专利名称：抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种贻贝酶解提取物的制备方法，该提取物能用于抗前列腺癌。
背景技术：
多肽在生物体内可作为神经递质、白细胞介素和细胞生长因子等活性物质，具有 维持生物体生长发育、免疫调节和新陈代谢等活性功能。现有研究表明，来源于生物体的多 肽具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗衰老、抗高血压等活性功能，尤其是抗肿瘤活性已受到各国 研究人员的关注。目前，有关天然肽和合成肽的抗肿瘤活性已有大量报道，并有部分多肽作 为抗肿瘤药物已应用于临床；食物蛋白来源的多肽对于其抗菌、抗氧化、抗高血压活性研究 颇多，而对其抗肿瘤活性的相关报道较少。海洋生物蛋白种类繁多，来源广泛，作为活性肽的一个重要来源，已受到越来越多 的关注。贻贝作为海洋生物的一个重要组成部分，隶属于海洋软体动物门(Mollusca)双壳 纲(Bivalvia)贻贝目(Mytiloida)，在我国北方称海红，江浙称为淡菜，富产于浙江嵊泗周 围海域。贻贝富含粗蛋白、脂肪和碳水化合物，此外还含有钙、磷、铁、维生素等多种微量元 素。已有研究表明，贻贝提取物具有抗肿瘤、抗氧化、抗凝、降血压、降血脂、提高免疫力等活 性功能，可参考专利号为ZL200510110096.8的中国发明专利《厚壳贻贝的提取物、制造方 法及其用途》(授权公告号CN100467030C)，该专利公开了厚壳贻贝的提取物在流感上的应 用。类似的还可以参考专利号为ZL200510024391. 1的中国发明专利《一种可提高免疫力功 能的厚壳贻贝提取物》(授权公告号为CN100486593C)；申请号为200910101136. 0的中国发 明专利申请公开《厚壳贻贝脂溶性提取物及其制备方法和用途》(公开号CN101606951A)。 但至今未见有关贻贝酶解产物对前列腺癌细胞作用的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种抗前列腺癌贻贝 酶解提取物的制备方法。本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种贻贝酶解提取物在抗前列腺癌上 的应用。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物 的制备方法，其特征在于包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并勻浆，料液比1 3 1 4，调节pH值至 9. 5 10，保温 25 30°C ；②加入Alcalase(碱性蛋白酶)，加酶量为1500 2000u/g，酶解温度为45 50°C，酶解时间6_8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。作为优选，所述的Alcalase酶活力为19395 19405u/g，采用的缓冲液为pH为 10的甘氨酸-NaOH缓冲液。所述的贻贝可以是紫贻贝、厚壳贻贝或翡翠贻贝。
作为优选，所述的包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并勻浆，料液比1 4，调节pH值至10，保温 30°C,30min ；②加入Alcalase，加酶量为2000u/g，酶解温度为50°C，酶解时间8h，灭活，离心，
取上清液。作为优选，所述的酶解产物的氨基氮为8. 3337 8. 3347mg/g。作为优选，所述的酶解产物的对前列腺癌细胞DU-145的细胞增殖抑制指数为 55. 36% 55. 38%。酶解产物在抗前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于通过对酶的筛选，料液比、酸碱度、加酶量、 温度及酶解时间的控制，得出了一个最佳的工艺，并产物对前列腺癌细胞具有良好的增殖 抑制作用。
图1为酪氨酸标准曲线图。图2为各酶水解产物对应的ANN含量。图3为各酶水解产物对应的IR含量。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。1蛋白酶活力测定方法酪氨酸标准曲线的绘制精确称取烘干至恒重的酪氨酸0. 10009，逐步加入6mllM 的HC1溶解，用0. 2M的HC1定容至100ml，其浓度为1000 u g/ml，再吸取此液10ml，以0. 2M 的HCI定容至100ml，即配成100 u g/ml的酪氨酸溶液。将此酪氨酸溶液稀释成0-100 u g/ ml的不同浓度，取6支试管编号，分别吸取不同浓度的酪氨酸1ml，各加入0. 4MNa2C035ml, 再分别加入已稀释的福林试剂1ml。摇勻置于水浴锅中40°C保温发色20min，用分光光度计 在680nm处比色测定光密度DO值。以净DO值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制成标 准曲线如图1所示。酶活力测定取一定质量或体积的酶，用该酶最适pH的缓冲液溶解，定容。并且根 据估计酶活力，将酶液稀释到适当浓度。取3支试管做平行，分别加入酶液lml，置于40°C 水浴中预热2min，再分别加入同样预热的2%酪蛋白1ml，精确保温lOmin，然后立即再分别 加入0. 4MTCA2ml,以终止反应，继续置于水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心，取 滤液1ml，加入0. 4MNa2C035ml，加入已稀释的福林试剂1ml，摇勻，40°C保温发色20min，用分 光光度计680nm比色测定DO值，由酪氨酸标准曲线计算相当的酪氨酸浓度，取平均值。同 时取3支试管做空白，空白试验测定方法同上，只是在加酪蛋白之前先加0. 4MTCA2ml，使酶 失活，再加入酪蛋白酶活力计算在40°C下每分钟水解酪蛋白产生1 P g酪氨酸所需的酶量定义为1 个蛋白酶活力单位。活力单位=(AX4XN)/(10XM)
式中A—由样品的0D值查标准曲线得到的相当的酪氨酸浓度，P g/ml4_4ml过滤液中取出1ml测定(即4倍)N—酶液的稀释倍数10—反应时间为lOminM—酶制剂的量，g/ml1. 1. 2结果与分析几种蛋白酶酶活力测定结果
权利要求
一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法，其特征在于包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶3～1∶4，调节pH值至9.5～10，保温25～30℃，20 30min；②加入Alcalase，加酶量为1500～2000u/g，酶解温度为45～50℃，酶解时间6 8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的Alcalase酶活力为19395 19405u/g，采用的缓冲液为pH为10的甘氨酸-NaOH缓冲液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的贻贝为紫贻贝、厚壳贻贝或翡 翠贻贝。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并勻浆，料液比1 4，调节pH值至10，保温 30°C,30min ；②加入Alcalase，加酶量为2000u/g，酶解温度为50°C，酶解时间8h，灭活，离心，取上清液。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酶解产物的氨基氮为8.3337 8.3347mg/g。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的酶解产物的对前列腺癌细胞 DU-145的细胞增殖抑制指数为55. 36% 55. 38%。
7.权利要求1制得的酶解产物在抗前列腺癌上的应用。
全文摘要
一种抗前列腺癌贻贝酶解提取物的制备方法，包括如下步骤①样品的制备，将贻贝洗净，去壳取肉并匀浆，料液比1∶2～1∶3，调节pH值至9.5～10，保温25～30℃，20～30min；②加入Alcalase，加酶量为1500～2000u/g，酶解温度为45～50℃，酶解时间6～8h，灭活，离心，取上清液，得酶解产物。本发明还公开了酶解提取物在抗前列腺癌上的应用。与现有技术相比，本发明的优点在于通过对酶的筛选，料液比、酸碱度、加酶量、温度及酶解时间的控制，得出了一个较佳的工艺，并产物对前列腺癌细胞具有良好的增殖抑制作用。
文档编号A61P13/08GK101991840SQ201010296130
公开日2011年3月30日 申请日期2010年9月26日 优先权日2010年9月26日
发明者丁国芳, 杨最素, 杨永芳, 郁迪, 黄芳芳 申请人:浙江海洋学院