利用抗-EphA4抗体效应物作用损伤细胞的方法

专利名称：：利用抗-EphA4抗体效应物作用损伤细胞的方法
技术领域：
：本发明涉及利用抗-EphA4抗体的效应物作用损伤细胞的方法，还涉及对该方法有用的组合物。
背景技术：
：胰腺癌症(pancreaticcancer)在所有恶性肿瘤中是死亡率最高者之一，患者的5年存活率为4%。每年大约28,000名患者被诊断为胰腺癌症，几乎所有患者都会死于该疾病(Greenlee,R.T.，"(2001)CACancerJClin,57:15-36)。此恶性肿瘤的预后不良，这是由于早期诊断困难和对目前的治疗方法反应不佳(Greenlee，R.T.,"a/.(2001)CACancerJClin,57/15-36，Klinkenbijl,J.H.,da/,(1999)AnnSurg,230:776-82;discussion782-4.)。特别是目前还没有鉴定可在疾病的有望治愈的早期实现可靠筛选的肿瘤标志物。旨在阐明致癌机制的研究已揭示了许多用于研制抗肿瘤剂的候选靶分子。例如，法尼基转移酶抑制剂(FTI)已被证明可有效治疗动物模型中Ras依赖型肿瘤(SunJa/.,(1998)Oncogene,16:1467-73)。这种药物被开发用于抑制与Ras相关的生长信号通路，该生长信号通路依赖于转录后的法尼基化。在人体临床试验中，为了对抗原癌基因HER2/neu，将抗肺瘤剂与抗-HER2单克隆抗体曲妥单抗(trastuzumab)联合应用，已经成功地改善了临床反应，提高了乳腺癌患者的总体存活率。酪氨酸激酶抑制剂STI-571是一种选择性失活bcr-abl融合蛋白的抑制剂。该药物被开发用于治疗慢性髓细胞样白血病，该病中bcr-abl酪氨酸激酶的持续活化在白细胞的转化中发挥重要作用。此类药物被设计用于抑制特定基因产物的致癌活性(MolinaMA,a/.,(2000)CancerRes,16:4744-9)。因此，在癌细胞中，表达升高的基因产物通常是开发新型抗肺瘤剂的潜在靶标。另一种癌症治疗策略涉及应用与癌细胞结合的抗体。以下是抗体介导的癌症治疗的代表机制导弹疗法(missiletherapy):在该方法中，将药物与能够特异性结合癌细胞的抗体结合，从而使所述药物得以特异性作用于癌细胞。通过这种定向分布，即使有较强副作用的药物也能集中地作用于癌细胞。除药物之外，还报道了将药物前体、将前体代谢成活性形式的酶等与抗体结合的方法。靶向功能分子的抗体的应用这种方法利用例如结合生长因子受体或生长因子的抗体来抑制生长因子与癌细胞之间的结合。一些癌细胞的增殖高度依赖于生长因子。例如，已知一些癌症的细胞生长依赖于表皮生长因子(EGF)或血管内皮生长因子(VEGF)。对于这样的癌症，预期抑制生长因子与癌细胞之间的结合可有治疗作用。抗体细胞毒性在癌细胞中，与某些种类抗原结合的抗体可获得细胞毒性。对于所述抗体类型，抗体分子本身具有直接的抗肺瘤作用。显示对癌细胞的细胞毒性的抗体作为预期高效抗肿瘤的抗体试剂，正逐渐引起关注。发明的公开本发明人先前公开是与胰腺癌症有关的基因，其在胰腺癌症细胞中表达是上调的。参见WO2004/031412,其全文以提述方式并入本说明书。本发明人进一步^^开了针对的siRNA抑制胰脏细胞增殖。参见WO2005/0830S6，其全文以提述方式并入本说明书。在本文中，本发明人研究了能够诱导细胞毒性的抗体，集中关注在癌细胞中显示表达增强的基因，例如五//l^。结果显示，当使EphA4表达细胞与抗-EphA4抗体接触时，可以在所述细胞中诱导强细胞毒性，从而完成了本发明。具体地，本发明涉及以下药物组合物或方法一种损伤EphA4表达细胞的药物组合物，所述组合物包含抗-EphA4抗体作为活性成分，其中抗体具有抗体效应物作用；[1]的药物组合物，其中EphA4表达细胞是胰腺癌症细胞；[3][l]的药物组合物，其中抗-EphA4抗体是单克隆抗体；[4][l]的药物组合物，其中抗体效应物作用或者是抗体依赖性细胞毒性，或者是补体依赖细胞毒性，或者两者都是；[1]的药物组合物，其中抗体由VH链和VL链组成，每条VH链和VL链具有被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，称作CDR1、CDR2和CDR3，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列选自下组人VHCDR1:ELS顧(SEQIDNO:10)，人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11),人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12),人VLCDR1::SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2::SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3::AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAA額(SEQIDNO:20)，人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22),人VLCDR1::SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25)，人VLCDR3::GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26);[5]的组合物，其中人VH对应于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL对应于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列；[5]的组合物，其中抗体进一步包含人IgGl的Fc域；[8]—种抗体，其由VH链和VL链组成，每条VH链和VL链有被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，称作CDR1、CDR2和CDR3，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列选自下组人VHCDRl:ELSMH(SEQIDNO:10)，人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11),人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12),人VLCDRl:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15)，人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3:AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDRl:SNSAA額(SEQIDNO:20),人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22)，人VLCDR1:SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3:GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26);[8]的抗体，其中人VH对应于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL对应于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列；[8]的抗体，其中抗体进一步包含人IgGl的Fc域；一种分离的多核苷酸，其编码[8]的抗体；—种载体，其包含[ll]的多核香酸；—种分离的宿主细胞，其包含[12]的载体；一种产生抗体的方法，其包含如下步骤培养[13]的宿主细胞从而表达多核苷酸，并从宿主细胞培养物回收抗体；—种用于损伤EphA4表达细胞的药物组合物，其中该组合物包含[ll]的多核苷酸，或者包含[ll]的多核苷酸的载体；[16]—种用于损伤EphA4表达细胞的方法，其包含以下步骤a)使EphA4表达细胞与抗-EphA4抗体接触，和b)利用已与细胞结合之抗体的效应物作用来损伤EphA4表达细胞；[17]—种免疫原性组合物，用于诱导针对EphA4表达细胞具有效应物作用的抗体，其中所述组合物包含EphA4、其免疫学活性片段、或者可表—种用于诱导针对EphA4表达细胞具有效应物作用的抗体的方法，其中该方法包含施用EphA4、其免疫学活性片段，或者可表达EphA4或其免疫学活性片段的细胞或DNA的步骤；和一种用于治疗或预防受试者中胰腺癌症的方法，其包含对所述受试者施用药学有效量的抗-EphA4抗体或其免疫学活性片段的步骤，其中所述抗体具有抗体效应物作用。物，其中组合物包含抗-EphA4抗体作为活性成分。本发明还涉及抗-EphA4抗体用于产生药物组合物的用途，其中所述药物组合物利用抗-EphA4抗体效应物作用来损伤EphA4表达细胞。本发明的药物组合物由抗-EphA4抗体8和药物可接受的载体组成。本发明人使用CDNA微阵列，对从前列腺癌和胰腺癌症患者收集的前列腺癌或胰腺癌症细胞和正常细胞进行了基因表达分析。接着鉴定出若干在胰腺癌症细胞中表达明显增强的基因。从这些在胰腺癌症细胞中表达改变的基因中选择了一种基因，即在主要器官中低水平表达的编码细胞膜蛋白的Eph受体A4(本说明书中称为"EphA4")基因，作为胰腺癌症治疗的候选乾基因(NakamuraT,etal.(2004)Oncogene.2004Mar25;23(13):2385-400)。推测通过选择在主要器官中低水平表达的基因可以避免副作用的危险。在由以这种方式选择的基因编码的蛋白质中，确认抗-EphA4抗体具有针对EphA4表达细胞的抗体效应物作用。本发明人得到的结果显示，在强制表达系统(forcedexpressionsystem)中，带c-myc-His标签的EphA4定位于细胞膜中，这是利用免疫焚光显微技术证实的。EphA4基因编码一种预期在其N-末端作为信号肽发挥作用的氨基酸序列。如上所述，观察到这种蛋白质主要定位于细胞膜中，因此，推定其是一种跨膜蛋白。此外，这种基因在主要器官中低水平表达，在胰腺癌症细胞中高水平表达，确保了EphA4成为一种有用的临床标志物和治疗輩巴标。举例来说，利用效应物作用破坏癌症细胞所需的条件如下-大量抗原分子在癌症细胞膜表面表达，-抗原在癌组织中均匀分布，与抗体结合的抗原在细胞表面存留较长时间。更具体地说，例如，由抗体识别的抗原必须在细胞膜表面表达。此外，优选在形成癌组织的细胞中抗原阳性细胞的比例尽可能高。理想状态下，所有癌细胞都是抗原阳性的。当癌症细胞群中掺杂了抗原阳性和抗原阴性细胞时，对其特异的抗体的临床疗效会大大减少。通常，当在细胞表面表达最大可能数目的分子时，可预期强力的效应物作用。与这样的抗原结合的抗体不被摄入细胞这一点也很重要。一些受体与配体结合后被摄入细胞(胞吞作用)。同样地，与细胞表面抗原结合的抗体也可被摄入细胞。这种抗体被摄取进入细胞的现象称为内化作用(internalization)。内化作用发生时，抗体恒定(Fc)区被摄取进入细胞。然而，效应物作用所必需的细胞或分子保留在抗原表达细胞外。因此，内化作用抑制抗体效应物作用。所以，当需要抗体效应物作用时，选择一种产生有限的抗体内化作用的抗原是很重要的。本发明人首次显示，EphA4是具有这样的性质的靶抗原。除非另有特定的说明，本说明书中使用的词语"一个(a)"或"一种(an)"或"该(the)"是指至少一个或至少一种。"分离的"或"纯化的"多肽是基本上不含细胞物质(例如糖类、脂质或来源于该蛋白所由来的细胞或组织源的其它污染蛋白)的多肽，和/或在其为化学合成时基本上不含化学前体或其它化学物质的多肽。术语"基本上不含细胞物质，，包括多肽的制备物，其中该多肽与细胞(该多肽分离自该细胞或者在该细胞中重组表达)的细胞组分分开。因此，基本上不含细胞物质的多肽包括这样的多肽制备物，其中多肽制备物含异源蛋白(本说明书中也称为"污染蛋白，，)少于约30%、20%、10%或5%(以干重计)。当多肽为重组产生时，还优选其基本上不含培养基，包括培养基少于蛋白质制备物体积的约20%、10%或5%的多肽制备物。当多肽是由化学合成产生时，优选基本上不含化学前体或其他化学物质，包括这样的多肽制备物，其中蛋白合成中涉及的化学前体或其他化学物质少于蛋白质制备物体积的约30%、20%、10%或5%(以干重计)。例如，通过随后对蛋白制备物进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳及凝胶考马斯亮蓝染色，出现单一条带，可以证明蛋白制备物含有分离的或纯化的多肽。在优选的实施方案中，本发明的抗体或其片段是分离的或纯化的。"分离的"或"纯化的"核酸分子是与该核酸分子的天然源中存在的其它核酸分子相分离的核酸分子。当由重组技术产生"分离的"或"纯化的"核酸分子(例如cDNA分子)时，其可基本上不含其它细胞物质或培养基，或者当其由化学合成时，其可基本上不含化学前体或其它化学物质。在优选的实施方案中，编码本发明的抗体或其片段的核酸分子是分离的或纯化的。"抗体，，和"免疫球蛋白"是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体显示对特异性抗原的结合专一性，而免疫球蛋白包括抗体和抗原特异性还没有得到确定的其它类抗体分子。例如，属于后一种类的多肽由例如淋巴系统低水平产生，而由骨髓瘤以更高的水平产生。"天然抗体和免疫球蛋白，，通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链(L)和两条相同的重(H)链组成。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键数目可不同。每条重链和轻链也具有间隔规则的链内二碌u键。每条重链的一端有一个可变域(VH)，其后是许多恒定域(CH)。每条轻链的一端有一个可变域(VL)，其另一端有一个恒定域(CL);轻链的恒定域与重链的第一个恒定域对齐，轻链的可变域与重链的可变域对齐。有人认为，某些氨基酸残基形成轻链和重链可变区之间的界面(Chothiaef(1985)JMolBiol.;186:651-63;NovotnyandHaber,(1985)ProcNatlAcadSciUSA.;82:4592-6)。术语"可变的，，指这样一个事实，即可变域的某些部分在序列上在抗体之间有很大的不同，.因此推定这些部分与每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性有关。然而，可变性并不是平均分布于抗体的整个可变区。相反，在轻链可变域和重链可变域中，可变性通常集中在三个区段，称为"互补决定区"(也称为"CDRs")或超变区。可变域中保守性更高的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域分别包括4个框架区，它们主要采取卩-折叠构型，由3个CDR连接，这3个CDR形成环，这些环连接该卩-折叠结构，在一些情况下构成p-折叠结构的一部分。每条链中的CDR被框架区紧密保持在一起，并与来自于其它链的CDR—道促成抗体的三维抗原结合4立点的形成(Kabat"/，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,NationalInstituteofHealth,Bethesda,Md.)。恒定区不直接参与抗体和抗原的结合，但是显示各种效应物作用，例如在抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。木瓜蛋白酶消化抗体得到两个相同的具有单一抗原结合位点的抗原结合片段，称为"Fab，，片段，和一个残余的"Fc，，片段。胃蛋白酶处理得到一个F(ab，)2片段，其具有两个抗原结合位点。"Fv"是包含完整的抗原识别和结合位点的最小抗体片段。这个区域通常是由一个重链可变域和一个轻链可变域紧密非共价联系而成的二聚体所组成。正是在这种构型中，每个可变域的3个CDR相互作用，从而在VH-VL二聚物表面上定义出一个抗原结合位点。6个CDR共同使抗体具有抗原结合特异性。然而，即使单一的可变域(或Fv的一半，仅包括3个对抗原特异的CDR)也能识别和结合抗原，虽然亲和力比完整的结合位点低。Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一个恒定域(CH-1)。Fab，片段与Fab片段不同，其重链CH-1域的C-末端增加了几个残基，包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。本说明书中，Fab，-SH用来指称恒定区的半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab，。F(ab，)2抗体片段最初是作为中间有铰链半胱氨酸的成对Fab，片段产生的。抗体片段的其它化学偶联在本领域中也是众所周知的。基于其恒定区的氨基酸序列，可将源自所有脊推动物物种的抗体(免疫球蛋白)的"轻链"分为两种明显不同的类型，分別称为k(kappa)和X(lambda)。根据其重链恒定区的氨基酸序列，可将免疫球蛋白分成不同种类。主要有5类免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,其中几类可进一步分成亚类(同种型)，例如，IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同种类免疫球蛋白相应的重链恒定区分别称为a、S、s、y和p。不同种类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型在本领域中是众所周知的。本说明书中使用的术语"单克隆抗体"指从基本上同种的抗体群体获得的抗体，即，除了少量存在的可能自然发生的突变之外，群体中的个体抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异的，定向针对单个抗原位点。此外，每种单克隆抗体定向针对抗原上的单个决定簇，这与传统(多克隆)抗体制备物不同，传统(多克隆)抗体制备物通常包括定向针对不同决定簇(表位)的不同抗体。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于它们可通过杂交瘤细胞培养合成，不会受其它免疫球蛋白污染。因此，修饰语"单克隆的，，表示抗体系获自基本上同一的抗体群体这一特征，并不解释为要求用任何特殊方法生产抗体。例如，本发明的单克隆抗体可通过由Kohler和Milstein(1975)Nature.;256:495-7首次提出的杂交瘤方法制备，或者可通过重组DNA方法制备(Cabillyda/.,(1984)ProcNatlAcadSciUSA.;81:3273-7)。本说明书所述单克隆抗体具体包括"嵌合"抗体或免疫球蛋白，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或者属于特定抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而该链的剩余部分与源自别的物种或者属于别的抗体种类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，只要它们显示所需的生4勿；舌'〖生(Cabillya/"supra;Morrisonefa/"(1984)ProcNatlAcadSciUSA.;81:6851-5),还包括所述抗体的片段。最常见的嵌合抗体或免疫球蛋白由人和鼠抗体片段组成，通常是由人的恒定区和鼠的可变区组成。非人(例如鼠)抗体的"人源化"形式是包含源自非人免疫球蛋白最小序列的特异性的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段。所述片段还包括Fv、Fab、Fab，、F(ab，)2以及抗体的其它抗原结合序列。大多数情况下，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种的CDR的残基(供体抗体)所取代，所述非人物种例如具有所需特异性、亲和力和能力(capacity)的小鼠、大鼠或兔。在有些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被相应的非人残基所取代。在本发明的上下文中，人源化抗体中仅有少数框架，两个，或优选一个框架，被非人残基的框架所取代。此外，人源化抗体可含有既不是在受体抗体中也不是在引入的CDR中发现的残基或框架序列。通常引入这些修饰以进一步改良和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体基本上全部包含至少一个，通常是两个可变域，其中所有或基本上所有与非人免疫球蛋白CDR区对应的CDR区以及所有或基本上所有框架区具有人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还优选包括免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。详情参见Jones&(1986)Nature.;321:522-5;Riechmann&a/.,(1988)Nat腦.;332:323-7;Presta,(1992)CurrOpinStructBiol.2:593-6。"单链Fv，，或"sFv"抗体片段由抗体的VH域和VL域组成，其中所述域存在于单个多肽链中。优选地，Fv多肽进一步包括VH域和VL域之间的接头，其使sFv能够形成抗原结合所需的三维结构。已经挺出许多方法以识别化学结构，用于将由来于抗体V区的、天然聚集但化学上分离的轻多肽链和重多肽链转化为sFv分子，后者会折叠成基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构(美国专利5,091,513、5,132,405和4,946,778;PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,vol.113,RosenbergandMooreeds.,Springer-Verlag，NewYork,pp.269-315(1994))。如上所述的Fc区(,拔、^T潜^)源自抗体的"Y"的柄部，由两条重链组成，每条重链贡献2-3个恒定域(依赖于抗体的种类)。Fc与各种细胞受体和补体蛋白结合。其以这种方式介导抗体不同的生理效应(调理作用，细胞溶解，肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒，以及其它过程)。一些细胞(例如肥大细胞和吞噬细胞)表面具有结合抗体的特异性受体。这些称为Fc受体，顾名思义，这些受体与一些抗体(例如IgA、IgG、IgE)的Fc区相互作用。特定的抗体与特定细胞上的Fc受体的结合会触发所述细胞的效应物作用(例如吞噬细胞吞噬，肥大细胞脱颗粒)，最终会导致入侵微生物的破坏。Fc受体是同种型特异的，这给了免疫系统非常大的灵活性，因为不同的情况仅需要某些免疫机制对抗原应答。因此，在本发明的上下文中，术语"效应物作用，，指与抗体的Fc区有关的细胞毒性。或者，效应物作用也可解释为一种决定由抗体的抗原识别触发的生物活性的作用。例如，驱动结合于抗原的抗体的Fc区损伤表达所述抗原的细胞的作用，也可称为抗体效应物作用。本说明书中优选的靶细胞是癌细胞。抗体与抗原的结合常常没有直接的生物学效应。相反，显著的生物学效应是抗体继发的"效应物作用"的结果。免疫球蛋白介导许多种这样的效应物作用。通常，要实现特定效应物作用，需要抗体与其抗原结合。然而，并非每种免疫球蛋白都会介导所有效应物作用。已知的抗体效应物作用的例子包括抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性和中和活性。每一种作用描述如下。抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC):由各种抗体的Fc区实现的效应细胞功能极大地依赖于抗体种类。存在包含对免疫球蛋白类IgG、IgE或IgA特异的Fc受体的细胞。IgG、IgE和IgA类抗体的Fc区各自与特异的Fc受体结合，表达相应Fc受体的细胞识別并与结合到细胞膜等的抗体结合。结果，例如，具有Fc受体的细胞被活化，并在细胞间抗体转运中发挥作用。举例来说，IgG类抗体被T细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞上的Fc受体所识别。这些细胞与IgG类抗体的Fc区结合并被它活化，并针对所述抗体结合的细胞表达细胞毒性。通过抗体效应物作用获得细胞毒性的细胞，例如T细胞、NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞，称为效应细胞。特别是IgG类抗体通过效应细胞上的Fc受体活化这些细胞，然后杀死抗体的可变区所结合的耙细胞。这称为抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)。可基于效应细胞的类型将ADCC划分如下ADMC:IgG依赖巨噬细胞介导的细胞毒性，和ADCC:IgG依赖NK细胞介导的细胞毒性。在本发明的ADCC中，对效应细胞类型没有限制。换言之，本发明的ADCC还包括ADMC,其中巨噬细胞是效应细胞。已知抗体的ADCC是产生抗肿瘤作用的一种重要机制，特别是在应用抗体的癌症治疗中(ClynesRA,da/.,(2000)NatureMed.，6:443-6.)。例如，抗-CD20抗体嵌合抗体的疗效与ADCC之间的密切关系已有报道(CartronG,da/.,(2002)Blood,99:754-8.)。因此，在本发明的上下文中，ADCC在抗体效应物作用中也是特别重要的。ADCC对于单克隆抗体临床疗效是一种关键的效应物作用，特别是在癌症治疗领域。例如，人们认为ADCC是已经开始临床应用的美罗华(Rit,n)、赫赛汀(Herceptin)等的抗肿瘤作用中的一种重要机制。美罗华和赫赛汀是已知的治疗药，分别用来治疗非何杰金氏淋巴瘤和转移性乳腺癌。目前，ADCC介导的细胞毒性的机制大致解释如下通过结合至细胞表面的抗体将效应细胞桥联到靶细胞上，认为效应细胞通过投递某种致死信号至耙细胞从而诱导耙细胞凋亡。更具体地说，主要通过一组具有激活和抑制活性的紧密相关的Fey受体介导ADCC。无论如何，在本发明的上下文中具有效应物作用的抗体中都包括通过效应细胞诱导细胞毒性的抗体。为了评价所述分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验，例如美国专利5,500,362或5,821,337中所描述的。可选地，或另外，可在体内如在动物模型中，评价所述分子的ADCC活性，例如Clynes"a/.,(1998)ProcNatlAcadSciUSA.;95:652-56中显示的。补体依赖细胞毒性(CDC):已知与抗原结合的免疫球蛋白的Fc区激活补体途径。也已经显示激活途径可能根据免疫球蛋白的种类而不同。例如，在人抗体中，IgM和IgG激活经典途径。另一方面，IgA、IgD和IgE则不激活该途径。即，激活补体的功能局限于IgM和IgG类抗体。特别地，对抗体可变区所结合的细胞的溶解作用称为补体依赖细胞毒性(CDC)。活化的补体通过若干反应产生C5b-9膜攻击复合物(MAC),其具有损伤细胞膜的活性。人们认为以这种方式产生的MAC损伤病毒颗粒和细胞膜，而不依赖于效应细胞。MAC介导的细胞毒性的机制的基础如下所述。MAC对细胞膜具有强亲和力。与细胞膜结合的MAC在细胞膜中开孔，使得水容易流进和流出细胞。结果使细胞膜不稳定，或使渗透压改变，从而细胞被破坏。活化的补体所致的细胞毒性仅延及位于已结合抗原的抗体附近的膜。因此，MAC介导的细胞毒性依赖于抗体特异性。ADCC和CDC可表达彼此独立的细胞毒性。但事实上，这些细胞毒性可在生物体中复合发挥作用。为了评价所述分子的CDC活性，可进行CDC试验，例如Gazzano-Santorod(1997)JImmunolMethods.;202:163-71中所描述的。中和活性能够使病原体丧失感染性和毒素丧失活性的抗体在本领域中是众所周知的。抗体介导的中和可以通过抗原可变区与抗原的结合来实现，或者，可能需要补体的介导。例如在某些情况下，抗病毒抗体需要补体介导从而使病毒丧失其感染性。Fc区对于补体的参与是必不可少的。因此，所述抗体具有需要Fc用于中和病毒和细胞的效应物作用。在这些效应物作用中本说明书优选的是ADCC和/或CDC。本发明基于某些抗-EphA4抗体与EphA4表达细胞结合，然后表达效应物作用这一发现。本发明还涉及损伤EphA4表达细胞的方法，所述方法包括以下步骤1)使EphA4表达细胞与抗-EphA4抗体接触，和2)利用与细胞结合的抗体的效应物作用损伤EphA4表达细胞。在本发明的方法或药物组合物中，任何EphA4表达细胞都可被损伤或杀死。例如，优选月夷腺癌症细胞(pancreaticcancercell)作为本发明的EphA4表达细月包。其中，优选胰腺癌(pancreaticcarcinomacell)细胞。细胞和抗体可在体内或体外接触。当靶向体内作为EphA4表达细胞的癌细胞时，本发明的方法实际上是癌症的治疗方法或预防方法。具体地，本发明提供癌症的治疗方法，其包括以下步骤1)向癌症患者施用结合EphA4的抗体，和2)利用与癌症细胞结合的抗体的效应物作用损伤癌症细胞。本发明人确认了结合EphA4的抗体藉效应物作用有效地损伤EphA4表达细胞，特别是胰腺癌症细胞。本发明人还确认了EphA4有很大可能性在胰腺癌细胞中高表达。此外，EphA4在正常组织中表达水平较低。合起来，该信息表明施用抗-EphA4的胰腺癌治疗方法可能有效，几乎没有副作用之虞。包括IgA、IgE或IgG的Fc区的抗体对于表达ADCC是必不可少的。同样地，IgM或IgG的抗体Fc区对于表达CDC是优选的。然而，本发明的抗体不受限制，只要所述抗体具有所需的效应物作用。通过例如对残基或序列进行各种取代，可以构建Fc部分的变体、类似物或衍生物。特别地，本发明考虑到了由Fc变体构成的抗体，这些Fc变体经过改造而具有优化的Fcy受体亲和性，^t人而增强由此产生的效应物作用变体(或类似物)多肽包括Fc氨基酸序列中加入一个或多个氨基酸残基的插入变体。插入可位于蛋白质的任一或两个末端，或者可位于Fc氨基酸序列的内部区域中。在任一或两个末端有额外氨基酸序列的插入变体可包括例如融合蛋白和含氨基酸标记或标签的蛋白质。例如，Fc分子可选地包含N-末端Met，特别是当分子在细菌细胞(例如大肠杆菌(五.co//))中重组表达时。在Fc缺失变体中，Fc多肽中一个或多个氨基酸残基被去除。缺失可能在Fc多肽的一个或两个末端发生，或者去除Fc氨基酸序列内的一个或多个残基。因此，缺失变体包括Fc多肽序列的所有片段。在Fc取代变体的情况中，Fc多肽的一个或多个氨基酸残基被去除，并代之以备选的残基。本领域技术人员将认识到，对一个氨基酸序列进行个别的添加、缺失、插入或取代，改变单个氨基酸或小部分的氨基酸，结果导致原始氨基酸侧链的性质得以保留。它们被称为"保守取代，，或"保守修饰"，其中蛋白质的改变产生有类似功能的蛋白质。保守取代表提供功能上类似的氨基酸，其在
技术领域：
中是众所周知的。氨基酸侧链特性的例子是疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T),以及具有下述功能团或共同特性的侧链月旨肪族侧链(G、A、V、L、I、P);含侧链的鞋基(S、T、Y);含侧链的硫原子(C、M);含侧链的羧酸和酰胺(D、N、E、Q);含侧链的石威基(R、K、H);以及含侧链的芳香族(H、F、Y、W)。此外，以下8组各自包含彼此保守取代的氨基酸1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、曱硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)、曱硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。在一个方面中，取代本质上是保守的。但本发明并不局限于此，还包括非保守的取代，只要多肽保留必要的抗体效应物作用。亲本多肽Fc区优选人Fc区，例如天然序列的人Fc区人IgGl(A和非A同种异型)或人IgG3Fc区。在一个实施方案中，ADCC提高的变体与带有天然序列的IgGl或IgG3Fc区和该变体的抗原结合区的抗体相比，介导ADCC实质上更有效。优选地，变体包括对Fc区的298、333和334位点的残基中两个或三个残基的取代，或基本上由它们组成。免疫球蛋白重链中残基的编号方式是如Kabatefa/.,(见上文)中所述的EU索引的编号方式，明确地以^是述方式将其并入本文。更优选地，取代298、333和334位点处的残基(例如用丙氨酸残基)。此外，为了产生ADCC活性提高的Fc区变体，人们通常会通过重组产生对FcyRIII(其被认为是介导ADCC的一个重要的FcR)的亲和力提高的Fc区变体。例如，可在氨基酸位点256、290、298、312、326、330、333、334、360、378或430中任何一个或多个位点处将氨基酸修饰(例如插入、缺失或取代)引入亲本Fc区，以产生这样的变体。对FcyRIII亲和力提高的变体还可能对FcYRII的亲和力降低，特别是对抑制性的FcYRIIb受体亲和力降^[氐。为了保留必要的抗体效应物作用，优选只对少量或小部分的氨基酸进行修饰(添加、缺失、插入或取代)。尽管如此，很多变体氨基酸插入、缺失和/或取代(例如，从l-50个氨基酸，优选从l-25个氨基酸，更优选从l-10个氨基酸)都被本发明所考虑到，并落入本发明的范围。或者，修饰的氨基酸百分比优选20%或更少，更优选15%或更少，更优选10%，甚至更优选1%-5%。通常优选保守的氨基酸取代，但本发明并不局限于此。此外，改变的形式可以是改变的氨基酸，例如模拟肽或D-氨基酸。或者，在本发明中，可通过修饰除氨基酸序列之外的生物化学性质，例如添加至Fc区的糖链，来增强ADCC活性。例如据报道，IgG无岩藻糖残基可增强ADCC活性(Shinkawa"a/.,(2003)J.Biol.Chem.:278(5):3466-73.)。因此，在本发明的上下文中，优选缺乏Fc区岩藻糖残基的抗体。更具体地说，为了增强ADCC活性，可去除附接于Fc区的CH2域的岩藻糖残基。可使用除CHO以外的细胞作为宿主细胞，来表达无Fc区岩藻糖残基的抗体。这里，岩藻糖残基被CHO中高表达的a,l-6-岩藻糖基转移酶CFUT8)添加至抗体。因此，本发明中优选属于这些种类的人源抗体。利用从人或移植人抗体基因的嵌合动物收集的产生抗体的细胞，可获得人抗体(IshidaI，etal.，(2002)CloningandStemCells.,4:91-102.)。此外，抗体Fc区可与任意可变区联结。具体地，不同动物物种的可变区与人恒定区结合的嵌合抗体是本领域公知的。或者，通过将源于人的可变区与任意恒定区结合也可获得人-人嵌合抗体。另外，CDR移植技术也是众所周知的，其中将对应于人抗体可变区的互补决定区(CDRs)用异源4元体的CDR耳又4戈("Immunoglobulingenes",AcademicPress(London),pp260-274,1989;RoguskaMA,"a/.,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,91:969-73.)。通过替换CDR而替换了抗体结合特异性。即，转入了人EphA4结合抗体的CDR的人源化抗体会识别人EphA4。这些经转移的抗体也可称为人源化抗体。这样获得的并带有效应物作用所必需的Fc区的抗体均可用作本发明的抗体，不管其可变区的来源如何。例如，本发明中优选包括人IgGFc的抗体，即使它们的可变区包括源自另一种类或其它物种的免疫球蛋白的氨基S交序列。本发明的抗体VH和VL域各包括3个被框架区所分隔的CDRs,称为CDR1、CDR2和CDR3。对CDRs的氨基酸序列不做特别限定，只要抗体可特异地与EphA4结合即可。优选的CDR氨基酸序列的实例包括但不限于人VHCDR1:ELS固(SEQIDNO:10),人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11)，人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12)，人VLCDR1:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3:AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAAWN(SEQIDNO:20)，人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22),人VLCDR1:SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2:DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3:GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26).在一个更优选的实施方案中，VH对应于SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，VL对应于SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。如上所述，本发明的抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。即使施用于人时，人多克隆抗体也可利用上述用人抗体基因转移的动物获得。可选地，还可应用利用基因工程技术构建的免疫球蛋白，例如人源化抗体、人-非人嵌合抗体和人-人嵌合抗体。此外，通过克隆人产生抗体的细胞获得人单克隆抗体的方法也是众所周知的。EphA4或包括其部分肽的片段可用作免疫原，以获得本发明的抗体。本发明的EphA4可源自任何物种，优选源自哺乳动物，如人、小鼠、大鼠或兔，更优选源自人。人EphA4核苷酸序列和氨基酸序列在本领域中是众所周知的。为此，在SEQIDNO:1中描述EphA4的cDNA核苦酸序列(GenBankAccessionNo.NM—004438),在SEQIDNO:2中描述由所述核苷酸序列编码的氨基酸序列(GenBankAccessionNo.NP—004429)。本领域技术人员可按常规分离包含规定的核苷酸序列的基因，制备所需序列的片段，获得相应于靶氨基酸序列的蛋白质。举例来说，可将编码EphA4蛋白或其片段的基因插入已知的表达载体中，用来转化宿主细胞。可通过任意和标准方法>夂人宿主细胞内或细胞外回收所需蛋白质或其片段，还可将其用作抗原。此外，蛋白质、其裂解物以及化学合成的蛋白质也可用作抗原。而且，表达EphA4蛋白或其片段的细胞本身也可用作免疫原。当使用肽片段作为EphA4免疫原时，特别优选包括据预测为胞外域的区域的氨基酸序列。推测EphA4的N-末端存在信号肽，从位点1延伸至位点19。因此，优选以例如除N-末端信号肽(即开始的19个氨基酸残基)以外的区域作为免疫原来获得本发明的抗体。换句话说，优选与EphA4胞外域结合的抗体作为本发明的抗体。因此，本发明中优选的抗体是带有效应物作用所必需的Fc和能够与细胞外EphA4区结合的可变区的抗体。当目的是施用于人时，优选带有IgGFc。可用所述抗原免疫任意哺乳动物。但优先考虑与用于细胞融合的亲本细胞的相容性。通常优选啮齿类(rodents)，兔形目(lagomorphs)或灵长类(primates)动物。啮齿目包括例如小鼠、大鼠和仓鼠。兔形目包括例如家兔。灵长类包括例如狭鼻猿(东半球猴)如食蟹猴(Macacafascicularis)、恒河猴(Macacamulatta)、狒狒(sacredbaboons)和黑猩猩(chimpanzees)。用抗原免疫动物的方法是本领域中已知的。腹腔注射或皮下注射抗原是免疫动物的标准方法。具体地，可以在适量的磷酸盐緩冲盐水(PBS)、生理盐水等中稀释和悬浮抗原。如果需要，可将抗原悬液与适量的标准佐剂如弗氏(Freund，s)完全佐剂混合，乳化后施用于哺乳动物。其后优选每4至21天多剂量施用与适量弗氏不完全佐剂混合的抗原。还可以使用合适的载体进行免疫。如上述进行免疫后，可以用标准方法检验血清中所需抗体的水平的增加。可以从已检查了血清中所需抗体的增加的经免疫哺乳动物制备针对EphA4蛋白的多克隆抗体。为此可以义人这些动物收集血液，或通过使用任意常规的方法从它们的血液中分离血清。在本发明的上下文中，多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及含有从所述血清中分离的多克隆抗体的级分。IgG和IgM可从识別EphA4蛋白的级分中制备，例如使用与EphA4蛋白偶联的亲和柱，并进一步用蛋白A或蛋白G柱纯化该级分。在本发明中，抗血清可用作多克隆抗体。可选地，还可应用纯化的IgG、IgM等。为了制备单克隆抗体，可从用抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞，检查血清中所需抗体水平的升高(如上所述)，并用于细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选来自脾。其它优选的用于与上述免疫原融合的亲本细胞包括但不限于哺乳动物骨髓瘤细胞，更优选获得了便于用药物选择融合细胞的性质的骨髓瘤细胞。根据已知的方法，如Milstein等(Galfre,G.andMilstein,C.,(1981)Methods.Enzymol.:73,3-46.)的方法，可将上述免疫细胞和骨髓瘤细胞进行融合。对于细胞融合产生的杂交瘤，可通过在标准选择培养基如HAT培养基(由次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷组成的培养基)中进行培养而加以选择。细胞培养通常在HAT培养基中连续进行数天至数周，这段时间足以杀死除了所需的杂交瘤细胞之外的所有细胞(非融合的细胞)。然后，可以进行标准的有限稀释，筛选并克隆生产所需抗体的杂交瘤细胞。上述方法中可用抗原免疫非人动物以制备杂交瘤。此外，可以在体外用蛋白、表达蛋白的细胞或它们的悬液免疫来自于EB病毒等感染细胞的人淋巴细胞。然后，可使免疫后的淋巴细胞与能够无限分裂的源自人的骨髓瘤细胞(U266等)融合，从而获得产生所需的能与所述蛋白结合的人抗体的杂交瘤细胞(特公昭63-17688)。(未审查的曰本公开专利申请(JP-A)Sho63-17688)然后可将获得的杂交瘤细胞移植入小鼠腹腔，并抽取腹水。获得的单克隆抗体可以应用例如好u酸铵沉淀、蛋白A或蛋白G柱、DEAE离子交换层析或偶联了本发明的蛋白的亲和柱进行纯化。本发明的抗体不仅可以用于纯化和检测本发明的蛋白，还可以作为本发明的蛋白的激动剂和拮抗剂的候选物。这些抗体还可以用于与本发明的蛋白相关的疾病的抗体治疗。当将获得的抗体施用于人体时(抗体治疗)，优选使用人抗体或人源化抗体，因为它们的免疫原性低。例如，可以用选自蛋白、表达蛋白的细胞或它们的悬液的抗原免疫具有人抗体基因库的转基因动物。然后，可从该动物收集产生抗体的细胞，将其与骨髓瘤细胞融合以获得杂交瘤，从这些杂交瘤可制备抗-蛋白的人抗体(参见国际公布号92-03918，94-02602,94-25585,96-33735和96-34096)。或者，可以通过癌基因使产生抗体的免疫细胞，如经免疫的淋巴细胞无限增殖化(immortalize),并用于制备单克隆抗体。以这种方式获得的单克隆抗体也可以利用基因工程方法制备(例如参见Borrebaeck，C.A.K.andLarrick，J.W"(1990)TherapeuticMonoclonalAntibodies,MacMillanPublishers,UK)。例如，可以从免疫细胞(如产生抗体的杂交瘤或经免疫的淋巴细胞)克隆编码抗体的DNA;然后将这些DNA插入合适的载体；并转入宿主细胞，从而制备重组抗体。本发明还考虑到了如上所述制备的重组抗体。抗体可以通过与各种分子，如聚乙二醇(PEG),结合进行修饰。以这种方式修饰的抗体也可用于本发明。可通过将抗体进行化学修饰来获得修饰抗体。这些修饰方法对本领域技术人员来说是常规的。还可以用其它蛋白质修饰抗体。用蛋白质分子修饰的抗体可以利用基因工程产生。即，可以通过将抗体基因与编码修饰蛋白的基因融合来表达耙蛋白。例如，抗体效应物作用可以在与细胞因子或趋化因子结合时得到增强。事实上，与IL-2、GM-CSF等融合的蛋白，其抗体效应物作用的增强已得到证实(PenichetML,a"/.，(2001)HumanAntibodies,10:43-9.)。增强效应物作用的细胞因子或趋化因子包括IL-2、IL-12、GM-CSF、TNF、嗜酸性粒细胞趋化物质(eosinophilchemotacticsubstance)(RANTES)等。的恒定区的嵌合抗体，或者作为含有源自非人抗体的互补决定区(CDR)、源知方法产生。—可以利用分子生物学的标准技术来制备编码嵌合产物和CDR-移植产物的DNA序列。例如可以利用聚合酶链式反应(PCR)从产生抗体的细胞的RNA合成可变区，来制备编码感兴趣的抗体的CDR的基因(参见例如Larricketal.，"Methods:aCompaniontoMethodsinEnzymology",vol.2:page106(1991);Courtenay扁Luck,"GeneticManipulationofMonoclonalAntibodies"inMonoclonalAntibodies:Production,EngineeringandClinicalApplication;Ritteretal.(eds.)，page166(CambridgeUniversityPress,1995)，和Wardetal.，"GeneticManipulationandExpressionofAntibodies"inMonoclonalAntibodies:PrinciplesandApplications;Birchetal.(eds.)，page137(Wiley-Liss，Inc.,1995))。可以利用寡核香酸合成技术完全或部分合成编码嵌合产物和CDR-移植产物的DNA序列。可视情况应用定点诱变和聚合酶链式反应技术。例如，可以应用如Jones等(1986)Nature.;321:522-5所描述的寡核普酸定向合成。还可以应用如Verhoeyen等(1988)Science.;239:1534-6或Riechmannetal.,(同上文)所描述的事先存在的可变区的寡核苷酸定向突变。还可以应用如Queen等(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:10029画33;PCT公布WO90/07861所描述的利用T4DNA聚合酶填补有缺口的寡核苷酸。可以用任意合适的宿主细胞/载体系统来表达编码CDR移植重链和轻链的DNA序列。可以应用细菌(例如大肠杆菌)和其它微生物系统，特别是用于表达抗体片段如Fab和(Fab，》片段，尤其是Fv片段和单链抗体片段如单链Fv。可以应用真核(例如哺乳动物)宿主细胞表达系统，特别用于产生大的CDR移植抗体产物，包括完整的抗体分子。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞和骨髓瘤或杂交瘤细胞系。可以将如上获得的抗体纯化至均质。例如，可根据用于纯化和分离蛋白质的一般方法纯化或分离抗体。例如，可以利用适当选择的柱层析组合，包括但不限于亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电〉永、等电聚焦，来分离^t体(Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowandDavid,Lane(edit.),ColdSpringHarborLaboratory,1988)。蛋白A柱和蛋白G柱可以用作亲和柱。例示性的使用的蛋白A柱包括HyperD、POROS和SepharoseFF(Pharmacia)。例示性的层析(除亲和层析外)包括离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤、反相层析和吸附层析("StrategiesforProteinPurificationandCharacterization:ALaboratoryCourseManual"DanielR.Marshaka/"(1996)ColdSpringHarborLaboratoryPress.)。可以按照液相层析(如HPLC或FPLC)程序进行层析。举例来说，可以采用吸光度测定、酶联免疫吸附试验(ELISA)、酶免疫原结合活性。在ELISA中，通常将本发明的抗体固定在平板上，将本发明的蛋白质施加到平板上，再施加含有所需抗体的样品(如产生抗体的细胞的培养上清液或纯化的抗体)。然后施加带有酶(如碱性磷酸酶)标签的识别第一抗体的第二抗体，并温育平板。洗涤后，在平板中加入酶底物如磷酸对硝基苯酯，测定吸光度，评价样品的抗原结合活性。可按照与蛋白质相同的方式使用蛋白质片段(C-末端或N-末端片段等)。可以使用BIAcore(Pharmacia)评价本发明抗体的结合活性。此外，按照实施例中概述的方法，也可以评价抗体效应物作用。例如，可以在意名欠评价其效应物作用的抗体存在的条件下，将靶EphA4表达细胞与效应细胞温育。如果;f全测到耙细胞的^C坏，可以确认所述抗体具有诱导ADCC的效应物作用。可以将在无抗体或无效应细胞的条件下观察到的把细胞石皮坏的水平作为对照与效应物作用水平比4交。明显地表达EphA4的细胞可以用作靶细胞。具体地，可以应用许多种在实施例中证实表达EphA4的细胞系。所述细胞系可以从细胞库获得。此外，可选摔具有更强效应物作用的单克隆抗体。在本发明中，抗-EphA4抗体可作为药物施用于人或其它动物。本发明中可以施用抗体的除人之外的动物包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猫、犬、羊、猪、牛、猴、狒狒和黑猩猩。抗体可直接施用于受试者，另外可以利用已知的药物制备方法配制成剂型。例如，根据需要，可将药物以可注射形式，如与水或者任何其它药物可接受的液体所成的无菌溶液或混悬液，进行非胃肠道施用。例如，可将这种化合物与可接受的载体或溶剂混合制成一般接受的用作药物所需的单位剂型，所述载体或溶剂如无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂、溶剂、防腐剂、黏合剂等。包括生理盐水、葡萄糖和佐剂(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇和氯化钠)等的其它等张溶液可用作注射用水溶液。还可将它们与适当的增溶剂一起使用，所述增溶剂例如醇，特别是乙醇和多元醇(例如丙二醇和聚乙二醇)，和非离子型表面活性剂(例如聚山梨酯80tm或HCO-50)。麻油或大豆油可用作油质液体，可包括苯曱酸千酯或苯曱醇作为增溶剂。配方中可包括緩冲溶液(磷酸盐緩冲液、醋酸钠缓冲液等)、镇痛药(盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(苯甲醇、苯酚等)和抗氧化剂。制备的注射剂可以装入到合适的安瓿中。在本发明中，可以给患者施用抗-EphA4抗体，例如动脉内、静脉内、经皮、鼻内、经支气管、局部或肌内施用。通过滴注或注射血管内(静脉内)给药是给胰腺癌症患者全身施用抗体的一般方法的一个例子。使抗体管镜检查)进行的局部注射和在CT引导下或用胸腔镜检查进行的局部注射。使抗体试剂局部集中于肝中原发性病灶或转移灶的方法包括利用肝门静脉注射或动脉输注进行的局部注射。此外，将动脉内导管插入供给癌症细胞营养的静脉附近从而局部注射抗肿瘤剂如抗体试剂，这种方法作为局部控制疗法对于胰腺癌的原发性病灶和转移灶有效。虽然剂量和施用方法根据患者的体重、年龄和施用方法而变化，但是本领域技术人员能够常规确定这些参数。另外，可将编码抗体的DNA插入用于基因治疗的载体中，并施用该载体以进行治疗。剂量和施用方法根据患者的体重、年龄和状况而变化；不过本领域技术人员能够适当选择它们。细胞毒性得到证实的量施用于活体。例如，虽然根据症状有一定程度的差别，但抗-EphA4抗体通常剂量范围为0.1mg/kg-250mg/kg每天。通常，用于成年人(体重60kg)的剂量为5mg-17.5g每天，优选为5mg-10g每天，更优选为100mg-3g每天。服药日程为以2-10天的间隔给药1-10次，并在例如给药3-6次后观察进展。虽然本发明的抗体保留效应物作用，但是在某些实施方案中，可使用公知的技术将细胞毒剂与抗体结合。细胞毒剂数量多且种类多，包括但不限于细胞毒类药物、毒素或所述毒素的活性片段。合适的毒素及其相应片段包括但不限于白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)、auristatin等。细胞毒剂还包括放射化学试剂，所述放射化学试剂是通过将放射性同位素与本发明的抗体缀合或将放射性核素与共价附接于抗体的螯合剂结合而制得的。制备所述缀合物的方法是本领域公知的。或者，可以施用编码抗体或其功能衍生物的核酸序列，通过基因治疗的方式来治疗或预防与EphA4表达细胞有关的疾病，例如胰腺癌。基因治疗指通过给受试者施用被表达的(expressed)或可表达的(expressible)核酸而进行的治疗。在本发明的这个实施方案中，核酸产生其编码的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段进而介导预防或治疗效果。性的方法描述如下。关于基因治疗方法的综述，参见Goldspide^/.,(1993)Clin.Pharm.;12:488-505;WuandWu，(1991)Biotherapy.;3:87画95;Tolstoshev,(1993)AnnRevPharmacolToxicol.;32:573-96;Mulligan,(1993)Science.;260:926-32;MorganandAnderson,(1993)AnnRevBiochem.;62:191國217;ClareRobinsonTrendsBiotechnol.;ll(5):155-215。重组DNA
技术领域：
中普遍7>知的可应用的方法描述于Ausubela/,(eds.),CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NY(1993》Kriegler，GeneTransferandExpression,ALaboratoryManual,StocktonPress,NY(1990)。在一个优选的方面中，本发明的组合物包括编码抗体的核酸，所述核酸是表达载体的组成部分，所述表达载体在合适的宿主中表达所述抗体或者其片段或嵌合蛋白质或者重链或轻链。特别是，这样的核酸具有与抗体编码区可操作地连接的启动子，优选异源启动子，所述启动子是诱导型或组成型，以及，可选地，是组织特异型的。在另一特定的实施方案中，应用这样的核酸分子，其中在抗体编码序列和任何其它期望的序列两侧有促进在基因组中的期望位点发生同源重组的区域，从而使编码抗体的核酸能够在染色体内表达(KollerandSmithies,(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:8932-5;Zijlstraetal.，(1989)Nature.;342:435-8)。在具体的实施方案中，所表达的抗体分子是单链抗体；或者，核酸序列可以包括编码抗体的重链和轻链二者或它们的片段的序列。核酸分子投递至受试者的方式可以是直接的，或者是间接的，直接的情况下，受试者直接暴露于核酸或携带核酸的载体，间接的情况下，首先用核酸在体外转化细胞，然后将细胞移植进入受试者。所述两种方法分别被称为体内基因治疗或回体基因治疗。在一个实施方案中，核酸序列可在体内直接施用，其在体内表达产生编码产物。这可以通过本领域已知的众多方法中任何一种来实现，例如，通过将核酸序列构建为适当的核酸表达载体的组成部分，并施用该载体从而使它们进入细胞内，例如通过使用缺陷型或减毒的反转录病毒或其它病毒载体感染(参见U.S.Pat.No.4,980,286),或者通过直接注射棵露DNA,或者使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic,Dupont)，或者通过用脂质或细胞表面受体或转染试剂包覆，封装在脂质体、微粒或微粒体中，或者通过与已知进入核的肽相连结来施用，或者通过与易受到受体介导的内吞作用的配体(可用于靶向特异表达该受体的细胞类型)相连结来施用(参见例如WuandWu，(1987)JBiolChem.;262:4429-32)等。在另一个实施方案中，可以形成核酸-配体复合物，其中配体包括融合病毒肽用以破坏内体，使得核酸免受溶酶体降解。在另一实施方案中，可通过靶向特异受体使核酸在体内定向，以实现细胞特异性摄取和表达(参见例如PCT公布WO92/06180,WO92/22635，WO92/20316,W093/14188或WO93/20221)。或者，可将核酸引入细胞内，并通过同源重组掺入到宿主细胞DNA中表达(KollerandSmithies,(1989)ProcNatlAcadSciUSA.;86:8932画5;Zijlstraetal"(1989)Nature.;342:435-8)。在一个实施方案中，应用含有编码本发明的抗体或其片段的核酸序列的病毒载体。例如，可应用反转录病毒载体(参见Milleretal.,(1993)MethodsEnzymol.;217:581-99)。所述反转录病毒载体包含使病毒基因组正确包装和整合到宿主细胞DNA中所必需的组分。将编码意欲用于基因治疗的抗体的核酸序列克隆至一个或多个载体，这有利于将基因投递至受试者。关于反转录病毒载体的详情可在Boesenetal.,(1994)Biotherapy.;6:291-302找到，其描述应用反转录病毒载体将mdr1基因投递至造血干细胞，从而使这些干细胞对化疗更有抵抗力。其它说明反转录病毒载体在基因治疗中应用的参考资料有Clowesetal.,(1994)JClinInvest.;93:644-51;Kiemetal"(1994)Blood.;83:1467-73;SalmonsandGunzberg,(1993)HumGeneTher.;4:129-41;GrossmanandWilson,(1993)CurrOpinGenetDev.;3:l10-4。可用于基因治疗的另一病毒载体例子是腺病毒。腺病毒对于将基因投递至呼吸道上皮而言是特别引人注目的载体。腺病毒自然感染呼吸道上皮，在呼吸道上皮引起轻度疾病。用于基于腺病毒的递药系统的其它靶标有肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能感染不分裂细胞的优点。Kozarsky和Wilson,(1993)CurrOpinGenetDev.;3:499-5034是出一篇关于基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等(1994)HumGeneTher.;5:3-10演示了应用腺病毒载体将基因转移至恒河猴的呼吸道上皮。其它在基因治疗中应用腺病毒的实例可在Rosenfeldetal.,(1991)Science.;252:431-4;Rosenfeldetal.,(1992)Cell.;68:143-55;Mastrangelietal,,(1993)JClinInvest.;91:225-34;PCT公布W094/12649;Wangetal,,(1995)GeneTher.;2:775-83中找到。在一个优选的实施方案中应用腺病毒载体。也有人提出将腺伴随病毒(AAV)用于基因治疗(Walshetal.，(1993)ProcSocExpBiolMed.;204:289-300;美国专利No.5,436,146)。另一种基因治疗的方法涉及将基因转移至组织培养中的细胞，通过如电穿孔、脂质转染、磷酸4丐介导的转染或病毒感染等方法。通常，转移方法包括将可选标记转移至细胞。然后使细胞置于选择下，以分离出已摄取了转移基因并正在表达它的细胞。然后可将所述细胞投递至受试者。在本实施方案中，将核酸引入细胞，然后在体内施用产生的重组细胞。所述引入可以通过本领域公知的任何方法进行，包括但不限于转染、电穿孔、显微注射、用含核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转化、微细胞介导(microcdlmediated)的基因转移、原生质球仿J^口LoefflerandBehr,(1993)MethodsEnzymol.;217:599-618;Cotton"o/.，1993,MethodsEnzymol.;217:618-44;ClineMJ.PharmacolTher.1985;29(l):69-92.)，并且可以根据本发明加以应用，只要不破坏受体细胞必需的发育和生理功能。所述技术应可使核酸稳定转移至细胞，以便核酸能够被所述细胞表达，优选能够被其细胞后代遗传和表达。可以通过本领域公知的各种方法将产生的重组细胞投递至受试者。重组血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选由静脉内施用。预计应用的细胞量依赖于期待的效果、患者状态等，可由本领域技术人员确定。为基因治疗目的而引入核酸的细胞包括任何期望的、可用的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨嗟细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，特别是造血干细胞或祖细胞，例如从骨髓、脐带血、外周血、胎肝等获得的。在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是受试者自体的。在重组细胞用于基因治疗的一种实施方案中，可将编码抗体或其片段的核S吏序列引入细胞，以便它们可由所述细胞或它们的后代表达，然后将重组细胞在体内施用以取得疗效。在特定的实施方案中，应用干细胞或祖细胞。任何可在体外分离和保持的千细胞和/或祖细胞都有可能根据本发明的该实施方案应用(参见例如PCT公布WO94/08598;StempleandAnderson,(1992)Cell.;71:973-85;Rheinwald，(1980)MethodsCellBiol.;21A:229-54;PittelkowandScott，(1986)MayoClinProc.;61:771-7)。在一个优选的实施方案中，为基因治疗目的而意欲引入的核酸包括与编码区可操作地连接的诱导型启动子，以便可以通过控制适当转录诱导物的有无来控制核酸的表达。此外，本发明提供用于诱导抗体的免疫原性组合物，所述抗体具有针对EphA4表达细胞的效应物作用，其中组合物包含作为活性成分的EphA4或免疫学活性EphA4片段，或者可表达EphA4或免疫学活性EphA4片段的DNA或细胞。或者，本发明涉及EphA4或免疫学活性EphA4片段，或者效应物作用的抗体。施用抗-EphA4抗体通过所述抗体的效应物作用损伤癌细胞。因此，如果可在体内诱导EphA4抗体，则可取得相当于施用抗体的疗效。当施用由抗原组成的免疫原性组合物时，可在体内诱导靶抗体。因此本发明的免疫的免疫原性组合物作为，例如，用于胰入腺癌症治疗的疫苗组合物是有效的。活性成分。在本发明的上下文中，免疫学活性EphA4片段指能诱导抗-EphA4抗体的片段，所述抗-EphA4抗体识别EphA4并具有效应物作用。以下，将EphA4和免疫学活性EphA4片段描述为免疫原性蛋白。给定的片段是否诱导耙抗体，可以通过实际免疫动物，并确认被诱导的抗体的活性来确定。例如，可以利用实施例中所述的方法进行抗体诱导和其活性的确认。本发明的免疫原性复合物除包含免疫原性蛋白活性成分外，可包含药物可接受的载体。必要时，还可将组合物与佐剂组合。灭活的结核菌、白喉类毒素、皂苷等可用作佐剂。或者，可以使用编码免疫原性蛋白的DNA或保持可表达状态的所述DNA的细胞作为免疫原性复合物。利用表达靶抗原的DNA作为免疫原(即所谓的DNA疫苗)的方法是众所周知的。可以通过将编码EphA4或其片段的DNA插入适当的表达载体而获得DNA疫苗。反转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、仙台病毒载体等是合适载体的实例。此外，可以将如下所述的DNA作为棵露DNA直接引入细胞，然后表达在该DNA中，编码免疫原性蛋白的DNA功能性地连接于启动子的下游。可以将棵露DNA包裹在核糖体或病毒#:膜载体中引入细胞。本发明的EphA4多肽和多核苷酸还可以用于在体内诱导免疫反应，包括抗体和特异性针对EphA4表达细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的产生。在所述方法中，期望的肽对CTL的诱导可以通过在体内或者回体由抗原呈递细胞(APC)将所述肽呈递到T细胞来实现。举例来说，可收集患者的血细胞，如外周血单个核细胞(PBMC),利用可表达免疫原性蛋白的载体将它们转化，并返回至患者。然后，经转化的血细胞在患者体内产生免疫原性蛋白，并诱导靶抗体。或者，可以收集患者的PBMC，使其以回体方式与多肽接触，诱导APC或CTL之后，可将所述细胞施用于受试者。施用体外^"导的APC或CTL之前可将它们克隆。通过克隆和培养具有较高靶细胞损伤活性的细胞，可更有效地进行细胞免疫疗法。此外，用这种方式分离的APC和CTL不仅可用于针对细胞所来源的个体的细胞免疫疗法，还可用于针对来自于其它个体的相似类型的肿瘤的细胞免疫疗法。通常，当多肽用于细胞免疫疗法时，已知通过组合多数具有不同结构的多肽并使它们与APC(特别是树突状细胞)接触可增强CTL诱导的效率。因此，用蛋白质片段刺激APC时，使用多种类型的片段的混合物是有利的。可通过观察针对肿瘤的抗体产生的诱导来确认由多肽诱导的抗肿瘤免疫。例如，当以多肽免疫的实验动物中诱导了针对该多肽的抗体时，以及肿瘤细胞的生长受所述抗体抑制时，认为多肽有能力诱导抗肿瘤免疫。当用编码免疫原性蛋白的DNA或用该DNA转化的细胞作为本发明的免疫原性复合物时，可将它们与免疫原性蛋白和增强其免疫原性的载体蛋白组合。如上所述，本发明提供诱导抗体的方法，所述抗体具有针对EphA4表达细胞的效应物作用，其中所述方法包括施用EphA4、免疫学活性EphA4本发明的方法诱导具有损伤EphA4表达细胞(如胰腺癌症)的效应物作用的抗体。结果可以获得对胰腺癌等的疗效。每天，可以口服或非胃肠道施用0.1-250mg/kg的本发明的免疫原性组合物。非胃肠道施用包括皮下注射和静脉注射。施用于单个成年人的剂量通常为5mg-17.5g每天，优选5mg-10g每天，更优选100mg-3g每天。本发明还提供用于治疗或预防受试者中癌症的方法。在某些实施方案中，所述方法包括如下步骤施用药学有效量的抗-EphA4抗体或其免疫学活性片段，其中所述抗体具有抗体效应物作用。本说明书提及的所有现有技术的参考资料皆以提述方式全文并入本说明书。图1的照片显示了胰腺癌症细胞系中EphA4基因半定量RT-PCR分析的结果。图2显示了ADCC试验的结果，所述ADCC试验利用针对EphA4过表达和低表达的胰腺癌症细胞系(MIAPaca-2和PK-45P)的赫赛汀和抗-EphA4人抗体65和336。实施本发明的最佳方式以下参考本发明的实施例详细地描述本发明。但是，本文所述的材料、方法等仅说明本发明的各个方面，决非意欲限制本发明的范围。同样地，在实施或^H全本发明时可使用与本文所述类似或等同的材料、方法等。细胞系人结肠癌或胰腺癌细胞系在含10%胎牛血清的适当培养基中单层增殖。实验所用的细胞系如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>*1东北大学发育、衰老和癌症研究所(InstituteofDevelopment,AgingandCancer,TohokuUniversity)*2Eagle氏基本必需培养基*3McCoy氏5A培养基(改良过)此外，以下细胞系在应用抗-EphA4抗体的ADCC试验中使用胰腺癌MIAPaca-2。人抗体应用培养细胞筛选噬菌体表达文库对于针对EphA4的人scFV抗体的筛选，使用编码人scFV抗体(WO01/62907)的嗟菌体文库AIMS4。筛选方法在P2005-185281A中描述。对于第一次錄选，首先，将高表达EphA4的MIAPaca-2细胞培养于15cm平皿中，用含2mg/ml胶原酶I(GibcoBRL)的细胞解离液(GibcoBRL)收集细胞，用冷PBS洗涤细胞。将人抗体噬菌体文库溶液(2x1013cfii)与4xl07个所述细胞、BSA和NaN3/MEM混合。然后调节终浓度至1.6ml总体积中1%BSA-0.1%NaN3/MEM，4。C轻轻振荡混合物4小时。之后，将一半反应液分到两个管中，在有机溶剂(邻苯二曱酸二丁酯环己烷=9:1)层之上3000卬m离心2分钟。弃上清后，将细胞重悬于0.7ml1%BSA/MEM中，在相同体积的弱极性有机溶剂层之上离心。此步骤重复两次。弃上清，细胞重悬于0.3mlPBS中，液氮冷冻，37。C溶解。用这些噬菌体感染20ml大肠杆菌DH12S(OD0.5)1小时，将受感染细胞转移到600ml2xYTGA培养基(2xYT、200(ig/ml硫酸氨千青霉素、1。/。葡萄糖)中，30°C过夜培养。将其中的10ml加到200ml2xYTA培养基(2xYT、200昭/ml硫酸氨千青霉素)中，37°C培养1.5小时。附加培养后，加入lxl0"个辅助噬菌体KO7，37。C再培养l小时。按上述方法培养1小时后，加入800ml2xYTGAK(2xYT、200吗/ml硫酸氨千青霉素、0.05%葡萄糖、50(ig/ml卡那霉素)，30。C过夜培养。将该培养物8000rpm离心10分钟。上清与200mlPEG液体(20%聚乙二醇6000、2.5MNaCl)混合，8000rpm离心IO分钟沉淀噬菌体。将该沉淀混悬于10mlPBS中，将部分悬液用于检验被噬菌体感染的大肠杆菌数量。对于第二次筛选，使用0.8ml反应液(l%BSA-0.1%NaN3/MEM)、培养细胞(2xl(^个)和第一次筛选的噬菌体(lxl(T个)。反应液的总体积是第一次筛选所用的一半。第三次筛选过程与第二次筛选类似，除了用EPHA4转染2xl07个293T细胞以及利用lxl(f个第二次筛选的噬菌体之外。DNA序列测定、表达检测和抗体克隆的细胞ELISA如上文所述的经筛选和稀释的大肠杆菌随后在含100pg/ml氨千青霉素的营养琼脂上培养。分离所得的菌落，用2xYTGA培养基3(TC温育过夜。利用PI-50(Kurabo)从培养物中得到DNA，以双脱氧法测定了DNA序列。此外，用1.2ml2xYTAI(2xYT、200吗/ml硫酸氨千青霉素、0.5mMIPTG)于30。C培养0.05ml培养物，15000rpm离心5分钟收集上清。检测到抗体表达为cp3融合蛋白。更具体地说，上清与Maxisorp(NUNC)于37。C反应2小时，吸出反应液。用5%BSA于37。C将带有抗体的平板封闭2小时，弃封闭溶液。用含0.05%Tween的PBS将兔抗-cp3抗体(MBL)1:2000稀释后，加到平板中，室温反应1小时之后，用PBS洗涤。用含0.05%Tween的PBS将标记HRP(辣根过氧化物酶)的山羊抗兔IgG抗体(MBL)l:2000稀释后，加到平板中，室温反应l小时之后，用PBS洗涤。向平板中加入100filOPD溶液，室温反应15分钟，加入2M硫酸铵光度从而检测了融合蛋白。细月包ELISA操作如下。首先，在96孔板中过夜培养lxl()S个细胞，将培养基替换为200|_il的5。/。脱脂乳/PBS。在冰上静置3小时后，将100pl上清和100|_1110%脱脂乳混合，置水上过夜。将细胞用水上保存的PBS洗涤5次后，与100(il5吗/ml小鼠抗-cp3单克隆抗体、5%脱脂乳/PBS于4'C反应2小时。用冰上保存的PBS洗涤5次后，将由25pi过氧化物酶标记的ENVISION+聚合物试剂和75(_d15。/。脱脂乳/PBS组成的溶液与细胞于4。C反应2小时。用冰上保存的PBS洗涤5次后，加入2M硫酸铵以终止反应，用SPECTRAmax340PC(MolecularDevices)测定反应混合物在492nm处的吸光度。流式细胞术证实为与抗原阳性反应的人scFV抗体在IFA中转化为完整的IgG形式。这两个克隆具有如下的氨基酸序列。65:SEQIDNO:9(VH)和SEQIDNO:14(VL)336:SEQIDNO:19(VH)和SEQIDNO:23(VL)这些人scFV抗体在IFA中转化为完整的IgG形式。以下氨基酸序列用作重链恒定区(CH)和轻链恒定区(CL)。CH(CHl、CH2和CH3):ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAPHNHYTQKSLSLSPGK(SEQIDNO:13)CL:TECS(SEQIDNO:18)EphA4的半定量RT-PCR:用Rneasy⑧试剂盒(QIAGEN)从细胞系中提取总RNA。另外，用Oligo(dT)-纤维素柱(AmershamBiosciences)从总RNA中纯化mRNA，应用SuperscriptFirst-StrandSynthesisSystem(Invitrogen)通过反專争录(RT)合成第一链cDNA。制备每条第一链cDNA的适当稀释物用于之后的PCR扩增，监测GAPDH和P-肌动蛋白，作为定量对照。所用的引物序列如下5，-GAAGGCGTGGTCACTAAATGTAA-3，(SEQ.ID,N0.3)和5，-TTTAATTTCAGAGGGCGAAGAC-3，(SEQ.ID.N0.4)用于EphA4，5，-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3，(SEQ.ID.NO.5)和5，-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3，(SEQ.ID.N0.6)用于GAPDH，5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3，(SEQ.ID.NO.7)和5，-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3，(SEQ.ID.NO.8)用于j3-肌动蛋白。所有PCR反应均包括94。C初始变性2分钟，并由94。C30s，58°C30s和72。C1min组成，在GeneAmpPCR系统9700(PEAppliedBiosystems)上进行，对GAPDH进行21个循环，对于(3-肌动蛋白进行20个循环，或者对于EphA4进行28-32个循环。在胰腺癌细胞系Miapaca-2中发现EphA4过表达(图1)。另外，确认了EphA4的表达，以阐明抗-EphA4人抗体对各种癌症的功效。流式细胞术分析将癌细胞(5x10勺与纯化的多克隆抗体(pAb)、单克隆抗体(mAb)、兔IgG(pAb的对照)或小鼠IgG(mAb的对照)4。C温育30分钟。用磷酸盐緩冲溶液(PBS)洗涤细胞，然后将细胞在FITC-标记的AlexaFluor488中4°C温育30分钟。将细胞再次用PBS洗涤后，用流式细胞仪(FACSCalibur②，BectonDickinson)分析，然后用BDCellQuestTMPro软件(BectonDickinson)分析。平均荧光强度(MFI)定义为流式细胞计数强度的比(对每个蛋白特异性抗体的强度/对兔IgG的强度)。利用EphA4过表达细胞，研究细胞表面抗-EphA4抗体的结合率。结果表明，抗-EphA4人抗体65和336与MIAPaca-2纟田胞(MFI分别为12.64和15.54)的结合比例高于人IgG(对照)。ADCC测定将靶细胞与0.8钙荧光素乙酰氧曱基酯(Calcein-AM，DOJINDO)于37。C接触30分钟。Calcein-AM由细胞酯酶切割产生焚光性衍生物鈣荧光素后发出荧光。靶癌细胞加入试-验前洗涤两次，然后铺至96孔U型底板(每孔4乂103个细胞)上。人外周血单个核细胞(PMBC)采集于健康人，用Ficoll-Paque(AmershamBiosciences)密度梯度离心分离后，用作效应纟田月包。用96孔板在250plAIM-V培养基中将靶癌细胞(T)和效应细胞(E)与不同浓度的抗-EphA4人抗体(0吗/孔、0.01(xg/孔、0.1吗/孔、l吗/孔、10吗/孔、100昭/孔)或对照抗体赫赛汀(Herceptin)(Roche)共温育，E和T的比值为100:1。该培养平行做三份，在250plAIM-V培养基(LifeTechnologies,Inc)中37。C培养6小时。对照试验包括将靶细胞仅与抗-EphA4人抗体或效应细胞培养。有些实验中用赫赛汀作为对照。采用INCellAnalyzer1000(AmershamBioscience)快速获得活细胞的荧光图像，根据荧光图像评估抗-EphA4人抗体(65和336)对这些细胞的ADCC^丈应。应用Developertoolver.5.21^/f牛(AmershamBioscience)^"焚光物体或嚢泡进行计数，从而将这些图像在数值上转化为活细胞计数(对于輩巴细胞为细胞面积)。在一些实验中用Herceptin作为对照。没有观察到由65和336抗-EphA4人抗体本身所致的MIAPaca-2细胞的直接细胞损伤。但是，65和336抗-EphA4人抗体在EphA4过表达的MIAPaca-2细胞中诱导ADCC(图2)，而对EphA4低表达的PK-45P细胞没有影响(图2)。工业实用性本发明是基于，至少部分基于，EphA4表达细胞可被抗体细胞毒性损伤这一发现。本发明人鉴定了EphA4为在胰腺癌中强表达的基因。因此，如胰腺癌)的治疗。事实上由本发明人确认的结果，显示在EphA4抗体存在下由于胰腺癌细胞系中ADCC效应所致的细胞毒性。尽管已经详细地并且参考本发明的具体实施方案描述了本发明，但对于本领域技术人员来说，显然可以对本发明进行各种变化和修饰而不背离本发明的精神和范围，其界限由所附的权利要求书来指明。权利要求1.一种用于损伤EphA4表达细胞的药物组合物，该组合物包含抗-EphA4抗体作为活性成分，其中抗体具有抗体效应物作用。2.权利要求l的药物组合物，其中所述EphA4表达细胞是胰腺癌症细胞。3.权利要求l的药物组合物，其中所述抗-EphA4抗体是单克隆抗体。4.权利要求l的药物组合物，其中所述抗体效应物作用是抗体依赖性细胞毒性，或者是补体依赖性细胞毒性，或者是上述两者。5.权利要求l的药物组合物，其中所述抗体包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，称作CDR1、CDR2和CDR3,每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列选自下组人VHCDR1:ELSMH(SEQIDNO:10),人VHCDR2:GFDPEDGETIYAQKFQG(SEQIDNO:11)，人VHCDR3:AQPFHWGDDAFDI(SEQIDNO:12)，人VLCDR1:SGSSSNIGSNTVN(SEQIDNO:15),人VLCDR2:SNNQRPS(SEQIDNO:16),人VLCDR3::AAWDDSLNGPV(SEQIDNO:17);和人VHCDR1:SNSAAWN(SEQIDNO:20),人VHCDR2:RTYYRSKWYNDYAVSVKS(SEQIDNO:21),人VHCDR3:DSLRSFDY(SEQIDNO:22)，人VLCDR1::SGSSSNIGNNYVS(SEQIDNO:24),人VLCDR2::DNNKRPS(SEQIDNO:25),人VLCDR3::GTWDSSLSAVV(SEQIDNO:26),6.权利要求5的组合物，其中所述人VH包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，人VL包含SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。7.权利要求5的组合物，其中所述抗体进一步包含人IgGl的Fc域。8.—种抗体，其包含VH链和VL链，每条VH链和VL链包含被框架氨基酸序列所分隔的CDR氨基酸序列，称作CDR1、CDR2和CDR3，每条VH链和VL链中各CDR的氨基酸序列选自下组人VHCDR1:ELSMH(SEQIDNO:10),<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>9.权利要求8的抗体，其中所述人VH包含SEQIDNO:27或29的氨基酸序列，所述人VL包含SEQIDNO:28或30的氨基酸序列。10.权利要求8的抗体，其中所述抗体进一步包含人IgGl的Fc域。11.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求8的抗体。12.—种载体，其包含权利要求11的多核苷酸。13.—种分离的宿主细胞，其包含权利要求12的载体。14.一种产生抗体的方法，其包含如下步骤培养权利要求13的宿主细胞从而表达多核香酸，并从宿主细胞培养物回收抗体。15.—种用于损伤EphA4表达细胞的药物组合物，其中该组合物包含权利要求ll的多核苷酸，或者包含权利要求11的多核苷酸的载体。16.—种用于损伤EphA4表达细胞的方法，其包含以下步骤a)使EphA4表达细胞与抗-EphA4抗体接触，和b)利用已与细胞结合之抗体的效应物作用来损伤EphA4表达细胞。17.—种免疫原性组合物，用于诱导针对EphA4表达细胞具有效应物作用的抗体，其中所述组合物包含EphA4、其免疫学活性片段、或者可表达EphA4或其免疫学活性片段的DNA作为活性成分。方法包含施用EphA4、其免疫学活性片段、或者可表达EphA4或其免疫学活性片段的细胞或DNA。18.<image>imageseeoriginaldocumentpage3</image>19.一种用于治疗或预防受试者中胰腺癌症的方法，其包含如下步骤对所述受试者施用药学有效量的抗-EphA4抗体或其免疫学活性片段，其中所述抗体具有抗体效应物作用。全文摘要本发明涉及利用基于抗-EphA4抗体的效应物作用的细胞毒性。特别是，本发明提供包括抗-EphA4抗体的方法和药物组合物，其中抗-EphA4抗体作为利用抗体效应物作用损伤EphA4表达细胞的活性成分。由于EphA4在胰腺癌细胞中强表达，所以本发明在胰腺癌治疗中特别有用。文档编号A61K39/395GK101432022SQ20078001536公开日2009年5月13日申请日期2007年2月22日优先权日2006年2月28日发明者中鹤修一,吉川惠美,广岛真一申请人:肿瘤疗法科学股份有限公司