凝血酶溶液及其使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物溶液领域，并且更具体地涉及用于冻干凝血酶水溶液的方法、用 于此类冻干方法的凝血酶溶液，以及通过此类方法产生的固体凝血酶组合物。
【背景技术】
[0002] 凝血酶是在凝血过程中由血浆中的凝血酶原形成的蛋白水解酶。
[0003] 凝血酶作为凝血因子广泛用于临床应用以通过将纤维蛋白原转化成纤维蛋白而 使伤口止血。它是外科敷料的常见组分，并且已与纤维蛋白原及其它凝血蛋白质组合用于 二组分止血系统诸如纤维蛋白胶、粘合剂和密封剂。
[0004] 已知的是，在贮存之前将凝血酶溶液冻干以产生固体凝血酶组合物，以便减少蛋 白质降解，其中该固体凝血酶组合物可在使用前复原。冻干通常是指冷冻混合物以及然后 降低水浓度（例如通过升华到不支持生物或化学反应的水平）的方法。由冻干方法所得的 多孔海绵状固体材料称为粉饼。希望此类固体凝血酶组合物具有低水含量（例如，小于约 3% )，长期（优选地在室温下）保持结构和功能稳定性，以及在复原时与在冻干之前溶液中 凝血酶的活性相比保持高百分比的凝血酶活性。
【背景技术】 [0005] 凝血酶溶液的实例在 EP 813598B1、US 5, 605, 884、US 4, 877, 608、US 2010/0074865、US 5, 733, 873、EP 1766003 和 US 2010/0168018 中有所描述。凝 血酶溶液在所存在的赋形剂的数量和类型方面以及在各种赋形剂的浓度方面变化相当大。
[0006] 冷冻保护剂或稳定剂通常用于凝血酶溶液以避免凝血酶因冷冻应力而变性或 失活，以使蛋白质在后续生产步骤中稳定，以及延长储存寿命。冷冻保护剂的示例包 括糖，诸如蔗糖、乳糖和海藻糖；糖醇，诸如甘露糖醇；以及表面活性剂，诸如聚乙二醇、 TritonX-100、TWEEN-20和TWEEN-80。除了充当稳定剂以外，甘露糖醇和蔗糖（在较低程度 上）还被用作膨松剂，其有助于提供具有强物理结构的粉饼。使用膨松剂对于具有低固体 物质含量（单位体积）的配方是尤其重要的。
[0007] 人血清白蛋白（HSA)还广泛用于生物制药配方，作为稳定剂和膨松 剂（H. R. Constantino, M. J. Pikal :《生物制药的冻干》，斯普林格出版社，2004年 (Lyophilization of Biopharmaceuticals, Springer,2004))〇
[0008] EP 813598B1公开了用于冻干的简单凝血酶配方，其包含：40mM的葡糖酸、20mM的 柠檬酸三钠和150mM的NaCl ;US 5, 605, 884和US 4, 877, 608公开了包含高达10%的糖诸 如蔗糖、甘露糖醇或麦芽糖的配方；US 2010/0074865公开了包含5. 7 %的乳糖、3. 1 %的海 藻糖和0. 001 %的TWEEN-80的配方；以及US 5, 733, 873公开了包含0. 001-0. 025%的聚山 梨醇酯80 (TWEEN-80)且具有或不具有0. 1 %的PEG 4000和2%的甘露糖醇的配方。
[0009] 氯化钠（NaCl)常用于减少蛋白质在生物制药配方的冻干过程中的沉淀和聚集。 然而，EP 1766003公开了 NaCl可能存在问题，因为其降低玻璃化转变温度，从而必须采用 低初级干燥温度和延长的干燥循环时间。另外，US 2010/0168018公开了不具有NaCl或具 有以微量存在的NaCl的配方。
[0010] 此类冻干已知的凝血酶溶液的方法的持续时间通常非常长，这增加了方法的成本 和/或产生如下固体凝血酶组合物：其具有相对高的水含量和/或在复原时与冻干前溶液 中的凝血酶活性相比保持相对低百分比的凝血酶活性。
【发明内容】
[0011] 本发明在其一些实施例中涉及用于冻干凝血酶水溶液的方法、用于此类冻干方法 的凝血酶溶液，和通过此类方法产生的固体凝血酶组合物。在一些实施例中，本文所公开的 溶液和方法使得能够使用比用于冻干凝血酶溶液的已知方法耗时更短（例如，短37%)的 冻干方法制备固体凝血酶组合物，从而提高冻干能力和成本效益。
[0012] 在一些实施例中，本文所述的冻干方法产生这样的固体凝血酶组合物：其具有相 对低的水含量和/或在室温下在相对长的一段时间内高度稳定，和/或在复原时表现出高 凝血酶活性恢复率。在一些实施例中，该方法包括使用最佳的含水凝血酶配方。
[0013] 本发明的方面和实施例在下文的说明书和所附权利要求中描述。
[0014] 根据本文所述的一些实施例的一个方面，提供了一种用于冻干凝血酶水溶液的方 法，该方法包括提供包含以下成分的凝血酶水溶液：约1至低于约4.6% (w/v)的糖或糖 醇、至少约〇. 7至低于约1. 75% (w/v)的氯化钠、约0. 2至约3%的白蛋白、氯化妈和乙酸 钠、以及冻干该凝血酶水溶液。
[0015] 在一些实施例中，在凝血酶水溶液中存在钙使凝血酶结构稳定，从而在冻干期间 保持其活性。另外，还需要钙来支持凝血酶止血活性。在冻干凝血酶水溶液之后，得到称为 粉饼的多孔海绵状固体材料（本文也称为固体凝血酶组合物）。
[0016] 在一些实施例中，凝血酶水溶液包含约200至约2000IU/ml的凝血酶、约0. 3至约 I. 5% (w/v)的氯化妈和约0. 14至约1% (w/v)的乙酸钠。
[0017] 在一些实施例中，凝血酶水溶液包含约1. 6至低于约4. 6% (w/v)的糖或糖醇、约 0. 7至约I. 7% (w/v)的氯化钠、高于约0. 2至低于约3%的白蛋白、约0. 3至约I. 2% (w/ v)的氯化妈和约〇· 14至约0· 7% (w/v)的乙酸钠。
[0018] 在一些实施例中，糖或糖醇以2% (w/v)的浓度存在，白蛋白以约0.6% (w/v)的 浓度存在，氯化钠以约0.76 % (w/v)的浓度存在，氯化钙以约0.6 % (w/v)的浓度存在，并 且乙酸钠以约0.27% (w/v)的浓度存在。
[0019] 在一些实施例中，凝血酶水溶液基本上由凝血酶、糖或糖醇、氯化钠、白蛋白、氯化 钙和乙酸钠组成。
[0020] 在一些实施例中，糖包含单糖（任选地选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和核糖）和 /或二糖（任选地选自蔗糖、麦芽糖和乳糖）。在一些实施例中，二糖包含蔗糖和/或麦芽 糖，任选地为约2 % (w/v)的浓度。
[0021] 在一些实施例中，糖醇包含单糖衍生的糖醇，任选地选自甘露糖醇、山梨醇和木糖 醇。
[0022] 在一些实施例中，单糖衍生的糖包含甘露糖醇，任选地为约2% (w/v)的浓度。
[0023] 在一些实施例中，糖醇为二糖衍生的糖醇，任选地选自麦芽糖醇、异麦芽酮糖醇和 乳糖醇。
[0024] 在一些实施例中，凝血酶水溶液包含单一的糖（单糖或二糖）或糖醇。在一些实 施例中，凝血酶水溶液缺乏糖或糖醇中的多于一种。在一些实施例中，凝血酶水溶液缺乏聚 乙二醇和组氨酸中的至少一种。
[0025] 在一些实施例中，该方法还包括在冻干之前将凝血酶水溶液的pH调节到在约5. 5 至约9范围内的pH。
[0026] 在一些实施例中，凝血酶水溶液在冻干容器中的高度（如从容器的最低点测量） 不大于约10mm，诸如例如约10mm、约9mm、约8mm、约7mm或约6mm。在一些示例性实施例中， 该高度为约8mm。
[0027] 在一些此类实施例中，其中凝血酶水溶液的高度不大于约10mm，总冻干时间不长 于约35小时，诸如例如约35小时、约34小时、约33小时、约32小时、约31小时、约30小 时或约29小时。在一些示例性实施例中，总冻干时间不大于约30小时。
[0028] 在一些实施例中，凝血酶水溶液在冻干容器中的高度不大于约20mm。在一些实施 例中，凝血酶水溶液的高度在约15至约19mm的范围内，诸如例如15mm、16mm、17mm、18mm或 19mm。在一些示例性实施例中，凝血酶水溶液在冻干容器中的高度为约17mm〇
[0029] 在一些此类实施例中，其中凝血酶水溶液的高度不大于约20mm，总冻干时间不长 于约68小时。
[0030] 在一些实施例中，其中凝血酶水溶液的高度不大于约20mm，总冻干时间短于使用 冻干容器中相同高度的对照溶液的冻干循环的时间。"对照溶液"具有不同于本文所述的组 合物的组成。对照组合物可因包含额外的或其它类型的赋形剂而不同于本发明的组合物和 /或在各种赋形剂的浓度方面不同于本发明的组合物。
[0031] 在一些实施例中，与使用已知的现有技术溶液相比，总冻干时间缩短约37%。
[0032] 在一些实施例中，冻干包括：i)使凝血酶水溶液经受冷冻工序以产生冷冻的凝血 酶溶液；ii)使步骤i)的冷冻的凝血酶溶液经受初级干燥工序；以及iii)使步骤ii)的产 物经受次级干燥工序。
[0033] 在一些实施例中，冷冻工序是在约_45°C至约_55°C的冷冻温度下进行的。在一些 实施例中，冻干是在冻干机搁板上进行的并且冷冻工序包括将冻干机搁板维持在约_45°C 至约-55°C，诸如例如约-50°C的冷冻温度（本文也称为冷冻浸泡）。
[0034] 在一些实施例中，冷冻工序是在约1个大气环境的压力下进行的。
[0035] 在一些实施例中，其中凝血酶水溶液在冻干容器中的高度不大于约10mm(诸如约 8_)，将冷冻温度维持不长于约5小时。
[0036] 在一些实施例中，其中凝血酶水溶液在冻干容器中的高度不大于约20mm(诸如 15-19_，例如约17_)，将冷冻温度维持不长于约6小时。
[0037] 在一些实施例中，在不长于约2. 5小时的时间段内达到该冷冻温度，诸如冻干机 搁板的温度（本文也称为冷冻蠕变）。
[0038] 在一些实施例中，初级干燥工序是在约-12°C至约-18°C下进行的。在一些实施 例中，初级干燥工序包括将冻干机搁板维持在约-12°C至约-18°C诸如约-12°C、约-13°C、 约-14°C、约-15°C、约-16°C、约-17°C或约-18°C的初级干燥温度和约100微巴至约160微 巴的压力下。在一些示例性实施例中，初级干燥温度为约-15°C。
[0039] 在一些实施例中，在约80至约90分钟的时间段内达到初级干燥温度（诸如冻干 机搁板的温度）（本文也称为初级干燥蠕变）。
[0040] 在一些实施例中，其中凝血酶水溶液在冻干容器中的高度不大于约10mm(