预防肿瘤转移、癌症治疗和预后及鉴定为推定转移抑制剂的试剂的方法
【专利说明】预防肿瘤转移、癌症治疗和预后及鉴定为推定转移抑制剂 的试剂的方法
[0001] 抟术领域和发背景
[0002] 本发明，在其一些实施方案中，涉及预防肿瘤转移、癌症治疗和预后及鉴定为推定 转移抑制剂的试剂的方法。
[0003] 细胞运动性支持包括肿瘤转移在内的各种生理和病理过程（Ridley，2011)。迀 移的开始由肌动蛋白聚合和促使板状伪足和丝状伪足形成的Rho家族GTP酶驱动。越来 越多的证据使得另一类肌动蛋白驱动的突出，称为侵袭伪足牵连于基质降解中（Murphy和 C〇urtneidge，2011)。为进行转移，乳腺癌游走细胞形成侵袭伪足并渗入附近血管中。旨在 表征与乳腺癌细胞向肺部（Minn等，2005)和脑部（Bos等，2009)转移相关的基因表达特征 的研宄鉴定了成为定点转移基础的多组基因。有趣的是，两组均包括表皮生长因子（EGF) 家族的成员，表明通过共用受体EGFR发信号支持转移性传播。
[0004] 胞内运输作为细胞迀移和肿瘤进展的关键特征出现（Mosesson等，2008)。例如， 已经证实突变体P53通过增强型整联蛋白和取决于Rab偶联蛋白（RCP)的EGFR运输促进 转移（Muller等，2010)。随同Rab蛋白一起，磷酸肌醇通过确定囊泡同一"性在细胞区域化 中起关键作用（Yuan和Cantley，2008)。例如，在PI (4, 5) P2 (磷脂酰肌醇-4, 5二磷酸）的 D3位置通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)的磷酸化生成侵袭伪足形成所必需的PI (3, 4, 5) P3(Yamaguchi等，2011)。类似地，PI (4, 5)己调节控制胞吞作用和肌动蛋白动力学特性的 多种蛋白质（Saarikangas等，2010)，但是其水平受另外两类酶严格控制：磷脂酶C(PLCy) 促进PI (4, 5)P2水解，这样激活丝切蛋白（Cofilin)(-种肌动蛋白切割蛋白）并且驱动乳 腺细胞迀移（van Rheenen等，2007)。同样，肌醇多磷酸5-磷酸酶，例如突触囊泡磷酸酶 2 (SYNJ2)，为肌醇环的D5位置脱去磷酸并且控制神经胶质瘤细胞迀移（Chuang等，2004 ; Malecz等，2000)。另外在某些前列腺癌样品中鉴定出纯合突变，Rossi等Cancer Genet Cytogenet. 2005 年 9 月；161(2):97-103。
【发明内容】
[0005] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种预防肿瘤转移的方法，条件是所 述肿瘤不是神经胶质瘤，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡磷酸 酶2 (SYNJ2)抑制剂，从而预防肿瘤转移。
[0006] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种治疗癌症的方法，所述方法包括 向有需要的受试者施用治疗有效量的突触囊泡磷酸酶2 (SYNJ2)抑制剂和与癌症发作或进 展相关的细胞表面受体的抑制剂，从而治疗癌症。
[0007] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种用于预防肿瘤转移的突触囊泡磷 酸酶2 (SYNJ2)抑制剂，条件是所述肿瘤不是神经胶质瘤。
[0008] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种用于治疗癌症的突触囊泡磷酸酶 2 (SYNJ2)抑制剂和一种用于治疗癌症与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂。
[0009] 根据本发明的一些实施方案，与癌症发作或进展相关的细胞表面受体为受体酪氨 酸激酶。
[0010] 根据本发明的一些实施方案，所述受体酪氨酸激酶为ErbB受体。
[0011] 根据本发明的一些实施方案，所述ErbB受体为表皮生长因子受体（EGFR)。
[0012] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种鉴定肿瘤转移的推定抑制剂的方 法，所述方法包括在试验试剂的存在下，分析SYNJ2介导的PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2的加 工，其中在试验试剂的存在下PI (3, 4, 5)?3向PI (3, 4)P2的加工与试验试剂不存在时相比减 少，表明为肿瘤转移的推定抑制剂。
[0013] 根据本发明的一些实施方案，所述分析SYNJ2介导的PI (3, 4, 5) ?3向PI (3, 4) P 2的 加工通过竞争测定法进行。
[0014] 根据本发明的一些实施方案，所述竞争测定法测定PI (3, 4)P2结合结构域从包含 与PI (3, 4)P2结合的PI (3, 4)P 2结合结构域的复合物的位移。
[0015] 根据本发明的一些实施方案，所述竞争测定法为荧光偏振竞争测定法。
[0016] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种在有需要的受试者中癌症预后的 方法，所述方法包括测定受试者癌细胞中SYNJ2的水平或活性，其中在受试者癌细胞中所 述SYNJ2的活性水平与在未受影响的对照样品的细胞中相比上调，表明预后不良。
[0017] 根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括使用金标法增进预后。
[0018] 根据本发明的一些实施方案，所述金标法包括标记的检测。
[0019] 根据本发明的一些实施方案，所述标记选自HER-2和雌激素受体（ER)。
[0020] 根据本发明的一些实施方案，所述转移为EGF依赖型。
[0021] 根据本发明的一些实施方案，所述癌症为乳腺癌。
[0022] 根据本发明的一些实施方案，所述SYNJ2抑制剂选自小分子、抗体、肽和核酸沉默 剂。
[0023] 根据本发明的一些实施方案，所述小分子选自表2中所列的分子。
[0024] 根据本发明一些实施方案的一方面，提供了一种用于治疗癌症或预防癌转移的制 品，其包括包装SYNJ2抑制剂和与癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制剂的包装材 料。
[0025] 根据本发明的一些实施方案，与所述癌症发作或进展相关的细胞表面受体的抑制 剂为抗体。
[0026] 根据本发明的一些实施方案，与所述癌症发作或进展相关的所述细胞表面受体的 所述抑制剂为小分子抑制剂。
[0027] 除非另有定义，本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域中普 通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等效的方法和材料可用于本发 明实施方案的实践或试验中，但下面对示例性方法和/或材料进行了描述。如有冲突，以包 括定义在内的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅为说明性而非旨在必定限制。
[0028] 附图简沐
[0029] 本文仅以举例的方式，参考附图描述本发明的一些实施方案。现详细地具体参考 附图，应强调的是所示细节是举例而言并且是为了说明性讨论本发明的实施方案。在这点 上，以附图做出的描述使得本发明的实施方案可如何实践对本领域的技术人员显而易见。
[0030] 图中：
[0031] 图IA-I显示EGF促进乳腺细胞的侵袭性生长并诱导了一组特定的基因。图IA-在 生长因子不存在时接种MCFlOA细胞并使其形成细胞团。72h后，用指定生长因子（各IOng/ mL)处理细胞并在24h后拍摄相衬图像（比例尺，50 μπι)。图IB-按指示，在指定配体（IOng/ mL)的存在下，在迀移或侵袭小室内接种MCFlOA细胞，并且在18h后，迀移到下部隔室的细 胞经结晶紫染色（左图）。示出了迀移和侵袭信号的量化，归一化为EGF处理的效应。数据表 示三份生物样品来自重复两次的代表性实验的平均值土S.D.(右图）。图IC-在transwell 插件中将MCFlOA细胞接种于含EFG，没有或有抑制剂AG-1478 (1 μ M)、U0126 (5 μ Μ)或渥曼 青霉素（Wortmannin) (200ηΜ)的培养基中，并使其迀移18h。数据表示三份样品的平均值 土S. D.。实验重复两次。图ID-人乳腺MCFlOA细胞中受EGF (而不是受血清（Amit等，2007)) 特异性诱导的一系列425个基因与在MDA-MB-231细胞转移的情况下上调的基因（1，597个 基因）交叉（Minn等，2005)。23个重叠基因中的一个编码5'-磷脂酰肌醇脂质磷酸酶突 触囊泡磷酸酶-2(3￥即2)。图巧-用编码1^(^((^1'1)或5￥即2-6??(5￥即2-(?)的慢病毒粒 子感染MCFlOA细胞。通过免疫印迹法测定内源SYNJ2和SYNJ2-GFP融合蛋白的表达水平， 并通过对微管蛋白的探测确认蛋白质负荷相等。图IF-在EGF不存在（NT)或存在（IOng/ mL)时在迀移小室内接种MCFlOA细胞的Ctrl和SYNJ2-0X克隆（5 X IO4个细胞/孔）并使 其迀移22h。到达滤器另一侧的迀移细胞经结晶紫染色并拍摄图像。图IG-用SiRNA对照 (siCtrl)或针对SYNJ2的siRNA (siSYNJ2)转染MCFlOA细胞，并且在36h后通过免疫印迹 法测定SYNJ2的蛋白质水平。通过对Ras-GAP的免疫印迹确认蛋白质负荷相等。图IH-在 EGF不存在（NT)或存在（10ng/mL)时在迀移小室内接种G中提供的细胞（5X IO4个细胞/ 孔）并使其迀移22h。到达滤器下表面的迀移细胞经结晶紫染色并捕捉图像。图II-用指 定siRNA处理MCFlOA细胞的铺满培养物。一旦形成单层，就使其进入监测擦伤闭合速率的 自动化擦伤系统。
[0032] 图2A-E显示EGF对SYNJ2的转录诱导促进侵袭性生长。图2A-用EGF (20ng/mL) 或血清（5% )刺激血清饥饿MCFlOA细胞，并且使用微阵列或RT-qPCR测定SYNJ2 mRNA表 达。图2B-按指示用EGF刺激MCFlOA细胞，提取并做免疫印迹。图2C-在EGF不存在或存 在时，培养感染了编码GFP-SYNJ2(SYNJ2-0X)或作为对照（Ctrl)的LacZ的病毒的MCFlOA 细胞4天。使用鬼笔环肽和DAPI获得相衬图像（上，比例尺：100 μπι)和共聚焦图像（下， 比例尺：20μπι)。图2D-E-在EGF不存在（NT)或存在（10ng/mL)时在迀移或侵袭小室内培 养MCFlOA细胞（5-6 X IO4个细胞/孔）22h。到达滤器底部的细胞染色并且量化滤器的覆 盖范围（平均值土S.D·)。
[0033] 图3A-G显示乳腺细胞迀移和侵袭伴有SYNJ2向前缘的诱导型易位。图3A-用编码 LacZ(Ctrl)或V5标记的SYNJ2(SYNJ2-V5)的慢病毒粒子，连同对照shRNA (shCtrl)或针对 SYNJ2的shRNA(shSYNJ2) -起，感染MDA-MB-231细胞。通过免疫印迹法测定V5-SYNJ2和 内源SYNJ2的蛋白质水平。通过对AKT的免疫印迹确认蛋白质负荷相等。图3B-稳定过表 达SYNJ2或作为对照的LacZ的MDA-MB-231细胞的相位图像（左图）和侵袭图像（右图）。 使用侵袭测定法测定侵袭能力，一式三份，并且量化侵袭细胞并归一化为对照（Ctrl)。比 例尺，50μπι。图3C-用针对SYNJ2的siRNA寡聚核苷酸（或siCtrl)转染MDA-MB-231细 胞。36h后，通过免疫印迹法测定SYNJ2的蛋白质水平。通过对Ras-GAP的免疫印迹确认蛋 白质负荷相等。图3D-在迀移或侵袭小室内接种来自C的细胞并培养18h。量化迀移和侵 袭信号并归一化为经EGF处理的siCtrl细胞。所示数据为三份样品的平均值土 S. D.。图 3E-将瞬时表达GFP-SYNJ2的MDA-MB-231细胞涂到盖玻片上并用TGFa (lOng/mL)刺激。 (每IOs)拍摄延时显微照片。倒置所示图像，黑斑表示SYNJ2及其在板状伪足基部的组件。 比例尺，10 μ m。图3F-使用TRITC-鬼笔环肽对MDA-MB-231细胞的内源SYNJ2和F-肌动 蛋白免疫染色。正方形区域放大。比例尺，10 μ m。图3G-用EGF刺激MCFlOA细胞18h，然 后使用TRITC-鬼笔环肽对内源SYNJ2免疫染色而F-肌动蛋白复染。比例尺，10 μ m。
[0034] 图4A-F显示SYNJ2的催化活性对于侵袭性生长必不可少。图4A-B-在5 % Matrigel 中接种表达 SYNJ2 (SYNJ2-0X)或针对 SYNJ2 的 shRNA (shSYNJ2)的 MDA-MB-231 细 胞以及对照细胞。6天后捕捉图像，并量化侵袭性球体（平均值土S.D.)。比例尺，50μπι。 图4C-D-用野生型SYNJ2(shSYNJ2+SYNJ2 WT)或用催化失能的突变体（shSYNJ2+SYNJ2GD)感 染表达shSYNJ2的MDA-MB-231细胞。按指示提取细胞并做免疫印迹，或使其在侵袭小室内 侵袭18h。示出了侵袭细胞及其标准量化的图像（平均值土S.D.)。图4E-示出了在纤连 蛋白上生长的shCtrl和shSYNJ2细胞的扫描电子显微照片。比例尺，2 μ m。图4F-指定 MDA-MB-231细胞中经鬼笔环肽和DAPI染色的F-肌动蛋白的图像。示出了 Z轴部分（线） 和放大区域。箭头标记溶胀结构。比例尺，10 ym。
[0035] 图5Α-Η示出了 SYNJ2的亚细胞定位。图5Α-用RFP-网格蛋白转染表达GFP-SYNJ2 的MDA-MB-231细胞并接种于涂有纤连蛋白的板上。使用转盘式显微镜术，每5s为细胞成 像。箭头标记新形成的前缘。比例尺，5 μ m。图5B-描绘SYNJ2在前缘（上面两行）和细胞 体下面装配和分解的代表时帧。对于下面的行而言，细胞经mCherry-lifeACT质粒转染并 接种于胶原上。之后，间隔Imin为细胞成像。插入箭头以便参考。注意时间尺度的差异。 比例尺，1 μ m。图5C-同时通过TIRF和落射荧光显微镜术为细胞成像并将信号转换成波动 曲线（X轴）。箭头标记信号起始。比例尺，5μηι。图5D-在用Dyng〇-4a(30yM;-种发动蛋 白-2抑制剂）处理前5min和处理后5min，使用转盘式共聚焦显微镜术为细胞成像。比例 尺，5 μ m。图 5E-用 Dyng〇-4a (30 μ M ;30min)或用溶剂（DMSO)预培养稳定表达 GFP-SYNJ2 的MD