一种预防单纯疱疹病毒ii型的疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种生物制品，具体涉及一种预防单纯疱瘆病毒II型(HSV-2)的疫苗。
【背景技术】
[0002]生殖器疱瘆是目前世界上及我国沿海地区较为常见且发病率有逐渐增高趋势的一种性传播疾病，是由人类单纯疱瘆病毒(HSV)通过性传播感染泌尿生殖器及肛门部位皮肤黏膜而引起的。单纯疱瘆病毒可分为1、2型，大多数生殖器疱瘆是由HSV-2感染所致，主要传染源是生殖器疱瘆患者和无症状病毒携带者。HSV-2的感染是终身的，该病毒具有嗜神经潜伏性，病毒可在人的骶尾神经节内建立终生潜伏。HSV-2潜伏性感染可因各种非特异性刺激活化而导致相关临床症状的复发，如典型的生殖器疱瘆性损伤，或无症状排毒，从而重新具有传染性。研宄者们发现HSV-2可以增加感染HIV的几率。HSV-2可通过破损生殖器上皮为HIV-1募集活化的靶细胞和破坏黏膜朗格汉斯细胞功能。HIV患者感染HSV-2可以增加其生殖道HIV的释放和加速HIV疾病的进程。相反，感染HIV可以增加HSV-2的释放频率和数量。目前临床试验表明抗病毒药物治疗不能减少由HSV-2引起的感染HIV的风险或传播HIV的风险，也不能完全抑制HSV-2的释放。
[0003]鉴于目前抗病毒药物无法控制HSV-2的潜伏和复发以及由其导致的感染HIV和传播HIV的风险，研宄者大多寄希望于疫苗。在过去的几十年里，研宄者们在研发HSV-2疫苗方面做了大量的工作，然而收获甚微。近几十年来世界各国HSV疫苗的研宄结果表明，传统的灭活疫苗和亚单位疫苗免疫原性弱，仅能诱导体液免疫应答，细胞免疫诱导效果较差；减毒活病毒疫苗虽然可以诱导机体的免疫应答但是有逆转的风险。单纯疱瘆病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着更大的作用，但上述几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的疫苗上市，单纯疱瘆病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研宄阶段。
[0004]新型DNA疫苗使外源基因在活体内表达，产生的抗原能够激活机体的免疫系统，诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答，在抗感染性疾病和抗肿瘤方面发挥重要作用。DNA疫苗既具有减毒疫苗的优点，同时又无逆转的危险，还可以通过各种免疫佐剂加强免疫效果。DNA疫苗在免疫应答中能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，并应用在小鼠、绵羊、鸡、猴和黑猩猩等多种动物身上均获得成功，但是它在诱导免疫应答中的效率相对较低，影响了它的实际应用，因此寻找能够提高核酸疫苗免疫效率的分子是亟需解决的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种预防单纯疱瘆病毒II型的疫苗。
[0006]上述发明目的通过以下技术方案实现的:一种预防单纯疱瘆病毒II型的疫苗，包括真核表达质粒和重组质粒，真核表达质粒和重组质粒以2:1的质量比混合；所述真核表达质粒为含全长的糖蛋白D基因的pcDNA3-Kan质粒，所述重组质粒为含如SEQ ID N0.1所示的基因序列的pcDNA3-Kan质粒。
[0007]本发明的有益效果:较之DNA疫苗免疫效率低的特点，本发明引入SEQ ID N0.1所示的基因序列的重组质粒辅佐HSV-2 gD DNA疫苗，有效的诱导机体产生特异性的体液免疫应答，构建机体抵抗HSV-2感染的第一道防线，降低发病率；激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，可以更好的清除感染病毒。
[0008]【附图说明】:
图1小鼠血清抗gD IgG抗体水平结果图。
[0009]图2小鼠淋巴细胞增殖能力结果图。
[0010]图3小鼠外周血⑶4+和⑶8+T细胞百分率结果图。
[0011]图4小鼠血清中趋化因子RANTES含量结果图。
[0012]图5小鼠外周血分泌IFN-γ和IL-4 T细胞百分率结果图。
[0013]图6致死量HSV-2病毒感染后小鼠的存活率结果图。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0015]实施例1:真核表达质粒的获得
利用分子生物学技术PCR法、酶切、连接及克隆筛选将载体pcDNA3上原有抗性氨苄霉素(Amp)替换成卡那抗性(Kan)后，构建真核表达质粒载体pcDNA3_Kan。PCR法扩增HSV-2sav株糖蛋白D全基因序列(gD)，克隆重组后获得含gD的重组质粒pcDNA-Kan/gD，该重组质粒pcDNA-Kan/gD及其具体的制备方法已与“何方等中国卫生检验杂志，2008，18(6):997-999”中公开。
[0016]实施例2:重组质粒的获得
取活化的T细胞，用Rneasy Mini Kit (QIAGEN)提取总RNA，以Oligod(T)n为引物，逆转录合成第一链cDNA。参照NCBI核酸数据库收录的编号为BCl 19225.1序列，设计一对引物，以合成的cDNA为模板，扩增获得SEQ ID N0.1。上游引物序列为5'~GCCGAATTCATGATAGAAACATACAGCCAACCT-3 ’，下游引物序列为 5 ’ -GACCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAAGA-3 ’。
[0017]将SEQ ID N0.1所示的基因序列和pcDNA3_Kan用EcoRI和Xho I双酶切后切胶纯化回收。回收所得片段，以1:5摩尔浓度在T4连接酶作用下进行连接。将连接产物转化入DH5 α的感受态菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落接种于含Kan抗性的LB培养液中摇振过夜，抽提后得到重组质粒。
[0018]上述用于构建卡那霉素抗性的pcDNA3质粒购自Invitrogen公司，序列和物理图谱见该公司的产品目录。HSV-2型病毒是HSV-2 sav株。
[0019]实施例3:将实施例1和2获得的质粒用于免疫小鼠 1.实验材料:
I)将实施例1和2获得的质粒分别在E.coli中扩增，用QIAGEN纯化试剂盒纯化。用紫外分光光度法测定质粒的浓度和纯度，DNA的浓度和纯度通过0D260和0D280确定，选取0D260/0D280比值在1.8-2.0的质粒DNA去免疫小鼠。两种质粒分别于_20°C低温冻存，免疫小鼠前解冻并根据质量比2:1将两种质粒混合。
[0020]2)冻存HSV-2病毒sav3反复冻融三次。离心后取上清加入到单层Vero细胞上，37°C孵育lh。去掉病毒液体，加入4%FBS DMEM完全培养基，35°C培养24-48h。贴壁细胞用细胞刮板刮下，加入lml/bottle DMEM不完全培养液重悬后，-80°C冻存。倍比稀释的HSV-2病毒悬液腹腔感染小鼠200 μ L/只，每天记录小鼠死亡数，观察两周，计算半数致死量(median lethal dose，LD50)。
[0021]3)选取48只18-22g清洁级BALB/c雌性小鼠，随机分4组。分别为pcDNA3_Kan(A组)、pcDNA3-Kan+实施例1获得的质粒(B组)、将实施例1和2获得的质粒按照质量比2:1混合(C组)和实施例1获得的质粒(D组)。
[0022]2.实验方法 (O免疫及攻毒方案
免疫剂量:小鼠后腿肌内注射10yL/只，隔3周加强免疫I次，共免疫两次，剂量相同。加强