86:72-81)。miR-127 转染后降低了经 LPS 活化后巨噬细胞 中Duspl的表达，而anti-miR-127增强了 Duspl的表达，证明miR-127可以负调控Duspl。 在RAW264. 7中沉默Duspl后增强了 JNK的磷酸化，反之，过表达Duspl后JNK的磷酸化减 弱。这表明miR-127可能通过负调控磷酸酶Duspl来调控JNK的活性，从而来调控巨噬细 胞的活化和分型。
[0062] (2)miR_127通过作用于Bcl6来调节Duspl的转录
[0063] 通过序列分析可知Duspl不是miR-127的直接革El基因。有论文报导转录调 控因子 Bcl6 受 miR-127 的直接调控（Saito Y, Liang G, Egger G et al. Specific activation of microRNA-127 with downregulation of the proto-oncogene BCL6 by chromatin-modifying drugs in human cancer cells. Cancer Cell 2006 ;9:435-443)，所 以，我们推测miR-127可能通过直接作用于Bcl6来调节LPS引起的炎症反应。我们发现在 LPS刺激的巨噬细胞中转染miR-127后，Bcl6的蛋白水平降低；转染anti-miR-127后，Bcl6 的表达升高，显示了 miR-127和Bcl6之间的负相关性。
[0064] 作为转录因子，Bcl6可以结合到Duspl的两段启动子序列，所以我们推测miR-127 可能是通过调节Bcl6来调节Duspl。实验证实在Bcl6过表达的巨细胞中Duspl的表 达也增高。相应的，干扰Bcl6后Duspl的表达降低。在RAW264. 7细胞中先转染Duspl的 5' UTR，再转染Bcl6或Bcl6的突变序列，转染24小时后裂解细胞检测荧光素酶的活性。 结果可见，过表达Bcl6后可以使Duspl的5' UTR的荧光素酶活性显著升高，而Bcl6锌指 结构区域3或者5发生突变时，Duspl的5' UTR的荧光素酶活性受到影响（图8)。使用 ChIP (Chromatin immunoprecipitation，染色质免疫共沉淀技术）方法，我们发现Bcl6结 合到Duspl启动子区域受miR-127的调节，与miR-127负调控Duspl的数据相符（图9)。 Bcl6参与了 miR-127调节Duspl的过程，Bcl6沉默后引起JNK的活化和巨噬细胞的活化。 敲减Bcl6后，受LPS刺激的巨噬细胞中JNK的磷酸化增强，在miR-127过表达的巨噬细胞 中转入Bcl6后，JNK的磷酸化水平降低。
[0065] (3)miR-127可能通过调节Bcl6/Duspl/JNK通路来调节巨噬细胞的活性和极化
[0066] 我们进一步检测了是否过表达Bcl6或者Duspl可以阻止miR-127介导的巨噬 细胞向Ml型的转变。在miR-127过表达的细胞中转入Bcl6或Duspl后，IL-6或TNF-α 的表达减弱，而M2型巨噬细胞相关分子Mrcl和Mgl2的表达增强（图10)。同时，在转有 anti-miR-127的巨噬细胞中敲减Duspl或Bcl6后，减弱了 anti-miR-127引起的抑炎效应， M2型巨噬细胞相关基因表达降低（图11)。以上结果说明Bcl6/Duspl在miR-127介导的 M1/M2型基因转录过程中起到重要的作用。
[0067] 实施例五动物水平实验
[0068] (I)miR-127可以被LPS-TLR4信号通路激活
[0069] 我们建立小鼠肺炎模型。每组3只野生型C57BL/6小鼠气管灌注LPS(400 yg/ kg)，在刺激后的0、6、12、24小时取肺组织，研磨后抽提RNA并反转录，定量PCR检测小鼠肺 组织中miR-127的动态表达变化。结果显示，miR-127的表达随着LPS刺激时间的增加而 表达增加，24小时的时间点升高至基础值的2倍左右（图12)。上述结果从动物水平证明 了 miR-127可以被LPS-TLR4信号通路激活。
[0070] (2)miR-127对LPS诱导的小鼠肺组织中炎症因子的影响
[0071] 我们又进一步采用小鼠肺炎模型来分析miR-127对炎症因子的调控作用。我们向 野生型小鼠气管灌注50 μ g的miR-127mimic和anti-miR-127,处理24小时之后，气管灌注 LPS (400 μ g/kg)，在刺激后的0、12、24小时抽提肺组织中的RNA，用定量PCR检测IL-6和 TNF-α的表达水平。结果显示，miR-127过表达的小鼠 IL-6和TNF-α的表达要明显高于 对照组（图13a，b)。相反的，miR-127抑制后IL-6, TNF- α的表达要明显低于对照组（图 13c，d) 〇
[0072] 我们再用相同方法建立小鼠肺炎模型。在气管灌注LPS的6和12小时，收集肺灌 洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，用 ELISA 检测 BALF 中 TNF- α、IL-6、IL-10 的表达水平。结果显示，气管灌注miR-127mimic的小鼠的BALF中，IL-6和TNF-α与对照 组相比都升高了 2-3倍（图14a，b)，而IL-10的表达则下降了 20%左右（图14c)。相反 的，气管灌注anti-miR-127的小鼠的BALF中，IL-6在LPS刺激12小时的表达与对照相比 在12小时明显下调（下降30%左右）（图14d)。TNF-α在6小时有明显下降（图14e)， 而IL-10的表达在12小时与对照相比升高了近1倍（图Hf)。因此动物实验的结果和细 胞实验结果相一致，共同证明了 miR-127能显著增强TNF-α和IL-6这类炎症因子的表达， 并抑制IL-10的表达。根据上述实验结果，我们从动物模型证明了 miR-127可以调控炎症 因子IL-6、TNF- α和IL-IO的表达，其中miR-127正向调控IL-6和TNF-a的表达，负调控 IL-10的表达。
[0073] 我们又用小鼠炎症模型来检测KC、Mrcl、Mrc2、Mgll、Mgl2的mRNA的表达水平。向 小鼠气管灌注miR-127 mimic和anti-miR-127,处理24小时之后，气管灌注LPS (400 μ g/ kg)，在刺激0、12、24小时后抽提肺组织中的RNA，用定量PCR检测KC、Mrcl、Mrc2、Mgll、 Mgl2的mRNA的表达水平。结果显示，miR-127过表达的小鼠 KC的mRNA表达水平明显升高 (图15&)，]?1^1、]\&^2、]\%11、]\%12的表达则相反（图1513，(3，(1，6)，]\&^2和]\%12的1111?隱表 达水平在12小时时，与对照组相比下降了近1倍。抑制miR-127之后，KC在LPS刺激12小 时和24小时时表达分别下降了 50%和70% (图15f)，而Mrcl、Mrc2、Mgll和Mgl2的表达 水平在LPS刺激24小时升高了 2倍及以上（图15g，h，i，j)。
[0074] (3)小鼠肺组织常规病理切片
[0075] 我们对分离得到的经LPS刺激24小时的小鼠肺组织，进行石蜡包埋，经过常规切 片，苏木素伊红染色，检测肺组织病理改变。结果显示，miR-127过表达的小鼠肺部炎症细 胞的浸润与对照组相比更加明显。而miR-127抑制之后的小鼠肺部的炎症细胞的浸润则明 显降低。我们认为不同处理的小鼠肺组织的炎症反应变化主要是因为miR-127对IL-6和 TNF-α的调控的结果。
[0076] (4)miR-127通过调节Bcl6/Duspl/JNK通路来调节巨噬细胞的活性和极化
[0077] 同样我们建立小鼠肺炎模型，每组三只野生型小鼠气管灌注miR-127mimic 24小 时之后，再气管灌注LPS (400 μ g/kg)，24小时后收集肺组织蛋白，用Western blot检测肺 组织中Bcl6的表达变化。结果显示，在LPS刺激之后，miR-127过表达的小鼠的肺组织中 Bcl6的表达与对照组比明显下调，证明miR-127可能通过作用于Bcl63' UTR特异靶位点， 从而在转录后水平抑制Bcl6的表达。向小鼠气管中灌注miR-127,后经LPS刺激，发现肺组 织中Duspl的表达降低；灌注anti-miR127后发现增强了 Duspl的表达。在小鼠气管内灌 注miR-127后，肺组织中Bcl6的表达也显著降低。
[0078] 我们在细胞水平上证明了 miR-127可以调节巨噬细胞向Ml型转变，我们在动物水 平上检测了抑制miR-127是否可以降低LPS引起的肺部炎症和损伤。在小鼠气管内灌注 anti-miR-127或者对照siRNA后接受LPS刺激，然后检测肺部的炎症反应。实验结果显示， 使用miR-127抑制剂后，LPS刺激引起的肺损伤减弱，肺间质水肿减少。我们收集LPS处理 的0、6、12、24小时的BALF，并用细胞计数仪进行细胞计数。结果显示，与对照组相比，过表 达miR-127小鼠的BALF中细胞总数和中性粒细胞数明显升高（图16a)，而将miR-127抑制 之后小鼠的BALF中细胞总数和中性粒细胞数则明显下降（图16b)。anti-miR-127处理后 BALF中蛋白含量减少（图17)。使用低剂量的LPS(6mg/kg)处理对照小鼠和miR-127灌注 的小鼠，持续观察6天，对照小鼠存活率维持为100 %，miR-127灌注小鼠的存活率在第六天 时只有60% ;使用高剂量的LPS (12mg/kg)处理对照小鼠和miR-127灌注的小鼠，持续观察 6天，6天内对照小鼠存活率下降为30%，miR-127灌注小鼠一天内全部死亡（图18)。本 发明从细胞水平和动物水平上证明了可以通过抑制miR-127来抑制Ml型巨噬细胞的转化， 从而抑制肺部炎症的发生。
[0079] 上述实施例中使用实时定量PCR的体系如下（表1):
[0080] 表I PCR反应体系及反应过程
【主权项】
1. miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。
2. 如权利要求1所述的miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用，其特征 在于所述的miR-127抑制剂为anti-miR-127〇
【专利摘要】本发明公开miR-127抑制剂在制备抗炎和肺损伤保护药物的应用。抑制miR-127能够有效预防肺损伤导致的肺部炎症和损伤。miR-127抑制剂可减少促炎因子的产生，减弱气道的炎症反应，减少炎症细胞的浸润。本发明揭露了miR-127抑制剂可用于制备预防急性肺损伤及其并发症药物，以及miR-127抑制剂用于预防急性肺损伤及其并发症的作用机制。miR-127抑制剂以Bcl6为靶标，通过调节Bcl6/Dusp1/JNK通路而抑制LPS诱导的炎症反应。
【IPC分类】A61K48-00, A61P29-00, A61P11-00
【公开号】CN104548132
【申请号】CN201410576871
【发明人】史丽云, 应航洁, 卢哲
【申请人】杭州师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年10月24日