无水乙醇溶液中，50°C下浸泡12h，然后用RO水超声清洗3次，每次5min，干燥备用；
[0043]4.然后配置EDC/NHS/MES (1mM/2OmM/5OmM) PBS溶液，然后用PBS稀释层粘连蛋白溶液浓度到100ug/ml和Fucoidan浓度100ug/ml ;将配好的EDC/NHS/MES溶液加入到Ln/Fucoidan溶液中(VEDC/NHS/MES:V WF= 1:9)滴加50ul到玻片表面；在37°C的孵箱中反应4h，然后用RO水清洗3次，然后用N2干燥，即可得到所需要的多功能涂层。
[0044]实施例2
[0045]1.将玻片依次用酒精(无水乙醇)，RO水(去离子水)超声清洗三次，每次lOmin，然后干燥处理；
[0046]2.将玻片羟基化处理:将玻片放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比(V%:V%= 7:3)在80°C中浸泡Ih ;然后用RO水清洗3次，每次5min ；
[0047]3.然后立即将上述样品放到3% APTE无水乙醇溶液中，50°C下浸泡12h，然后用RO水超声清洗3次，每次5min，干燥备用；
[0048]4.然后配置EDC/NHS/MES (1mM/2OmM/5OmM) PBS溶液，然后用PBS稀释层粘连蛋白溶液浓度到100ug/ml和Fucoidan浓度200ug/ml ;将配好的EDC/NHS/MES溶液加入到Ln/Fucoidan溶液中(VEDC/NHS/MES:V WF= 1:9)滴加50ul到玻片表面；在37°C的孵箱中反应4h，然后用RO水清洗3次，然后用N2干燥，即可得到所需要的多功能涂层。
[0049]实施例3
[0050]1.将玻片依次用酒精(无水乙醇)，RO水(去离子水)超声清洗三次，每次lOmin，然后干燥处理；
[0051]2.将玻片羟基化处理:将玻片放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比(V%:V%= 7:3)在80°C中浸泡Ih ;然后用RO水清洗3次，每次5min ；
[0052]3.然后立即将上述样品放到3% APTE无水乙醇溶液中，50°C下浸泡12h，然后用RO水超声清洗3次，每次5min，干燥备用；
[0053]4.然后配置EDC/NHS/MES (1mM/2OmM/5OmM) PBS溶液，然后用PBS稀释层粘连蛋白溶液浓度到200ug/ml和Fucoidan浓度100ug/ml ;将配好的EDC/NHS/MES溶液加入到Ln/Fucoidan溶液中(VEDC/NHS/MES:V WF= 1:9)滴加50ul到玻片表面；在37°C的孵箱中反应4h，然后用RO水清洗3次，然后用N2干燥，即可得到所需要的多功能涂层。
[0054]实施例4
[0055]1.将玻片依次用酒精(无水乙醇)，RO水(去离子水)超声清洗三次，每次lOmin，然后干燥处理；
[0056]2.将玻片羟基化处理:将玻片放入浓硫酸与双氧水按照体积比7:3配比(V%:V%= 7:3)在80°C中浸泡Ih ;然后用RO水清洗3次，每次5min ；
[0057]3.然后立即将上述样品放到3% APTE无水乙醇溶液中，50°C下浸泡12h，然后用RO水超声清洗3次，每次5min，干燥备用；
[0058]4.然后配置EDC/NHS/MES (1mM/2OmM/5OmM) PBS溶液，然后用PBS稀释层粘连蛋白溶液浓度到200ug/ml和Fucoidan浓度200ug/ml ;将配好的EDC/NHS/MES溶液加入到Ln/Fucoidan溶液中(VEDC/NHS/MES:V WF= 1:9)滴加50ul到玻片表面；在37°C的孵箱中反应4h，然后用RO水清洗3次，然后用N2干燥，即可得到所需要的多功能涂层。
[0059]图例详细说明:
[0060]图1从图中可以看出G@0H@APTE表面在硅烷化后的氨基(-NH2)浓度出现非常显著性差异，表面玻片表面具备了制备多功能涂层的氨基基团。
[0061]图2利用QCM-D实时动态观测多功能图层的制备过程，在LN/F图层组装后，通过PBS清洗，涂层表现较好的稳定性。
[0062]图3XPS结果显示制备的多功能涂层检测出层黏连蛋白的羧酸基团和岩藻聚糖的硫酸基团(S042—)
[0063]图4血小板粘附结果显示，图(a)玻片(Glass)表面虽然血小板数量很少，但形态为激活状态，图(b)硅烷化后的GOAPTE表面可以看到血小板大量聚集而且激活很严重。图(c)在Ln/F涂层表面，可以看到血小板的数量非常少，而且从高倍放大的图片可以看出血小板呈圆形皱缩状，表现为未激活态。从而得出Ln/F涂层具有较好的抗凝血效果。
[0064]图5从CCK的结果可以看出，图(a)对内皮细胞(EC)培养后，Ln/F涂层表面表现良好的内皮细胞相容性，促进内皮细胞生长的能力非常明显，CCK-8吸光度值越高说明细胞密度越高和活性越好，且Ln/F涂层表面细胞密度出现了非常显著性差异，说明Ln/F涂层具有快速内皮化效果。
[0065]图(b)对平滑肌细胞(SMC)培养后，Ln/F涂层表面表现良好的抑制平滑肌细胞增殖效果，CCK吸光度值越低说明细胞密度越小和活性越差，且Ln/F涂层表面细胞密度出现了非常显著性差异，说明Ln/F涂层具有很好抑制SMC增生效果。
【主权项】
1.一种抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，包含以下步骤: (1)支架的制备与清洗:支架经过泡酸，过夜后将样品取出用清水冲洗，然后依次用无水乙醇和蒸馏水RO超声清洗三次，每次5min，干燥备用； (2)酸活化:烧杯中配制浓硫酸和双氧水(V:V= 3:1) 20ml的酸性活化剂，将已经干燥的支架浸没在酸性溶液中80°C下恒温2h进行羟基化处理，再取出用蒸馏水进行充分清洗后干燥，得到活化后表面富含羟基的表面； (3)硅烷偶联:配制3%APTE无水乙醇溶液，将⑵活化后的样品放入APTE溶液中50°C下反应12h得到富含氨基的表面，样品经无水乙醇、RO水清洗后在真空下120°C固化反应2h得到固定APTE的表面，样品，标记为GOAPTE ； (4#0(:交联？/111:用EDC/NHS/PBS体系配制不同浓度比例的岩藻聚糖(Fucoidan，F) /层黏连蛋白(Ln)溶液，然后立即吸取50μ1于每个样品表面在37°C下反应2h，活化固定于支架表面形成表面膜，得到具备抗凝血促内皮且抑增生的多功能支架涂层目标物。
2.根据权利要求1所述的抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，其特征在于，所述的多功能涂层为岩藻聚糖F与基膜主要成分之一的Ln在PH = 7的磷酸盐缓冲液PBS中共混，控制层粘连蛋白溶液浓度到100-200ug/ml和Fucoidan浓度100-200ug/ml。
3.根据权利要求1或2所述的抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，其特征在于，所述支架可以由以下材料之一制得:玻片、惰性材料陶瓷，合金材料镍钛合金，金属不锈钢和氧化钛。
【专利摘要】本发明公开了一种能够抗凝血快速内皮化且抑增生的多功能血管支架涂层的制备方法，其主要步骤是先对材料表面进行羟基化处理，然后在3％的APTE乙醇溶液中50℃硅烷化处理12h，然后在材料表面通过EDC/NHS偶联固定一层Ln/F薄膜，获得目标产物。本发明具有操作简单，反应条件温和，效率高，成本价格低廉的优点。其目标物涂层由于低分子量岩藻聚糖的作用，具有较强的抗血栓，抗凝血和抑制平滑肌内膜增生的作用，此外，层粘连蛋白具有内皮细胞特异性结合位点，能够在材料植入人体后快速内皮化，因此该涂层具有优异抗凝血性能和生物相容性。
【IPC分类】A61L33-08, A61L31-16, A61L31-10
【公开号】CN104841023
【申请号】CN201510214149
【发明人】赵安莎, 王艳
【申请人】西南交通大学
【公开日】2015年8月19日
【申请日】2015年4月30日