免疫后第3周，每组随机选取4只小鼠进行攻毒实验。腹腔感染200 yL/只20 X LD50 HSV-2病毒悬液，每天观察并记录小鼠体重、发病数和死亡数，观察2周，确定保护效果。
[0023](2)免疫小鼠样本的收集
每次免疫后第2周收集小鼠尾静脉血200 μ L并分离血清，所有样本于_20°C保存。加强免疫后第3周每组剖杀8只小鼠，眼眶取血后分离血清；无菌取小鼠脾脏，经200目尼龙纱布网滤过后制备单个细胞悬液备用。
[0024](3)用酶联免疫吸附实验(ELISA)测特异性IgG抗体
PH9.6的碳酸缓冲液稀释Vero细胞培养HSV-2，以每孔ΙΟΟμ?的量加至96孔板中，4°C过夜。次日用含2%85八的？85封闭，每孔加入15(^，37°0作用211。PBS清洗一次。每孔加入10PLl: 20稀释血清(含10% FBS的PBST)，同时设定复孔2个，阴性参照、阳性参照和空白孔。37°C孵育30min。用PBST洗板5次。每孔加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgGlOOPL，37°C孵育30min。用PBST洗板5次后每孔加入ΙΟΟμ?ΤΜΒ显色液，避光放置10-15min，每孔加入50uL 2M H2SO4，终止显色反应。用酶标仪测吸光度A450值。所测样本的A450/阴性对照A450 3 2.1为阳性，否则为阴性。
[0025](4) MTS比色法检测小鼠脾脏T淋巴细胞增殖能力
加强免疫后第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠按常规方法制备脾脏细胞悬液，在96孔细胞培养板上加入细胞5 X 15个/孔。将细胞培养板分为3部分:分别为特异性抗原刺激孔，50μ8/πι1灭活单纯疱瘆病毒；非特异性抗原刺激孔，lOPg/ml ConA ;对照孔，RPMI1640完全培养液。将细胞培养板置于37°C ,5% CO2，细胞培养箱中培养68h，加MTS4(^L/孔继续培养4h，酶标仪测A值。计算刺激指数SI=(实验组A值-空白组A值)/ (阴性对照组A值-空白组A值)。
[0026](5)流式细胞仪检测外周血中⑶4+和⑶8+T细胞百分率
加强免疫第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠眼眶取血，肝素钠抗凝处理收集的血液，分别加入FITC标记的单抗⑶4 +和PE标记的单抗⑶8 +，避光孵育30 min，PBS洗涤3次后，流式细胞仪分析。
[0027](6) ELISA法检测BALB/c小鼠血清中趋化因子RANTES(调节活化正常T细胞表达与分泌的趋化因子，regulated upon activat1n normal T cell expressed and secretedfactor);按Mouse RANTES ELISA试剂盒(eB1science公司)说明检测加强免疫后第3周小鼠血清RANTES的含量。
[0028](7)流式细胞仪检测外周血分泌IFN- γ和IL-4的T细胞百分率
加强免疫后第3周，4组BALB/c小鼠随机取8只小鼠眼眶取血，肝素钠抗凝处理收集的血液，加入RPMI1640完全培养液(含20ng/ml佛波酯、I ymol/L离子霉素和0.7 μ 1/ml莫能霉素)刺激培养4h ;加入红细胞裂解液室温裂解1min ;染色缓冲液洗涤后加固定透化液室温避光孵育20min，BD缓冲液洗涤后加入流式抗体IFN-γ和IL-4 ;室温避光染色30min，BD缓冲液洗涤后加PBS500 μ I/管重悬细胞，流式细胞仪分析。
[0029]3.免疫结果及分析
(O实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了特异性IgG抗体水平。
[0030]用ELISA法分别检测初免后第2周和初次免疫后第5周小鼠血清中的抗gD IgG抗体，血清以1:20稀释。我们发现与未加实施例2所得质粒的其它三组相比，实施例1和2获得的质粒的共同免疫明显提高了抗gD IgG抗体产生(图1)，差异有统计学意义(P〈0.05)。
[0031](2)实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠T细胞增殖能力。
[0032]C组刺激指数高于其它各组，差异有统计学意义(P〈0.05);灭活单纯疱瘆病毒刺激指数高于ConA，差异有统计学意义(P〈0.05)(图2)。
[0033](3)C组小鼠外周血的⑶4+T细胞百分率和⑶8+T细胞百分率最高，与其它三组均有显著性差异(P〈0.05)。各组间⑶4+/⑶8+比值变化并不明显(图3)。
[0034](4)实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠血清与细胞免疫相关的趋化因子RANTES水平。
[0035]ELISA法分析加强免疫后第3周小鼠血清中RANTES水平。结果显示经2次免疫后，C组的RANTES含量最高，含量达到了 676.633 pg/mL，明显高于其它三组，各组间有显著性差异(Ρ〈0.05)(图4)。
[0036](5)实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠外周血分泌IFN-γ Thl细胞百分率。
[0037]C组外周血分泌IFN-γ Thl细胞百分率最高，显著高于pKan+pgD组和pgD组(P〈0.05)，极显著高于pKan组(P〈0.01 )。各组的所产生的IL-4浓度从高到低为A组、B组、D组、C组，且各组间有明显差异(P〈0.05)(图5)。
[0038](6)实施例1和2获得的质粒的共同免疫提高了小鼠抗致死量HSV-2的攻击。
[0039]小鼠用致死量HSV-2攻击，攻击后第2周统计死亡小鼠数量，以此确定疫苗的保护率。结果显示C组存活3只，保护率为75 % ；B组和pgD组都各自存活2只，保护率为50% ；A组保护率为O。其中A组小鼠攻毒后第7天开始出现死亡情况，第9天后全部死亡；其它三组小鼠的死亡时间集中在第8天和第9天，B组存活率最高达75%，B组和D组为50% (图6)。以上结果说明，含有SEQ ID N0.1所示的基因序列的重组质粒与pcDNA-Kan/gD的结合，能够提高小鼠抗致死量HSV-2的攻击。
【主权项】
1.一种预防单纯疱瘆病毒II型的疫苗，其特征在于，包括真核表达质粒和重组质粒，真核表达质粒和重组质粒以2:1的质量比混合；所述真核表达质粒为含全长的糖蛋白D基因的pcDNA3-Kan质粒，所述重组质粒为含如SEQ ID N0.1所示的基因序列的pcDNA3_Kan质粒。
【专利摘要】本发明公开了一种预防单纯疱疹病毒II型的疫苗。本发明通过分子生物学手段，将单纯疱疹病毒II型的糖蛋白D基因组合到含卡那抗性的真核表达载体pKan中，构建包括含全长的糖蛋白D基因的真核表达质粒pgD和含如SEQ ID NO.1所示的基因序列的重组质粒的DNA疫苗。这种DNA疫苗免疫机体可产生有效的体液免疫和细胞免疫，预防和治疗单纯疱疹病毒II型感染的疾病如生殖器疱疹等疾病。
【IPC分类】A61K48-00, A61P31-22, A61K39-245
【公开号】CN104721839
【申请号】CN201510116973
【发明人】陶薇, 洪艳, 胡如西, 傅婷, 何卓晶, 贾岚
【申请人】浙江省医学科学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年3月17日