用于调节bdnf表达的组合物和方法
【专利说明】用于调节BDNF表达的组合物和方法
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求2012年5月16日提交的名称为"用于 调节 BDNF 表达的组合物和方法（COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING BDNF EXPRESSION) "的美国临时申请号61/648, 058的权益，将其通过引用以其全部结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及基于寡核苷酸的组合物，以及使用基于寡核苷酸的组合物用于治疗疾 病的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 神经退行性疾病是渐进式功能丧失或神经元死亡，并且是以下家族的毁灭性疾病 的原因，该家族包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS，也称为卢伽雷氏病）、阿尔茨海默病 (AD)、亨廷顿氏病（HD)和帕金森病（PD)。
[0006] ALS涉及运动神经元的退行性，并导致渐进性肌无力、构音障碍、吞咽困难、呼吸困 难，并最终死亡。ALS可由Cu/Zn超氧化物歧化酶1中的突变引起。AD涉及神经元的退行 性和大脑皮层中的突触，导致痴呆、混乱、侵略、和长期记忆丧失。AD被假设是由错误折叠的 蛋白质引起的，错误折叠的蛋白质形成导致神经元死亡的小斑块。ro涉及黑质中产生多巴 胺的神经元的死亡，导致运动缺陷、精神问题和自主功能障碍。一些基因中的突变，α -突触 核蛋白（SNCA)、帕金（PRKN)、富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2或震颤素（dardarin))、ΡΤΕΝ 诱导的假定激酶I (PINKl)、DJ-I和ΑΤΡ13Α2,导致至少一个子集的帕金森病。
[0007] 脑源性神经营养因子（BDNF)是涉及神经元生存、生长和分化的分泌神经营养蛋 白。此外，BDNF在突触传导和突触可塑性中是很重要的。几项研宄将BDNF与神经退行性 疾病关联起来。BDNF表达在患有神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症的患者中被降低。神经 退行性的动物研宄显示，高水平的BDNF可缓解AD和Η)症状或与这些症状的缓解相关。此 夕卜，BDNF模拟AD动物模型中神经退行性的减少。
【发明内容】
[0008] 在此披露的本发明的方面提供可用于上调细胞内BDNF的方法和组合物。在一些 实施例中，提供单链寡核苷酸，其靶向BDNF基因（例如，人BDNF)的PRC2相关区并且因此 引起该基因的上调。在一些实施例中，提供单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸靶向编码BDNF 的基因的PRC2相关区。在一些实施例中，这些单链寡核苷酸通过缓解或阻止PRC2介导的 对BDNF的阻抑来激活或增强BDNF的表达。此处披露的本发明的多个方面提供了可用于上 调BDNF以治疗和/或预防神经退行性疾病，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS，也称为卢 伽雷氏病）、AD、亨廷顿氏病（HD)、或帕金森病（PD)的方法和组合物。
[0009] 本发明的另外的方面提供用于选择用于激活或增强BDNF的表达的寡核苷酸的方 法。在一些实施例中，提供用于选择一组寡核苷酸的方法，该组寡核苷酸中富集于用于激 活或增强BDNF的表达的候选物（例如，与寡核苷酸随机选择相比较）中。因此，这些方法 可以用于建立其中富集了激活或增强BDNF的表达的寡核苷酸的多组临床候选物。这类库 可以被利用来例如鉴别用于开发治疗BDNF的治疗剂的先导寡核苷酸。另外，在一些实施例 中，提供寡核苷酸化学性质，其可用于控制用于激活BDNF的表达的单链寡核苷酸的药物代 谢动力学、生物分布、生物可利用性和/或功效。
[0010] 根据本发明的一些方面，提供单链寡核苷酸，这些单链寡核苷酸具有与BDNF基因 的PRC2相关区（例如，该区的至少8个连续核苷酸）（例如，如SEQ ID NO :1或2中给出的 核苷酸序列的PRC2相关区）互补的区。在一些实施例中，寡核苷酸具有以下特征中的至少 一个：a)为5'X-Y-Z的序列，其中X为任何核苷酸并且其中X位于寡核苷酸的5'端，Y为非 为微小RNA的人种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核 苷酸的核苷酸序列；b)不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸的序列；c)与每个核苷酸序列 具有阈值水平以下的序列一致性的序列，这些核苷酸长度等于第二核苷酸序列、在脱靶基 因的5'端上游的50千碱基与该脱靶基因的3'端下游的50千碱基之间；d)与编码RNA的 PRC2相关区互补的序列，该RNA形成包括至少两个单链环的二级结构；以及e)具有60%以 上G-C含量的序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特征a)、b)、 c)、d)以及e)中的至少两种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地选择的特 征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少三种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有各自独立地 选择的特征a)、b)、c)、d)以及e)中的至少四种。在一些实施例中，该单链寡核苷酸具有 特征幻、13)、(3)、(1)以及 6)中的每一种。在某些实施例中，该寡核苷酸具有序列5'乂-￥-2， 其中该寡核苷酸的长度为8至50个核苷酸。
[0011] 根据本发明的一些方面，提供具有序列χ-γ-ζ的单链寡核苷酸，其中X为任何核苷 酸，Y为非为人微小RNA的种子序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1 至23个核苷酸的核苷酸序列，其中该单链寡核苷酸与BDNF基因的PRC2相关区（例如，如 SEQ ID NO :1或2中给出的核苷酸序列的PRC2相关区）互补。在本发明的一些方面中，提 供具有序列5' -X-Y-Z的单链寡核苷酸，其中X为任何核苷酸，Y为非为人微小RNA的种子 序列的、长度为6个核苷酸的核苷酸序列，并且Z为长度为1至23个核苷酸的核苷酸序列， 其中该单链寡核苷酸与BDNF基因的PRC2相关区（例如，如SEQ ID NO :1或2中给出的核 苷酸序列的PRC2相关区）的至少8个连续核苷酸互补。在一些实施例中，Y为选自表1的 序列。在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO :7至68中任一个中列出的序列。
[0012] 在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个中给出 的核苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个中给出的核苷酸序列，其中所提供的核苷酸序列的5'端是该 寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，该互补区（例如，至少8个连续核苷酸）还存在于如 SEQ ID NO :5或6中给出的核苷酸序列中。
[0013] 在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个中给出 的核苷酸序列。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个 中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。
[0014] 在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO :7至48中任一个中列出的序列。 在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至30107或62210至62225中任一 个中给出的核苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包 括如SEQ ID NO :69至30107或62210至62225中任一个中给出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :69至30107或62210至62225中任一项中提供的核苷酸序列的5'端是该寡核苷酸 的5'端。在一些实施例中，该至少8个连续核苷酸还存在于如SEQ ID NO :5中给出的核苷 酸序列中。
[0015] 在一些实施例中，该PRC2相关区为SEQ ID NO :49至68中任一个中列出的序列。 在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :30003至62209中任一个中给出的核 苷酸序列，或其至少8个核苷酸的片段。在一些实施例中，该单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :30003至62209中任一个中给出的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO :30003至62209中任 一项中提供的核苷酸序列的5'端是该寡核苷酸的5'端。在一些实施例中，该至少8个连 续核苷酸存在于如SEQ ID NO :6中给出的核苷酸序列中。
[0016] 在一些实施例中，单链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个中给出的 核苷酸序列。在一些实施例中，该寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。在一些实施例中，单 链寡核苷酸包括如SEQ ID NO :69至62225中任一个中给出的核苷酸序列中至少8个核苷 酸的片段。
[0017] 在一些实施例中，单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列。在一些实施例 中，该单链寡核苷酸包括如表4中给出的核苷酸序列中至少8个核苷酸的片段。在一些实 施例中，单链寡核苷酸由如表4中给出的核苷酸序列组成。
[0018] 在一些实施例中，该单链寡核苷酸不包括三个或更多个连续鸟苷核苷酸。在一些 实施例中，该单链寡核苷酸不包括四个或更多个连续鸟苷核苷酸。
[0019] 在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为8至30个核苷酸。在一些实施例中， 该单链寡核苷酸的长度高达50个核苷酸。在一些实施例中，该单链寡核苷酸的长度为8至 10个核苷酸，并且该PRC2相关区的互补序列中除1、2或3个核苷酸之外的所有都为胞嘧啶 或鸟苷核苷酸。
[0020] 在一些实施例中，该单链寡核苷酸与BDNF基因的PRC2相关区、例如SEQ ID NO :1 或2中给出的核苷酸序列的PRC2相关区的至少8个连续核苷酸互补，其中该单链寡核苷酸 的核苷酸序列包括选自下组的核苷酸序列中的一个或多个，该组由以下各项组成
[0021] (a) (X)Xxxxxx，（X)xXxxxx，（X)xxXxxx，（X)xxxXxx，（X)xxxxXx 和（X)xxxxxX，
[0022] (b)(X)XXxxxx，（X)XxXxxx，（X)XxxXxx，（X) XxxxXx，（X)XxxxxX，（X)xXXxxx，（X) xXxXxx，（X)xXxxXx，（X)xXxxxX，（X)xxXXxx，（X)xxXxXx，（X) xxXxxX，（X) xxxXXx，（X)xxxXxX 和（X)xxxxXX，
[0023] (c)(X)XXXxxx， （X)xXXXxx， （X)xxXXXx， （X)xxxXXX， （X)XXxXxx， （X)XXxxXx， （X) XXxxxX，（X)xXXxXx，（X)xXXxxX，（X)xxXXxX，（X)XxXXxx，（X)XxxXXx (X)XxxxXX，（X)xXxXXx， (X)xXxxXX， （X)xxXxXX， （X)xXxXxX 和（X)XxXxXx，
[0024] (d)(X)xxXXX， （X)xXxXXX， （X)xXXxXX， （X)xXXXxX， （X)xXXXXx， （X)XxxXXXX， （X) XxXxXX， （X)XxXXxX， （X)XxXXx， （X)XXxxXX， （X)XXxXx