专利名称：冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及病毒性疫苗的医用生物制品，具体涉及一种甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法。
甲型肝炎(甲肝)是一种极易传染和流行的疾病，一旦传播很易造成大流行。此病主要发生在发展中国家，在一些发达国家的发病人数也较多。我国35岁以上的成年人，甲肝抗体阳性率达90％以上，常引起季节性的流行。近年来，随着经济的发展，居住的小环境有所改善，但大环境中引起甲肝的甲型肝炎病毒的污染及散布条件却依然存在且更为严重，单纯靠改善卫生条件难以预防解决甲肝严重流行的问题。因此，发展安全有效的甲肝疫苗是目前预防甲肝的主要措施。
自1973年，Feinstone等发现肝炎病毒(Hepatitis A Virus)是传染性肝炎的的病原体，1979年Provost在体外分离培养肝炎病毒，获得了甲肝病毒株后，为甲肝疫苗的研制开辟了道路。目前，世界上有两类甲型肝炎疫苗，即甲型肝炎减毒活疫苗和甲型肝炎灭活疫苗，国外主要发展灭活疫苗，而活疫苗仅有中国、美国等少数国家在研究和生产。这两种疫苗各有优缺，减毒活疫苗的缺点是稳定性差，有效的保存期限短，必须在冷冻条件下保存和运输，优点是价格便宜，免疫原性好，有细胞免疫功能。灭活疫苗的优点是免疫原性很强，免疫后体液抗体很高，疫苗稳定，保存期较长，缺点是细胞免疫功能不如减毒活疫苗，且价格昂贵。我国于1978年开始研究甲肝减毒活疫苗，“七五”期间被列为国家重大科技攻关计划项目，由浙江省医学科学院、中国医学科学院生物学研究所以及中国药品生物制品检定所合作，选育出了二株(H2株和LA-1株)，并在“八五”、“九五”期间继续进行了大量研究和临床试验，结果表明，国产的两种甲肝减毒活疫苗安全可靠、免疫性良好，其免疫效果与国外灭活疫苗相同。
但从现在国产的两种甲型肝炎减毒活疫苗看，均为液体剂型，其热稳定性较差，不同滴度的疫苗从实验检定到现场注射，感染性滴度都有不同程度的下降，平均下降0.5logCCID50/ml左右，减度活疫苗在2-8℃条件下仅能有效保存三个月，-20℃保存期限仅1年。因此，使产品的推广和应用受到很大限制。查新检索结果表明，近年来仅见日本有甲型肝炎灭活疫苗的冷冻干燥剂型的研究及商品，未见有冻干甲型肝炎减毒活疫苗的研究报道。
本发明的目的在于提供一种热稳定性好，便于运输和保存的冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现本发明包括液体甲型肝炎减毒活性疫苗和冻干保护剂，冻干保护剂配方如下(W/V)海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明胶0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化钠0.145克，氯化钾0.185克，磷酸氢钠0.895克，磷酸二氢钾0.34克，双蒸馏水100毫升，其中的氨基酸可为甘氨酸和/或精氨酸和/或赖氨酸。
本发明的制备方法包括以下步骤1、配制冻干保护剂将海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明胶0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化钠0.145克，氯化钾0.185克，磷酸氢钠0.895克和磷酸二氢钾0.34克加入到100毫升双蒸馏水中，其中氨基酸可为甘氨酸和/或精氨酸和/或赖氨酸；2、取现有的液体甲型肝炎减毒活疫苗与上述保护剂按体积比为1∶1的比例混合均匀后待用；3、在压力为15磅、温度为112℃-115.6℃的条件下灭菌30分钟后，在37℃的条件下培养7天备用；4、将冻干箱内温度预先降至-4℃，将分装好的疫苗与保护剂的混合液放入冻干箱内，以0.37℃/分钟的速度降温度至-30℃，维持2小时后，抽真空至8×10-3托时，以0.3℃/分钟的速度将温度升至-4℃后，维持14小时，在此期间每隔1小时抽真空1次至0托，并检测水份含量，当残余水份≤3％时，升温至20℃，升温速度为0.24℃/分钟，并维持7-9小时后，塞上瓶塞，出箱即可，整个冻干过程为25-48小时。
下面对本发明的试验条件及方法等技术细节作详细描述1、生产疫苗用毒种及毒种继代生产疫苗用毒种是已经大规模用于制造甲型肝炎减毒活性疫苗的甲型肝炎减毒活疫苗减毒株——H2株，由中国药品生物制品检定所和卫生部指定的单位保管、发放。经过卫生部批准符合疫苗制造要求的人二倍体细胞(KMB17)繁殖，病毒的繁殖周期为28天。冻干疫苗生产用的病毒代次为7代(H2M20K7)，允许使用的代次为7-14代，即H2M20K7-H2M20K14。
(1)毒种检定早代毒种、生产用毒种由生产部门、质量检定部门会同检测。
(2)无菌试验按《生物制品无菌试验规程》进行。
(3)病毒滴度取毒种样品，作10倍系列稀释，取至少三个稀释度分别接种人二倍体细胞，在35℃培养至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫荧光等检定所认可的方法判定结果。病毒滴度应大于6.5logCCID50/ml方可使用。
(4)纯毒试验用甲肝病毒特异性高效价免疫血清及甲肝抗体阴性血清与500-1000logCCID50/ml甲肝病毒等量混合，置于37℃水浴中60分钟，接种人二倍体细胞，35℃培养至病毒增殖高峰期，用ELISA或免疫荧光法或其他方法判定，结果甲肝病毒应完全被中和。
(5)外原因子检查①血吸附试验每消化一批细胞应留5％(不少于500ml)作为细胞对照，观察细胞至少14天。取其中25％培养瓶于第七天时，用鸡、豚鼠红细胞混合液进行吸附试验，于4-8℃放置30分钟后判定，如为阴性，再移至20-25℃放置30分钟后判定，结果应为阴性。
凡有可疑细胞病变或血吸附试验可疑阳性者，应用同种不同批的细胞，另取10ml接种人和猴传代细胞，各留一瓶细胞在对照，置于35-37℃观察14天，结果应为无细胞病变。
②非血吸附病毒检查在对照细胞观察结束后，取10ml细胞培养合并液，接种同种不同批的细胞，另取10ml接种人和猴传代细胞，各留一瓶细胞作对照，置于35-37℃观察14天，结果应为无细胞病变。
③病毒液外原因子检查取纯毒试验中和后的病毒液接种人、猴传代细胞及同种不同批的人二倍体细胞，各设未接种的细胞作对照，观察14天。若未证明有外源因子，并在观察期间因非特异性原因废弃的细胞不超过20％，试验为通过。
④猴体试验每早代毒种、生产用毒种批做猴体试验。取HAV抗体阴性，ALT指标正常，体重1.5-4.5kg的健康恒猴或红面猴5只，于下肢静脉注射1.0ml毒种样品。猴体于0、4、8周肝穿做组织病理检查。0、2、4、6、8周采血检测ALT及HAV抗体。
判定符合下列情况者判定合格。
a、至少4只猴血抗体阳转；b、血清ALT有一过性(1周次)升高者超过2只猴；c、肝组织无与接种样品有关的病理改变。
有下列情况者应重试a、接种猴抗体阳转率低于4/5；b、抗体阳转率前后两周内血清ALT异常升高超过两周次；d、试验猴不能排除其它原因所致的肝组织病理改变。
重试方法与初试相同，重试后仍出现上述情况之一者，判定不合格。
⑤免疫原性检测每代生产用毒种制备的首批疫苗，按常规接种甲肝易感染者，于免疫前、免疫后6-8周采血，血清抗体阳转率不应低于95％，可供分析人数不少于40人。如不合格，该批生产用毒种及所制备的疫苗均应废弃。
2、疫苗制造(1)人二倍体细胞所用细胞为卫生部批准的人二倍体细胞株，如KMB17等人二倍体细胞株。二倍体细胞传代，使用及检定按《中国生物制品规程》“人二倍体细胞建株，检定及制备疫苗规程”中“B二倍体细胞用于疫苗生产的要求”进行。
(2)培育方法取生产用毒种按一定比例稀释，接种于人二倍体细胞，35℃培养至病毒增殖高峰期间，洗换培养液。疫苗液经过冻融及超声波等后处理即可。
3、配制保护剂将保护剂各组份按常规方法配制成溶液后，15磅高压灭菌30分钟后，在37℃的温度条件下培养7天备用。
4、疫苗冻干取上述检测合格的液体疫苗按体积比1∶1的比例加入保护剂，混合均匀后及时在冰浴中进行分装，每只西林瓶中装1ml混合液，然后采用适宜的冻干工艺进行冻干处理后即可。
5、产品的检验(1)物理检验产品应为白色疏松体，溶解后应为无色透明、澄清无异物的液体。
(2)残余水份含量≤3％。
(3)无菌检查按《生物制品无菌试验规程》进行，成品不做支原体检查。
(4)病毒滴定及稳定性试验每批冻干疫苗，取3-5支样品混合进行病毒滴定，再取3-5支放37℃7天，与前者同时进行病毒滴定。置于37℃下放7天后滴度下降不得超过1个logCCID50/ml，疫苗滴度不得低于logCCID50/ml。
(5)安全试验用1-16g小白鼠4只，每只腹腔注射1ml，注射后应密切观察，30分钟内不应有异常反应，观察3天应健康存活。
(6)残余牛血清蛋白含量测定用检定所认可的方法测定，残余牛血清蛋白含量应≤50ng/ml。
实施例1(1)按下列组分配制保护剂溶液(W/V)
海藻糖 2克 赖氨酸 0.5克明 胶 0.2克 人白蛋白1克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克双蒸馏水100毫升上述配制好的保护剂溶液在压力为15磅、温度为112℃条件下高压下灭菌30分钟后，在37℃的条件下培养7天后待用。
(2)在100级超净台内将液体甲型肝炎减毒活疫苗与配制好的保护剂按体积比为1∶1的比例混合均匀后，分装在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1ml。
(3)将冻干箱内温度预先降至-4℃，将分装好的疫苗与保护剂的混合液放入冻干箱内，以0.37℃/分钟的速度降温度至-30℃，维持2小时后，抽真空至8×10-3托时，以0.3℃/分钟的速度将温度升至-4℃后，维持14小时，在此期间每隔1小时抽真空1次至0托，并检测水份含量，当残余水份≤3％时，将温度高至20℃，升温速度为0.24℃/分钟，并维持7-9小时后，塞上瓶塞，出箱即可。整个冻干过程持续48小时。
实施例2(1)按下列组分配制保护剂溶液(W/V)海藻糖 6克 精氨酸 1克明 胶 0.5克人白蛋白 0.8克NaCl0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克双蒸馏水100毫升上述配制好的保护剂溶液在压力为15磅、温度为115.6℃条件下高压下灭菌30分钟后，在37℃的条件下培养7天后待用。
(2)在100级超净台内将液体甲型肝炎减毒活疫苗与配制好的保护剂按体积比为1∶1的比例混合均匀后，分装在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)将冻干箱内温度预先降至-4℃，将分装好的疫苗与保护剂的混合液放入冻干箱内，以0.37℃/分钟的速度降温度至-30℃，维持2小时后，抽真空至8×10-3托时，以0.3℃/分钟的速度将温度升至-4℃后，维持14小时，在此期间每隔1小时抽真空1次至0托，并检测水份含量，当残余水份≤3％时，将温度高至20℃，升温速度为0.24℃/分钟，并维持7-9小时后，塞上瓶塞，出箱即可。整个冻干过程持续48小时。
实施例3(1)按下列组分配制保护剂溶液(W/V)海藻糖 14克 甘氨酸 4克明 胶 0.8克 人白蛋白0.4克NaCl 0.145克 KCl 0.185克Na2HPO40.895克 KH2PO40.34克双蒸馏水 100毫升上述配制好的保护剂溶液在压力为15磅、温度为113℃的条件下高压下灭菌30分钟后，在37℃的条件下培养7天后待用。
(2)在100级超净台内将液体甲型肝炎减毒活疫苗与配制好的保护剂按体积比为1∶1的比例混合均匀后，分装在西林瓶中，每瓶一人份，每瓶1毫升。
(3)将冻干箱内温度预先降至-4℃，将分装好的疫苗与保护剂的混合液放入冻干箱内，以0.37℃/分钟的速度降温度至-30℃，维持2小时后，抽真空至8×10-3托时，以0.3℃/分钟的速度将温度升至-4℃后，维持14小时，在此期间每隔1小时抽真空1次至0托，并检测水份含量，当残余水份≤3％时，将温度高至20℃，升温速度为0.24℃/分钟，并维持7-9小时后，塞上瓶塞，出箱即可。整个冻干过程持续48小时。
上述实施例给出了本发明的优选操作条件，但本发明的技术内容不受实施例的局限。表1冻干剂型与液体剂型的甲肝减毒活性疫苗在45℃下感染性滴度变化疫苗批号 45℃0天 45℃1天 45℃3天(logCCID50/ml) (logCCID50/ml)(logCCID50/ml)960112 6.836.8 5.33960112液体苗6.835.17 ＜4.0960122 7.0 7.0 5.83960122液体苗7.0 5.5 ＜4.0960227 7.5 7.33 6.17960227液体苗7.5 6.33 ＜4.0表2冻干剂型与液体剂型甲肝减毒活性疫苗在37℃下感染性滴度变化单位(logCCID50/ml)疫苗批号 0天 2天 5天 7天 10天 14天 21天 30天9607036.7 6.7 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 4.59607036.7 6.7 6.33 5.83 5.55.04.5 ＜3.0(液体苗)9607047.0 7.0 7.0 6.8 6.67 6.56.17 5.09607047.0 7.0 6.83 6.33 6.05.77 5.0 3.67(液体苗)9607056.67 6.67 6.67 6.7 6.33 6.17 5.83 ＜4.09607056.67 6.67 6.5 5.83 5.17 4.0＜3.0＜3.0(液体苗)9703167.67 7.67 7.7 7.6 7.33 7.05.83 ＜4.09703167.67 7.67 7.5 6.77 6.04.33 ＜3.0＜3.0(液体苗)9706246.0 6.0 6.0 5.83 5.55.04.0 ＜3.09706246.0 6.0 6.0 5.17 4.53.5＜3.0＜3.0(液体苗)9708216.5 6.5 6.5 6.33 6.05.54.17 ＜3.09708216.5 6.5 6.33 5.5 4.46 3.5＜3.03.0(液疫苗)9709116.83 6.83 6.77 6.77 6.33 6.04.5 ＜3.09709116.83 6.83 6.5 5.67 4.53.5＜3.0＜3.0(液体苗)表3冻干剂型与液体剂型甲肝减毒活性疫苗在室温下感染性滴度变化单位(logCCID50/ml)疫苗批号0周 2周 4周 8周 12周960703 6.7 6.7 6.7 6.33 5.0960703 6.7 6.175.334.0 ＜3.0(液体苗)960704 7.0 7.0 7.0 6.5 5.0960704 7.0 6.676.0 5.0 4.0(液体苗)960705 6.67 6.676.676.5 5.33960705 6.67 6.175.5 4.5 3.0(液体苗)970316 7.67 7.677.5 7.5 6.0970316 7.67 7.676.775.5 4.0(液体苗)970911 6.83 6.836.676.5 5.33970911 6.83 6.836.175.0 4.0(液体苗)表4冻干剂型与液体剂型甲肝减毒活性疫苗在2-8℃下感染性滴度变化单位(logCCID50/ml)疫苗批号0天对照 6月 12月 18月 24月960112 6.83 6.836.8 6.77 6.5960112液体苗6.83 6.5 5.23 ＜3.0＜3.0960122 7.0 7.176.83 7.0 7.0960122液体苗7.0 6.675.5 ＜3.0＜3.0960227 7.5 7.677.33 7.5 7.33960227液体苗7.5 7.336.33 4.5 ＜3.0960303 7.17 7.177.0 7.0 7.0960303液体苗7.17 7.336.0 4.67 ＜3.0970316 7.67 7.7 7.67 7.5 7.5970316液体苗7.67 7.5 6.83 4.0 ＜3.表5 对不同批次冻干疫苗接种小白鼠安全性观察疫苗批次接种数量(只)不良反应数量(只)不良反应率(％)9601125 0 09601125 0 09602275 0 09603035 0 09603205 0 09603165 0 09706245 0 09708215 0 09709115 0 0表6恒猴免疫后抗-HAV总抗体水平
表7恒猴免疫后血清ALT变化疫苗 恒猴数ALT水平-1 2 4 6810 12液体疫苗15 31±3.2 34±2.2 35±1.7 28±3.1 22±4.7 30±4.1 31±2.8冻干疫苗15 29±3.7 38±1.1 36±1.3 31±3.8 29±3.7 28±3.3 30±2.1空白对照526±1.7 30±3.1 26±2.8 33±3.5 27±2.2 29±2.6 31±1.7表8 恒猴免疫后肝脏病理变化疫苗 恒猴数 肝脏病理检测0 4 8 12液体疫苗 15 0 0 0 0冻干疫苗 15 0 0 0 0空白对照 5 0 0 0 0
表9恒猴免疫后排毒情况疫苗 恒猴子 免疫若干天后排毒情况编号24681216182022262830液体疫苗1++ABA B B C B A + -2++AAA B C C A A + +3++ABB B C C A B + +4++ABB B C C B A + -5++AAB B B C B A + -冻干疫苗6++ABB B C C A B + -7++AAA B C C B A - -8++ABA B B C A A - -9++ABB B C C B A + +10 ++ABB B C C B B + +空白对照11 ----- - - - - - - -12 ----- - - - - - - -13 ----- - - - - - - -14 ----- - - - - - - -15 ----- - - - - - - -注+表示阳性A表示1∶10阳性B表示1∶100阳性C表示1∶1000阳性-表示阴性上述试验表明，冻干疫苗在45℃、37℃及室温下分别保存1天、7天、28天，其感染性滴度维持不变，而在相同条件下液体疫苗的感染性滴度则明显下降，冻干疫苗在2-8℃下保存24个月，其感染性滴度无显著变化，而液体疫苗在6个月后其感染性滴度则明显下降，到18个月时感染性滴度平均下降2.5-3.0logCCID50/ml。这说明冻干疫苗的稳定性明显高于液体疫苗。此外，小鼠、猴体试验证明冻干甲型肝炎减毒活疫苗具有良好的安全性和免疫效果。
权利要求
1.一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗，该疫苗包括液体甲型肝炎减毒活性疫苗和冻干保护剂，其特征在于冻干保护剂配方如下(W/V)海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明胶0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化钠0.145克，氯化钾0.185克，磷酸氢钠0.895克，磷酸二氢钾0.34克，双蒸馏水100毫升。
2.根据权利要求1所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗，其特征在于其中的氨基酸可为甘氨酸和/或精氨酸和/或赖氨酸。
3.一种权利要求2所述的冻干甲型肝炎减毒活疫苗的制备方法，该方法包括以下步骤(1)配制冻干保护剂将海藻糖1～15克，氨基酸0.1～5克，明胶0.1～1克，人白蛋白0.1～1克，氯化钠0.145克，氯化钾0.185克，磷酸氢钠0.895克和磷酸二氢钾0.34克加入到100毫升双蒸馏水中，其中的氨基酸可为甘氨酸和/或精氨酸和/或赖氨酸；(2)取现有的液体甲型肝炎减毒活疫苗与上述保护剂按体积比为1∶1的比例混合均匀后待用；(3)在压力为15磅、温度为112℃-115.6℃的条件下灭菌30分钟后，在37℃的条件下培养7天备用；(4)将冻干箱内温度预先降至-4℃，将分装好的疫苗与保护剂的混合液放入冻干箱内，以0.37℃/分钟的速度降温度至-30℃，维持2小时后，抽真空至8×10-3托时，以0.3℃/分钟的速度将温度升至-4℃后，维持14小时，在此期间每隔1小时抽真空1次至0托，并检测水份含量，当残余水份≤3％时，升温至20℃，升温速度为0.24℃/分钟，并维持7-9小时后，塞上瓶塞，出箱即可，整个冻干过程为25-48小时。
全文摘要
本发明公开了一种冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其制备方法,属于病毒性疫苗的医用生物制品。它包括液体甲型肝炎减毒活性疫苗和冻干保护剂,冻干保护剂由海藻糖,氨基酸,明胶,人白蛋白,氯化钠,氯化钾,磷酸氢钠,磷酸二氢钾,双蒸馏水组成,并经过与之相适应的冻干工艺处理制得。该疫苗稳定性好,可在2—8℃的条件下有效保存1—2年。
文档编号A61K9/19GK1247091SQ9911503
公开日2000年3月15日 申请日期1999年7月22日 优先权日1999年7月22日
发明者胡云章, 邵聪文, 谭顺革, 金炜翔, 侯宗柳, 何继红, 姬秋彦, 陈洪波, 任丽萍, 龙润乡 申请人:中国医学科学院医学生物学研究所