物300g。
[0044] 实施例3 :海星酶解提取物的提取
[0045] 取新鲜海星lkg用清水洗净后，剪碎后尽量弃去水分，并称重。向剪碎的海星中加 入海星质量3倍的蒸馏水，使用分散机匀浆（22000rpm) 10min，得到海星匀浆液。
[0046] 将上述匀浆液放置于40°C恒温水浴中，并加入匀浆液3倍体积的pH为7. 0的 0.lmol/L的磷酸缓冲液以及海星体壁质量0.5%的复合酶，每克复合酶的酶活力为30万 U (该复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3:3:4的混合物），酶解 llh，持续搅拌，并保持pH在6. 8-7. 2之间。
[0047] 酶解结束后，加入酶解液三倍体积的乙醇溶液（乙醇的质量分数为95 % )，室温静 置6h，室温离心（5000rpm，10min)，取上清。然后在恒流泵的作用下将上清液通过截留分子 量为6000道尔顿的中空纤维膜组件，收集透过液。
[0048] 取上述透过液用真空旋转蒸发仪浓缩后，喷雾干燥即得海星酶解提取物50g。
[0049] 实施例4:海星酶解提取物的提取
[0050] 取新鲜海星5kg用清水洗净后，剪碎后尽量弃去水分，并称重。向剪碎的海星中加 入海星质量4倍的蒸馏水，使用分散机匀浆（lOOOOrpm) 15min，得到海星匀浆液。
[0051] 将上述匀浆液放置于60°C恒温水浴中，并加入匀浆液4倍体积的pH为7. 0的 0. lmol/L的磷酸缓冲液以及海星体壁质量2%的复合酶，每克复合酶的酶活力为30万 U (该复合酶是碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按活力单位比为3:3:4的混合物），酶解 12h，持续搅拌，并保持pH在6. 8-7. 2之间。
[0052] 酶解结束后，加入酶解液三倍体积的乙醇溶液（乙醇的质量分数为95 % )，室温静 置8h，室温离心（5000rpm，10min)，取上清。然后在恒流泵的作用下将上清液通过截留分子 量为6000道尔顿的中空纤维膜组件，收集透过液。
[0053] 取上述透过液用真空旋转蒸发仪浓缩后，喷雾干燥即得海星酶解提取物300g。
[0054] 实施例5 :海星酶解提取物促进成纤维细胞增殖的活性
[0055] 将海星酶解提取物粉末溶于含0. 4%FBS的细胞培养基中，至终浓度为lmg/mL，过 0. 22 y m滤膜除菌，零下20°C保存备用。
[0056] 按照测定细胞存活率的常规方法进行NIH/3T3细胞存活率的测定。NIH/3T3细胞 铺满细胞瓶底面积90 %时，消化收集，制成均匀的单个细胞悬液，细胞密度调整为4 X 104个 /mL左右。向96孔板各孔内加入100 yL的细胞悬液，于细胞培养箱内培养，12h待细胞完 全贴壁之后，吸净培养基，同时加入100 U L含0. 4 % FBS的细胞培养基，使细胞生长速度同 步24h。然后将海星酶解提取物溶液分别稀释为相应浓度备用。吸净孔内的旧培养基，空 白对照组分别加入100 y L含0. 4% FBS的维持培养基，阳性对照组分别加入100 y LlOng/ mL的bFGF，实验组分别加入含海星酶解提取物的溶液100 y L，海星酶解提取物的浓度分别 为50 y g/mL、100 y g/mL、200 y g/mL，每个实验组均设有6个复孔。将96孔板在细胞培养 箱内培养48小时后，每孔内各加入MTT试剂10 y L，于培养箱内孵育4小时，吸净孔内培养 基，并每孔加入DMS0试剂100 y L，慢慢摇晃直至紫色结晶完全溶解后使用酶标仪测定各孔 的吸光度值，测定波长为570nm，参比波长为630nm。结果见附图1，从附图1中我们可以看 出海星酶解提取物在50-200 y g/mL的浓度范围内具有促进成纤维细胞增殖的活性，而且 活性具有剂量依赖性。
[0057] 实施例6 :海星酶解提取物促进胶原蛋白分泌的活性
[0058] 本实验中采用羟脯氨酸试剂盒的方法来检测海星酶解提取物对NIH/3T3细胞胶 原蛋白分泌的影响。实验过程如下：
[0059] NIH/3T3细胞融合度达到85%左右，经胰酶消化，收集细胞，重悬后调整细胞密度 为4 X 104个/mL，均匀接种于6孔板内，细胞培养箱内培养12h后，细胞完全贴壁，吸净旧培 养基，加入含0. 4 % FBS的细胞培养基，同步细胞生长状态，细胞培养箱内培养24h后，吸净 旧培养基，分别加入含药物浓度为 〇、TGF-0 1 (10ng/mL)、50 y g/mL、100 y g/mL、200 y g/mL 的细胞培养基。48h后分别收集每孔培养基，采用羟脯氨酸试剂盒的方法来检测海星酶解提 取物对NIH/3T3细胞胶原蛋白分泌的影响。结果见附图2,从附图2中我们可以看出海星酶 解提取物在50-200 y g/mL的浓度范围内具有促进胶原蛋白分泌的活性，而且活性具有剂 量依赖性。
[0060] 实施例7 :配制海星酶解提取物祛皱修复化妆水
[0061] 配方为：
[0062]
【主权项】
1. 一种海星酶解提取物的制备方法，其特征是，包括以下步骤： (1) 取新鲜海星洗净后，剪碎后弃去水分，并称重；向剪碎的海星中加入蒸馏水，匀浆， 得到海星匀浆液； (2) 将步骤（1)中得到的海星匀浆液恒温水浴，并加入磷酸缓冲液和复合酶进行酶解， 持续搅拌，并保持pH在6. 8-7. 2之间； (3) 酶解结束后，加入乙醇溶液，室温静置后，室温离心，取上清液，然后将上清液通过 中空纤维膜组件，收集透过液； (4) 取步骤（3)中的透过液，浓缩干燥即得海星酶解提取物。
2. 如权利要求1所述的海星酶解提取物的制备方法，其特征是：所述步骤（1)中，蒸馏 水的质量为海星质量2-4倍； 采用分散机进行匀浆，转速为l〇〇〇〇-22000rpm，时间为5-10min。
3. 如权利要求1所述的海星酶解提取物的制备方法，其特征是：所述步骤（2)中，恒温 水浴的温度为40-60°C，磷酸缓冲液的pH为7. 0,摩尔浓度为0. lmol/L，加入量是海星匀浆 液体积的2-4倍； 复合酶的加入质量为海星体重质量的〇. 5-2%，每克复合酶的酶活力为30万U ;所述复 合酶是由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶组成的混合物，其中，所述碱性蛋白酶、木瓜 蛋白酶和胰蛋白酶的活力单位比为3:3:4 ; 酶解时间为l〇~12h。
4. 如权利要求1所述的海星酶解提取物的制备方法，其特征是：所述步骤（3)中，乙醇 溶液中乙醇的质量分数为95%，加入量为步骤（3)中酶解液体积的3倍； 室温静置的时间为6-12h ; 室温离心的转速为5000rpm，时间为IOmin ; 中空纤维膜组件的截留分子量为6000道尔顿。
5. 如权利要求1所述的海星酶解提取物的制备方法，其特征是：所述步骤（4)中，干燥 采用冷冻干燥或者喷雾干燥。
6. 权利要求1所述的海星酶解提取物的制备方法制备得到海星酶解提取物。
7. 权利要求6所述的海星酶解提取物在促进成纤维细胞增殖和分泌胶原蛋白的应 用。
8. 如权利要求6所述的应用，其特征是：具体应用形式是，所述海星酶解提取物在制 备祛皱修复化妆品中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征是：所述海星酶解提取物的质量占祛皱修复化妆 品总质量的〇. 1~2%。
10. 如权利要求8所述的应用，其特征是：所述祛皱修复化妆品为护肤水、精华、乳液 或面霜。
【专利摘要】本发明公开了一种海星酶解提取物及其制备方法和应用，该方法包括以下步骤：取鲜海星洗净后，剪碎后弃去水分，并称重；向剪碎的海星中加入蒸馏水，匀浆，得到海星匀浆液；将上述匀浆液恒温水浴，并加入磷酸缓冲液和复合酶进行酶解，持续搅拌，并保持pH在6.8-7.2之间；酶解结束后，加入乙醇溶液，室温静置后，室温离心，取上清液，然后将上清液通过中空纤维膜组件，收集透过液；取透过液，浓缩干燥即得海星酶解提取物。所述海星酶解提取物在制备祛皱修复化妆品中的应用，具有促进成纤维细胞增殖、促进分泌胶原蛋白、使皮肤明显细嫩、弹性明显增加、皱纹明显变浅等作用，使用后具有明显的祛皱修复效果。
【IPC分类】A61Q19-08, A61Q19-00, A61K8-98
【公开号】CN104666225
【申请号】CN201510120730
【发明人】宋淑亮, 吉爱国
【申请人】山东大学（威海）
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年3月19日