人参皂甙-Re组分的有机溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚，但优选的是乙醇乙酯。
根据本发明的这一优选实施方案，其中所说的用于浸泡人参属植物或其部分的低级烷基醇选自甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇和正丁醇。
本发明的再一个目的是提供含有人参皂甙-Re组分的药物组合物在治疗或预防全身或局部组织缺血性损伤中的应用。
根据本发明的这一目的的一个优选实施方案，其中所说的组织包括脑组织、心肌组织、肾组织和四肢组织。
本发明涉及以人参属植物，特别是人参或其部分，如植物的根、茎叶、花蕾和果实为原料，提取并分离人参皂甙-Re组分的方法、含有作为基本活性成分的所说的人参皂甙-Re组分的药物组合物，以及所说的药物组合物在治疗或预防全身或局部组织缺血性损伤中的应用。
本文所使用的术语“人参皂甙Re组分”，是指含有50至95％人参皂甙Re，以及其他极性相关的人参皂甙单体的混合物。根据本发明的一个优选实施方案，其中人参皂甙Re单体含量最好为80％以上，且其中所含有的其他单体选自人参皂甙Rg1、Rg2、Rg3、RT5，以及Rh1和Rh2。
如前所述，包括人参、西洋参和三七在内的五加科人参属植物的根、根茎、茎叶、花和花蕾，以及果实中均含有丰富的人参皂甙，特别是达玛烷型皂甙。目前，已从这些植物或其部分中分离并鉴定了近二十种达玛烷型四环三萜单体化合物，并已对它们的化学结构、理化性质及生物学功能进行了广泛深入地研究。根据这些化合物在硅胶薄层层析(TLC)中的迁移行为(Rf值)，用适当的洗脱剂展开后，可将人参总甙中的单体分离成原人参二醇组和原人参三醇组两大组分。用于区分原人参二醇组分和三醇组分的移行分界点正是人参皂甙-Re在硅胶板上泳动后所处的位置。
人参皂甙-Re最初是由Sanata等人从人参根中分离并进行结构和性质鉴定的(Chem,Pharma,Bult.22,2407-14(1974))。因为该人参皂甙单体在硅胶薄层层析(TLC)平板上经用有机溶剂展开并迁移后，基本上是处于平板的中间位置(由其分子大小和荷电性所决定的)，所以根据其迁移位置前后的人参皂甙单体成分的迁移率的不同，将总人参皂甙大致分为原人参二醇组皂甙和原人参三醇组皂甙两个大的组分。在本发明人于1998年1月22日提交的中国专利申请No.98100070.3中，详细描述了以人参总皂甙为起始材料，制备原人参二醇组和三醇组皂甙的方法。自Sanata等人首先分离并纯化人参皂甙-Re单体化合物以来，人们已用各种不同的方法分离纯化了人参皂甙-Re。特别是近年来对人参皂甙-Re的生物学活性和临床应用价值进行了比较深入地研究，例如裴玉萍等发现并报导了人参皂甙的抗心律不齐作用(JP特开昭7-89863)，从而进一步激发人们对分离和纯化人参皂甙-Re及相关研究的兴趣。然而，包括本发明人的中国专利申请87108002号和日本专利申请特开昭平7-89863号在内的现有技术文献中公开的人参皂甙-Re分离与纯化方法均为比较普遍使用的常规方法。例如，这些方法除包括甲醇或乙醇提取、重结晶步骤外，大多还包括硅胶柱或树脂柱层析地步骤。虽然树脂(例如D101)层析相对于硅胶柱层析来说可构成一个明显地技术进步，例如使用树脂柱在处理上较为简便，且成本较低等，但从工业化大规模生产角度看，仍存在须使用大量的溶剂和时间处理层析柱的问题。
另一方面，尽管日本专利申请特开昭平7-89863中声称可用其公开的方法制得高纯度的人参皂甙-Re单体化合物，并且可能有较高的收率(占原料重量的约0.76％)，但我们的重复实验和比较实验结果表明，其中所述方法很难以获得足够的再现性和高的产物收率与纯度，并且也难以实现大规模工业化生产。特别是如前所述，从工业化生产角度看，按实验室方法制备有很高纯度，例如纯度为95％或以上特别是达到光谱分析纯的人参皂甙-Re，并不一定具有相应提高的产业上的价值。相反，如果将人参皂甙-Re作为人参总皂甙中的一个组分或亚组分，例如作为原人参三醇组皂甙的亚组分来制备，则可能具有更大的应用价值和工业化生产上的可行性。
因此，本发明的一个目的是提供人参皂甙-Re组分，其特征在于其中人参皂甙-Re的含量(重量比)不少于大约80％，并且所说的组分中还含有大约10％(w/w)的人参皂甙-Rg2，以及大约3-5％(w/w)的人参皂甙-Rg1。
我们的研究结果表明，在按本发明的方法制备的人参皂甙-Re组分中，尽管存在少量(例如约10％)人参皂甙-Rg2，以及更少量的人参皂甙-Rg1、-Rh1和-Rh2，但它们对人参皂甙Re的生物学活性没有任何不利影响，相反，这些单体与-Re之间还可能存在一定的协同或辅助作用(数据未示出)。因此，从经济和实际应用角度，以本发明提供的相对简单而有效的方法，从人参属植物或其部分中制备所说的人参皂甙-Re组分，并以该Re组分为基本活性成分，加入一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂，制成适于临床应用的各种不同剂型的药物组合物，是完全可行并且有价值的。
因此，本发明的另一个目的是提供生产上述人参皂甙-Re组分的方法，该方法包括
将作为原料的人参属植物或其部分在低级烷基醇的水溶液中浸泡12-72小时；过滤并浓缩后，用碱金属氢氧化物和适当的吸附材料除去杂质和色素，然后用无水乙醇或高浓度乙醇水溶液沉淀以除去糖和蛋白质，过滤后经用适当的有机溶剂萃取并重结晶，得到所需的人参皂甙-Re组分。
用于制备人参皂甙-Re组分的原料可以是选自人参、西洋参和三七等的人参属植物或其部分，例如这些植物的根、根茎、茎叶、花或花蕾，以及果实。在下文给出的实施例1中，使用人参果实，特别人参果渣作为制备人参皂甙-Re组分的原料。研究发现，人参果实中人参总皂甙的含量约为人参根中人参总皂甙含量的4倍。在我们利用人参果实制备人参果皂甙的实践中发现，人参果实榨汁后残留的人参果渣中仍含有较大量的人参皂甙。因此，为了充分利用人参属植物例如人参资源，可从含有较丰富的人参皂甙的人参果实中榨取人参果汁，用于制备人参果实皂甙或其组分，然后收集榨汁后残留的人参果实残渣，用于制备人参皂甙-Re组分。
根据本发明，为了得到人参皂甙-Re组分，首先将人参属植物如人参或其部分如根、根茎、茎叶、花或果实进行必须的预处理如清洗并切割成适当的碎块或碎片后，浸入低级烷基醇的水溶液，例如含有1-5碳原子的低级烷基醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇或戊醇的水溶液中，但较好是在甲醇或乙醇的水溶液中，室温浸泡12-72小时。然后收集所说的植物或其部分的醇浸提液，使用常规过滤装置过滤后收集滤液，并加入适量的石灰乳(即氢氧化钙在水中形成的乳状悬浮液)将滤液的PH值调到大约10-13。静止约30分钟以除去浸提物中的杂质。然后向此碱化的滤液中加入重量比约为0.3-1.0％的选自活性碳、高岭土、硅藻土、漂白土和活性氧化铝的一种或多种吸附剂，充分搅拌约30分钟并放置12-48小时，以除去所说的浸提液中的色素。为了便于分离，用于本发明的吸附剂最好是活性碳。
然后过滤上述经用吸附剂处理的浸提液，收集滤液后，于强烈搅拌下向其中缓慢加入约4倍体积过量的，浓度≥95％的乙醇，以沉淀析出所说的浸提液中的糖、核酸及蛋白质类物质。静止并析出沉淀后，过滤和/或离心收集上清液，减压下抽吸浓缩滤液并回收乙醇。然后将所得浓缩溶液移入分液漏斗中，向其中加入选自乙醇乙酯、二氯甲烷和乙醚的有机溶液，根据所需的人参皂甙-Re组分在水和这些有机溶剂之间的分配系数的不同，放置约12-48小时后，即可在有机相中析出所需人参皂甙-Re组分的结晶。必要时，可进一步将此结晶物重新溶解于甲醇/水(1∶1)中，重结晶后得到所说的人参皂甙-Re组分。
令人惊奇地是，本发明人在长期的研究实践中发现，为了进一步简化人参皂甙Re组分的分离和纯化步骤，在经过醇浸提和吸附剂吸附，以及高浓度乙醇沉淀后，反复重结晶而不必对所得上清作进一步地乙酸乙酯和乙醚等有机溶剂萃取，即可以足够高的收率得到如上文定义的本发明的人参皂甙Re组分。
因此，根据本发明的一个实施方案，其中可以省略有机溶剂萃取步骤。即按照本发明的方法除初始步骤中使用乙醇浸泡外，继后的步骤不需任何有机溶剂。
TCL分析结果显示，按上述方法制备的本发明的人参皂甙-Re组分含有重量比约为80％的人参皂甙-Re单体，和重量比约为10％的人参皂甙-Rg2。其余10％则主要由少量人参皂甙-Rg1，微量人参皂甙-Rh1和-Rh2，以及其他杂质组成。
与以前普遍使用的常规方法相比，本发明的从人参属植物或其部分中分离制备人参皂甙-Re的方法的主要优点在于，该方法中省去柱层析的步骤，而代之以用石灰乳(氢氧化钙的乳状水悬浮液)和活性炭处理人参属植物材料的浸提液，从而省去了需消耗较多溶剂和时间以处理层析柱的步骤。另外，根据本发明的方法，所需的人参皂甙并不是以完全纯的唯一单体形式制备的，而是以至少包含80％(W/W)人参皂甙-Re单体的混合物的形式得到的。所说的混合物除含有至少80％(W/W)的人参皂甙-Re外，还含有大约10％(W/W)的-Rg2，以及另外约10％(W/W)的-Rg1、-Rh1、-Rh2及微量杂质。比较实验结果证明，使用本发明的人参皂甙-Re组分治疗实验动物(小鼠)的心肌缺血一再灌注损伤，与纯度约98％的人参皂甙-Re单体化合物具有几乎完全相同的效果，而且在个别对照组中甚至可见有更好的治疗效果(参见实验实施例1-3)。
本发明进一步提供以所说的人参皂甙-Re组分为基本活性成分，并含有一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。
可以按照制药工业中已知的方法将本发明的人参皂甙-Re组分与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂按适当比例混合，制成适于临床上使用的不同剂型的药物组合物。例如可将所说的组合物配制成可供静脉内、肌肉内、腹腔内、皮下、脑脊髓腔内和眼内注射给药的注射液，或者制成适于口服给药的片剂、粉末剂、丸剂、胶囊剂和悬浮剂，以及适于局部给药的喷雾剂、霜剂、软膏、酏剂和栓剂。
为了制备适于胃肠道外途径给药的溶液剂，例如可使用蒸馏水、注射用水、等渗氯化钠溶液或葡萄糖溶液，或者低浓度(例如1-100mM)磷酸盐缓冲盐水(PBS)作为载体或赋形剂。可以在这些胃肠道外给药的制剂中加入一种或多种其他辅助成分或添加剂，例如可使用抗坏血酸作为抗氧化剂，使用苯甲酸钠或尼泊金甲酯作为防腐剂，使用二甲基亚砜作为吸收促进剂等。
为了制备适于口服给药的片剂、粉末剂、悬浮剂或栓剂，可以使用蔗糖、半乳糖、玉米淀粉、明胶、脂质、微晶纤维素、滑石粉等作为载体或赋形剂。在这些适于口服给药的制剂中，还可含有其他适当的添加剂，例如增溶剂、崩解剂、润滑剂、吸收促进剂、分散剂、表面活性剂、香味剂或着色剂等。
本发明进一步提供了所说的人参皂甙-Re组分和含有所说的组分的药物组合物在治疗或预防局部或全身性组织缺氧或局部缺血性损伤中的应用。
在使用皮下注射异丙基肾上素造成的小鼠全身性缺氧动物试验模型中，预先给小鼠腹腔内注射不同剂量(5,10和15mg/kg体重)的本发明的人参皂甙-Re组分，约15分钟后，各实验组小鼠皮下注射血管收缩药异丙肾上腺素(20mg/kg体重)。使用只注射生理盐水的动物作为阴性对照组，并分别使用注射β受体阻滞剂普萘洛尔和纯度约98％的人参皂甙-Re单体化合物的动物作为阳性对照组。注射后，将动物置于密闭的缺氧环境下，观察并记录动物存活时间，借以推测本发明的人参皂甙-Re组分对抗血管收缩药诱导的全身性组织缺血一缺氧损伤的能力。实验结果表明，预先腹腔内注射人参皂甙-Re组分，可显著地增强动物对抗异丙肾上腺素所致的全身性组织缺血缺氧，延长动物在窒息环境下的存活时间(P＜0.01)。而且在使用较大剂量人参皂甙-Re组分的情况下，这种抗组织缺血缺氧的能力与注射β受体阻滞剂普萘洛尔的对照组差不多(P＜0.01)。
特别令人感兴趣的是，将高剂量(20mg/kg体重)本发明的人参皂甙-Re组分与我们以前制备的纯度约98％的人参皂甙-Re单化合物相比，在该实验系统中人参皂甙-Re组分似乎表现有更强的抗全身性组织缺氧能力(参见实验实施例1，表1)。
另外，我们还在使用实验性大鼠急性心肌梗塞模型进行的实验中，观察了本发明的人参皂甙-Re组分对实验性大鼠急性心肌梗塞范围及动物血清磷酸肌酸激酶(CPK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响。简单地说，将大鼠于麻醉下以冠状动脉血管结扎法造成急性心肌梗塞模型，然后立即给动物静脉注射不同剂量(5,10,20mg/kg体重)的本发明的人参皂甙-Re组分。以只注射生理盐水的模型动物作为阴性对照组，并以注射我们以前制备的纯度约为98％的人参皂甙-Re单体化合物和复方丹参注射液的动物作为阳性对照组。结扎冠状动脉后24小时从动物体内采血测定CPK和LDH活性，并在处理动物后制备动物心肌组织切片(厚约3mm)，染色后以称重法计算并比较各组动物的心肌梗塞面积。结果显示，本发明的人参皂甙-Re组分可显著地减小大鼠急性实验性心肌梗塞的面积，并且观察到急性心肌梗塞后24小时活体动物血清内CPK和LKH酶的活性(这些酶活性是急性心肌坏死的重要酶学指征)明显低于未处理的对照组动物(参见实验实施例2，表2)，而血浆前列腺素E2(PGE2)的水平则明显升高。与前述实验结果相似，在该实验系统中，本发明的人参皂甙-Re组分，似乎比纯度约98％的人参皂甙-Re单体具有更好的抑制实验性急性心肌梗塞的作用。
最后，还观察了本发明的人参皂甙-Re组分对垂体后叶素诱导的急性心肌缺血大鼠之心电图改变的影响。动物静脉内注射不同剂量(5,10,20mg/kg体重)的人参皂甙-Re，约5分钟后静脉内注射垂体后叶素并监测动物在注射该血管收缩药后20分钟内的心电图改变。结果发现，预先注射不同剂量本发明的人参皂甙-Re组分的动物在注射血管收缩药垂体后叶素后，心肌缺血的典型心电图改变(ST段升高和T波高耸)受到明显抑制(参见实验实施例3，表3)。
尽管有关人参皂甙-Re组分抑制全身组织，特别是心肌和脑组织局部缺血性损伤的作用机制目前尚不完全明了，但我们以前的另一项研究显示，在结扎大鼠锁骨下动脉造成的脑组织缺血动物模型中，投用人参皂甙-Re组分的实验组动物的血清超氧化物歧化酶活性较对照组明显升高，而脂质过氧化代谢产物丙二醛的水平则显著降低，故推测人参皂甙-Re组分对大鼠脑组织缺氧血性损伤的保护作用可能与抑制氧自由基和脂质过氧化作用有关。另外，在大鼠心肌缺血模型中，观察到未处理组动物血浆前列腺素E2(PGE2)水平明显升高，而预先注射人参皂甙-Re组分的对照组则比PGE2水平升高受到显著地抑制，表明人参皂甙-Re组分可能是通过抑制PGE2诱导的冠血管血容量减少、心肌细胞膜结构破坏及增加心肌细胞Ca2+负载和加速心肌细胞内蛋白质降解等病理性损伤作用而发挥其功能的。
值得进一步提到的是，鉴于本发明初步证明人参皂甙-Re组分与基本上纯的人参皂甙-Re单体化合物相比具有更好的抗局部或全身性组织缺血一缺氧活性(参见下文实验实施例1和2)，故可望使用人参皂甙-Re组分，而不是基本上纯的人参皂甙-Re单体化合物作为基本活性成分，用于制备治疗和预防脑、心脏、肾和肢体等组织局部缺血性损伤的药物组合物，并可望用本发明的以人参皂甙-Re组分作为基本活性成分的药物组合物代替目前临床上普遍使用的某些天然药物组合物，例如复方丹参注射液。尽管不拘泥于理论，但推测人参皂甙-Re组分的上述优点可能是由于人参皂甙-Re与所说的人参皂甙-Re组分中少量-Rg2和-Rg1等单体成分之间存在某些协同和/或辅助作用所致。
以下实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。
制备实施例1以人参果渣为原料制备人参皂甙-Re组分本实施例描述以人参果为原料制备人参皂甙-Re组分的方法。首先在用于从人参果实中制备人参果皂甙后残留的人参果实残渣(约1000g)中加入适当量80％(V/V)乙醇，混匀后于室温下浸泡约24小时。用常规过滤装置抽吸过滤所得浸泡液以除去不溶物。在所得的澄清滤液中加入少量石灰乳(CaOH2含水悬浮液)将其PH调到大约12，然后加入活性碳(8.0g)，并充分搅拌10分钟。将此混合物室温放置24小时后用布氏漏斗减压过滤。收集滤液并在其中加入很少量6N盐酸将滤液调至PH=7，然后减压下抽吸回收乙醇并浓缩该滤液。持续搅拌下，向所得浓缩液中加入约4倍体积的95％乙醇，直到析出可见的沉淀物，并再次过滤(G4漏斗)除去这些沉淀物。收集滤液并于减压下浓缩后，将所得浓缩液加于分液漏斗中，并在其中加入乙醇乙酯(20ml)。反复振荡所得混合物并放置约10分钟，可见逐渐有白色结晶析出。过滤收集该结晶物并将其溶解于甲醇/水(1∶1)中，重结晶后得到3.2g人参皂甙-Re组分。
硅胶薄层层析结果显示，按上述方法制得的人参皂甙-Re组分中含有人参皂甙-Re单体约80％，-Rg2单体约10％，-Rg1单体5％，其余2％为很少量人参皂甙-Rh1、-Rh2及微量杂质。
制备实施例2以人参茎叶为原料制备人参皂甙-Re组分本实施例描述以人参植物的茎叶为原料，基本上按实施例1中所述的方法制备人参皂甙-Re组分。简单地说，将新鲜人参茎叶洗净并风干后切成碎片(约1000g)，向其中加入90％(V/V)乙醇并于室温下浸泡48小时。用常规过滤装置过滤该浸泡液以除去植物残渣及其他不溶物。向澄清的滤液内加入1N氢氧化钠溶液，调至PH11。然后向滤液内加入约7.5g活性炭并搅拌15分钟。将所得混合物室温放置过夜后用G3漏斗减压过滤。收集滤液加入50％(V/V)盐酸水溶液将滤液调至PH7.5。然后于减压下抽吸回收乙醇得到浓缩液。持续搅拌下向所得浓缩液内加入约4倍体积的95％乙醇，以沉淀其中的糖和蛋白质。过滤除去沉淀物后，收集滤液并减压浓缩。将此浓缩的溶液加于分液漏斗中，并在其中加入约20ml乙醚，经强烈搅拌后逐渐析出结晶。将所得结晶物溶于甲醇/水(1∶1)中，重结晶得到约3.0g白色结晶状人参皂甙-Re组分。
硅胶薄层层析分析结果显示，按上述方法制得的人参皂甙-Re组分含有约82％的人参皂甙-Re，约10％的人参皂甙-Rg2，约5％的人参皂甙-Rg1，以及约3％的人参皂甙-Rh1、-Rh2及微量杂质。
制备实施例3以非溶剂萃取法从人参果渣中制备人参皂甙Re组分基本上按照实施例1中所述的方法，以人参果实榨叶后残留的人参果实残渣(1000g)中提取人参皂甙Re，但不同的是其中省略重结晶前用乙酸乙酯或乙醚萃取的步骤。
硅胶薄层层析结果显示，按本实施例所述方法制得的人参皂甙Re组分含有人参皂甙Re单体约81％，-Rg2单体约为11％,-Rg1单体约为6％，-Rh1,-Rh2及其他杂质约为2％。
实验实施例1人参皂甙-Re组分对异丙基肾上腺素诱导的小鼠全身性缺氧耐受能力的影响将70只体重约19-21克的雄性小鼠随机分为7组，每组各10只。三个实验组分别腹腔内注射本发明的人参皂甙-Re组分5,10和20mg/kg体重。空白对照组注射等体积(2ml)生理盐水；同时两个治疗对照组分别腹腔内注射纯度约98％的人参皂甙单体化合物20mg/kg体重和β受体阻滞剂普萘洛尔(propranolol)10mg/kg体重。给药后15分钟，除空白对照组外，其余各组的动物均皮下注射异丙肾上腺素20mg/kg体重。再经15分钟后，将各组动物几乎于同一时间分别放入装有钠石灰(10g)的250ml密闭的广口瓶内，立刻观察并记录动物的存活时间。结果如下列表1所示。结果以心肌梗塞面积(mm2)或血清酶浓度(单位/升)的平均值±标准差表示(n=8-10)。
表1人参皂甙-Re组分对异丙肾上腺素诱导的大鼠全身缺氧的影响
*与异丙肾上腺素组相比较P＜0.01从上列表1中可以看出，皮下注射异丙肾上腺素可显著缩短小鼠在常压缺氧环境下的存活时间，与只注射生理盐水的阴性对照组相比，差异特别显著(P＜0.01)。预先在小鼠体内注射本发明的人参皂甙-Re组分10或20mg/kg体重可有效地对抗继后皮下注射异丙肾上腺素导致的动物全身性缺氧状态，从而大大延长动物在常压乏氧环境下的存活时间，与预先注射β受体阻滞剂普萘洛尔(10mg/kg体重)的对照相比，其作用十分相近，但注射低剂量人参皂甙-Re组分的实验组所表现的治疗作用并不明显。另外，从表1所示的结果还可以看出，在同样条件下，本发明的人参皂甙-Re组分的作用似乎优于基本上纯的(纯度约98％)人参皂甙Re单体化合物。
实验实施例2人参皂甙-Re组分对实验性大鼠急性心肌梗塞的保护作用将体重约250-300g的雄性大鼠70只随机分成7组，每组各10只。按已知方法在乙醚麻醉下仰位固定于手术台上，自左侧3-4肋间开胸，暴露心脏，以0号线立即结扎冠脉左前降支。然后将心脏迅速送回胸腔，挤出胸腔内血液和气体，并关闭胸腔。整个手术在1分钟内完成。于结扎后分别舌下静脉注射人参皂甙Re单体5、10、20mg/kg及本发明的人参皂甙-Re组分(20mg/kg)和复方丹参注射液(2g/kg)，12小时后再给药1次。待结扎冠脉24小时后，以戊巴比妥钠30mg/kg(ip)麻醉，腹主动脉采血，并测定血清CK和LDH。同时取出心脏，生理盐水冲洗后将左室肌横切3-4薄片，切片用氯化硝基四氮唑兰(N-BT)染色，并计算坏死心肌占心室湿重百分率，计算梗塞面积(％)。结果如下列表2所示。
表2人参皂甙-Re组分对大鼠急性心肌梗塞的保护作用
*与模型组比较*P＜0.05,P＜0.01料与空白对照组比较**P＜0.01从上表所示结果可以看出，人参皂甙-Re对实验性急性心肌梗塞动物模型的心肌梗塞面积，以及作为心肌急性缺血性坏死生物化学指征的CK和LDH酶活性均表现有明显地抑制作用。另外，从表2所示结果还可以看出，人参皂甙Re无论是单化合物还是含有人参皂甙-Re及其他单体化合物的组合物，对急性心肌梗塞的保护作用均明显好于传统的中药复方丹参注射液。还值得进一步提到的是，本发明的人参皂甙-Re组合物的上述作用似乎优于基本纯(98％纯度)的人参皂甙-Re单体化合物。
实验实施例3人参皂甙-Re组分对大鼠的实验性急性心缺血后心电图变化的影响将平均体重约105g的雄性和雌性Wistar大鼠各25只随机分成5组，每组各10只。三个实验组分别经舌下静脉注射本发明的人参皂甙-Re组分(5,10,20mg/kg体重)。阴性对照组注射等体积的生理盐水(1ml)。阳性对照组注射抗心律失常药维拉帕米(Verapamil)(10mg/kg)。5分钟后，各组动物分别静脉注射垂体后叶素(沈阳生物化学制药厂)(1单位/kg)，并以恒定速度于10秒钟内注射完毕。于注射垂体后叶素后15秒、30秒和1、2、5、20分钟描记动物的心电图。下列表3中显示了静脉注射垂体后叶素后30秒钟动物心电图的ST段和T波变化。结果以心电毫伏(mV)数的平均值±标准差表示(n=10)。
表3人参皂甙-Re组分对垂体后叶素诱发的急性心肌缺血大鼠心电图的影响
与对照组比较*p＜0.05,**p＜0 01,***p＜0.001从表3所示的结果可以看出，给动物投用本发明的人参皂甙-Re组分可明显抑制继后垂体后叶素诱发的大鼠急性心肌缺血性心电图改变(ST段抬高和T波高耸)。即预先注射人参皂甙-Re组分后，可有效地抑制血管收缩剂引起的急性冠血管痉挛，进而缓解急性心肌缺血。
gua管收缩剂引起的急性冠血管痉挛，进而缓解急性心肌缺血。
权利要求
1.基本上由人参皂甙-Re组分和医药上可接受的载体和/或赋形剂组成的药物组合物。
2.根据权利要求1的药物组合物，其中所说的人参皂甙-Re组分含有占组合物中人参皂甙总重量约50至95％的人参皂甙-Re单体，以及选自人参皂甙Rg1、Rg2、Rg3、RT5，以及Rh1和Rh2的一种或多种其他人参皂甙单体。
3.根据权利要求1的药物组合物，其中还可含有一种或多种天然或合成的其他与人参皂甙-Re有协同或辅助作用的活性成分。
4.制备权利要求1至3中任何一项限定的药物组合物的方法，该方法包括提供基本上由人参皂甙-Re和人参皂甙-Rg2及-Rg1组成的人参皂甙-Re组分，然后将所说的人参皂甙-Re组分与一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂相混合。
5.根据权利要求4的方法，其中所说的人参皂甙-Re组分的制备方法包括将作为原材料的人参属植物或其部分在低级烷基醇的水溶液中浸提12-72小时；过滤并浓缩所说的浸提液后，用碱金属氢氧化物和适当的吸附材料除去其中的杂质及色素，用高浓度乙醇水溶液沉淀以除去糖和蛋白质；过滤后用适当的有机溶剂萃取并经重结晶后得到所需的人参皂甙-Re组分。
6.根据权利要求5的方法，其中所说的人参属植物是人参且其中所说的植物部分是人参果实。
7.根据权利要求5的方法，其中所说的碱金属氢氧化物是CaOH2或生石灰的水溶液，且其中所说的吸附剂选自活性碳、硅藻土、高岭土、漂白土及活性氧化铝。
8.根据权利要求5的方法，其中用于萃取结晶态人参皂甙-Re组分的有机溶剂选自乙酸乙酯、二氯甲烷和乙醚。
9.根据权利要求5的方法，其中所选的方法可省略重结晶前用有机溶剂萃取的步骤。
10.根据权利要求1至3中任何一项所限定的药物组合物在治疗或预防全身或局部组织缺血性损伤中的应用。
全文摘要
本发明公开了含有人参皂甙－Re组分和一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物,其制备方法及在预防和治疗全身或局部缺血性损伤中的应用。根据本发明的一个优选实施方案,其中所说的人参皂甙－Re组分基本上由占组合物中总人参皂甙含量80%的人参皂甙－Re、10%的人参皂甙－Rg
文档编号A61P9/10GK1209996SQ98117830
公开日1999年3月10日 申请日期1998年8月28日 优先权日1998年8月28日
发明者马兴元, 尹立签, 张益胜 申请人:吉林省集安制药有限公司