免疫调节蛋白的制作方法

免疫调节蛋白的制作方法
【专利说明】免疫调节蛋白 发明领域
[0001] 本发明涉及具有免疫调节功能的工程化蛋白，及其用于治疗自身免疫性疾病或炎 性疾病的医疗用途。特别地，所述工程化蛋白可用作静脉内免疫球蛋白（IVIG)的替代物。
[0002] 发明背景
[0003] 自身免疫性疾病和炎性疾病是高发病率和死亡率的原因。在2003年，自身免疫性 疾病是75岁以下的全部年龄组中第6位最常见死亡的根本原因。一种重要的治疗方式为 静脉内免疫球蛋白（IVIG)或IgG。最初，开发了来自人血浆的免疫球蛋白产品以治疗免疫 缺陷。然而，目前使用了 70%处方IVIG用于治疗自身免疫状况或炎性状况。全世界消耗的 IVIG从1980年的每年300kg增加到2010年的每年100公吨。根据漫长和昂贵的制造工 艺，从约3, 000匿名捐赠者汇集的血浆中衍生得到IVIG。对于捐赠者和捐赠血浆的病毒的 广泛筛选的需求产生了高成本。考虑到增加的需求，以及IVIG生产的严格调控，可能发生 IVIG的短缺。IVIG制品可受制于不充分无菌度、杂质的存在和批次间的变化。它们在其免 疫球蛋白A含量方面可极大地变化，并且IgA可在IgA缺陷的接受者中引起变态反应或过 敏反应。使它们不适合某些患者。不得不向患者给予非常大剂量的IVIG，典型地2克每公 斤体重，且这可在一些患者中引起不良反应。鉴于这些限制，需要用于IVIG的界定的替代 物。
[0004] 尽管IVIG作用的机制还不清楚，源自IVIG的Fc片段可治愈罹患特发性血栓性 紫癜（ITP)的儿童（Debre M等，1993)。尽管所涉及的确切受体被激烈争论（Samuelsson A 等，2001 ;Bazin R 等，2006 ;Crow. A. R 等，2003 ;Leontyev D 等，2012 ;Siragam. V 等，2006)且可因为疾病（对该疾病使用了 IVIG)而变化（Araujo L. M等，2011 ;Anthony R. Μ.等，2011)，认为IgG的Fe部分与在单核细胞和巨噬细胞上发现的抑制性和活化型 Fcy R两者之间的相互作用是重要的。已证明抑制性Fc受体Fcy RIIb对于IVIG在ITP小 鼠模型中的保护性作用是必需的（Samuelsson等，2001)。还已经证明在多种疾病中活化型 Fc受体Fc γ RIIIa的作用（Mekhaiel等，2011b综述）。尽管近期工作已证明在小鼠模型中 FcRn不参与改善ITP (Crow等，2011)，还已经假设FcRn负责维持Fc在血浆中的长半衰期 (Roopenian和Akilesh, 2007)。Fc部分不仅与Fc受体相互作用，而且与某些凝集素相互作 用。已知IVIG通过Fc-聚糖的末端唾液酸与B淋巴细胞上的⑶22凝集素结合（Siglec-2) (Seite J. F等，2010)，且最近研宄证明，由于唾液酸化Fe与DC上的人凝集素受体DC-SIGN 相互作用，唾液酸化Fc是小鼠关节炎模型中IVIG抗炎作用的原因 （Anthony R.M等，2011)。
[0005] IVIG还可通过在其中注射的IVIG首先在患者中形成一类免疫复合物的多步模型 起作用（Clynes 等，2005 ;Siragam 等，2005, 2006 ;Machino 等，2012)。形成了这些免疫复 合物之后，它们与这些受体相互作用以介导有助于减少自身免疫性疾病或炎性状态严重性 的抗炎性作用（Siragam等，2006)。通过抗独特型相互作用（Machino等，2010 ;Machino 等，2012 ;Roux 和 Tankersley, 1990 ;Teeling 等，2001)或通过 Fe 的共价相互作用（Yoo 等，2003)在IVIG中形成了 Fc的多聚体。假定IgG多聚体显示了与以上受体结合的更高 的总亲和力（avidity)并通过交联所述受体的性质诱导了不能被Fc单体所诱导的保护性 信号。这通过免疫复合物（IC)在小鼠中逆转ITP (Bazin等，2006)并通过观察IC通过 Fe YRIIb增强不成熟树突细胞的致耐受性来促进狼疮的减轻（Zhang等，2011)所支持。可 市购获得的IVIG中多聚体IgG和/或唾液酸化IgG的比例极其低（分别〈1 %和5% )，其 可以是需要施用很大量的原因（Nimmerjahn和Ravetch, 2007)。
[0006] 其他提出的IVIG作用机制为独特型-抗独特型网络的修复；由IVIG中的特异性 抗体抑制或中和细胞因子；阻断在白细胞上的粘附分子与血管内皮的结合；抑制补体在靶 组织中的摄入；中和微生物毒素；由IVIG中的抗Fas抗体阻断Fas配体介导的细胞凋亡； 在高浓度IVIG下抗Fas抗体诱导细胞凋亡；由IVIG中的抗Siglec-9抗体的嗜中性粒细 胞的细胞凋亡；使FcRn受体饱和以增强自身抗体的消除；在效应物巨噬细胞上诱导抑制性 Fc γ RIIb受体冲和B细胞的生长因子，诸如B细胞活化因子；抑制T细胞增殖反应；Treg 细胞群的扩增、活化或两者；抑制树突细胞的分化和成熟；增强"致敏"树突细胞的分化和 成熟（在 Ballow, 2011 ;Mekhaiel 等，2011b 中综述）。
[0007] 已经提出了用于在治疗自身免疫性疾病中使用和/或作为IVIG替代化合物的 重组蛋白。US 2011/0081345(Moore)公开了在治疗自身免疫性疾病中可以是有用的单链 Fc(scFc)蛋白，所述单链Fc蛋白的每分子具有一个Fc单元，包含两个连接的Fc结构域氨 基酸链。US 2004/0062763 (Temple University ;Mosser)公开了使用多价 Ab 或其部分以 连接Fe YRI来上调IL-10的产生，以治疗自身免疫紊乱。剂可以是偶联在一起的或提供于 单个重组肽中的两种或更多种Fc片段。US 2008/0206246(The Rockefeller University ; Ravetch)公开了包含至少一个唾液酸化的IgG Fe区域的多肽，和其用作IVIG替代化合物 的用途。尽管在这些文献中公开的化合物可靶向Fc受体，包含Fc单体或二聚体的化合物可 不以有效地或完全有效地作为IVIG替代化合物的足够的总亲和力来结合Fc受体。因此， 它们不是IVIG的多聚体级分的适合仿生物。在这些文献中没有公开更高等级多聚体。也 没有公开工程化作为IVIG替代化合物是有活性的更高等级多聚体的任何方式。
[0008] US 2010/0239633 (University of Maryland, Baltimore ;Strome)公开了包含多 个连接的Fe部分的IVIG替代化合物。设想使用了 IgM的C μ 4结构域和J链的星形排列 以实现聚合。然而，没有描述工作实例，且在此处报道的计算机模拟表明，示例性分子将不 会有效地聚合和/或Fc部分将不会被排列用于有效结合Fc或其他受体。此外，包含多于 一个的不同多肽链的生物复合物可更难以均匀地制造，因为不是所有的多肽亚单位可以以 稳定地并可预测的方式相互作用。例如，产生包含正确比例的轻链和重链的活性完整抗体 的表达抗体重链和轻链的细胞系，还可产生不含轻链连接物的治疗上无活性重链二聚体或 半聚体（halfmer)分子。
[0009] US 2010/0239633中还提出了线性结构，其中通过相同的Fc结构域氨基酸链之间 的配对使单个氨基酸链二聚化，因此生成了 Fc区域。例如，铰链区可在两个单个氨基酸链 之间形成链间二硫键。然而，如在US 2010/0239633的图11和图12中图解的，在多个Fc 氨基酸链串联地连接的情况下，可存在多个不同方式，其中这些链可以配对。因此，将不能 预期具有可靠和可预测的性质的一致产品。提出了包括来自IgE的末端重链结构域以防止 此"拉链"效应。然而，分子与IgE受体的结合可具有不希望的结果，包括过敏性休克或其 他变态反应的风险。
[0010] US 2010/0239633还提出制造簇分子，其中多聚化区域诸如IgG2a铰链或异亮氨 酸拉链，引起氨基酸链二聚化或多聚化，因此使Fe结构域氨基酸链的对联合在一起以形成 功能性Fe单元。在后续的研宄中，Jain等（2012)描述了重组蛋白的制备，其中人IgG2铰 链序列或异亮氨酸拉链融合到小鼠 IgG2a。作者报道了，多聚化区域中的任一个引起了同源 二聚体（即此处称为单体的单个功能Fe单元）和多聚体的形成。这些蛋白的多聚级分在 治疗ITP小鼠模型或胶原诱导关节炎小鼠模型中具有一些功效。然而，大多数包含IgG2铰 链的制备的蛋白为单体或作为二聚体或三聚体存在。具有未知四级结构的更高等级寡聚体 仅占小部分。在包含异亮氨酸拉链的蛋白中，更高等级多聚体的比例更低。更高等级多聚 体在大小上表现不均一，且其结构、包括附接在N297的聚糖的性质是未知的。考虑到这些 多聚体的一些或全部在产生的蛋白中的低比例，分离它们用于治疗用途将使得大量的浪费 不可避免，且表现出不太可能在商业上可行。
[0011] 为了治疗自身免疫性疾病和炎性疾病，对于确定结构的化合物存在需求，所述化 合物有效靶向IVIG的生物活性潜在的适合机制。
[0012] 该说明书中的在先公布文献的列表或讨论将不被认为承认该文献为本领域的状 态的一部分或为公知常识。
[0013] 发明概述
[0014] 本发明的第一方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾 病的方法，所述方法包括：
[0015] 向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多 肽单体单元；
[0016] 其中每个多肽单体单元包含Fe受体结合部分，所述Fe受体结合部分包含2个免 疫球蛋白G重链恒定区；
[0017] 其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二 硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；
[0018] 其中多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当施用到哺乳动物受试者时引起抗 原特异性免疫抑制的抗原部分。
[0019] 本发明的第二方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾 病的方法，所述方法包括：
[0020] 向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽 单体单元组成；
[0021] 其中每个多肽单体单元由Fe受体结合部分组成，所述Fe受体结合部分由两个免 疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fe的多肽接头 (linker)组成；且
[0022] 其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二 硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。
[0023] 本发明的第三方面提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎性疾 病的方法，所述方法包括：
[0024] 向哺乳动物受试者施用有效量的多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽 单体单元组成；
[0025] 其中每个多肽单体单元由Fe受体结合部分和尾片段区（tailpiece region)组 成；
[0026] 其中Fe受体结合部分由两个免疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球 蛋白G重链恒定区为单链Fe的多肽接头组成；
[0027] 其中每个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残 基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸 残基；且
[0028] 其中尾片段区融合到多肽单体单元的两个修饰的人免疫球蛋白G重链恒定区的 每个并促进单体单元组装成聚合体。
[0029] 本发明的第四方面提供了多聚蛋白，所述多聚蛋白包含5个、6个或7个多肽单体 单元；
[0030] 其中每个多肽单体单元包含Fe受体结合部分，所述Fe受体结合部分包含两个免 疫球蛋白G重链恒定区；
[0031] 其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二 硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基；
[0032] 其中，多聚蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当向哺乳动物受试者施用时引起 抗原特异性免疫抑制的抗原部分；
[0033] 其中每个多肽单体单元不包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区的每个的尾 片段区。
[0034] 本发明的第五方面提供了多聚蛋白，所述多聚蛋白由5个、6个或7个多肽单体单 元组成；
[0035] 其中每个多肽单体单元由Fe受体结合部分组成，所述Fe受体结合部分由两个免 疫球蛋白G重链恒定区和任选地连接两个免疫球蛋白G重链恒定区为单链Fe的多肽接头 组成；且
[0036] 其中每个免疫球蛋白G重链恒定区包含半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基通过二 硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸残基。
[0037] 本发明的第六方面提供了核酸分子，所述核酸分子包含编码如根据本发明第四或 第五方面定义的多聚蛋白的多肽单体单元的编码部分。
[0038] 本发明的另外方面为包含本发明第六方面的核酸分子的表达载体、包含表达载体 的宿主细胞、和包含本发明第四或第五方面的多聚蛋白的治疗组合物。
[0039] 还设想了相应于本发明第一方面至第三方面的治疗方法的医疗用途。
[0040] 附图简述
[0041] 图1 :六聚体Fe和结构表征。A.显示了一个单体和其毗邻单体之间形成的Cys309 和Cys360(尾片段）二硫键（disulphide linkage)的六聚体Fe模型（左图）。轻敲模式 原子力显微术图像（右手图）揭示了与六聚体相一致的桶形、六倍对称复合物。在更小的 扫描尺寸下（两幅右手图的下图），显示这些复合物直径为约20nm(在下图中的比例尺为 50nm)。B.从哺乳动物细胞系产生的六聚体Fe可通过体积排阻色谱法作为约312kDa的分 子被检测到（高亮的痕迹为六聚体）。还检测到了小比例的二聚体。
[0042] 图2 :六聚体Fe与人和小鼠 Fe γ受体（Fe γ R)的结合。将滴定量（50-0. 3nM)的 Fe蛋白包被到ELISA孔上。使用辣根过氧化物酶（HRP)缀合的抗GST抗体可视化被如所示 的由人或小鼠谷胱甘肽-S-转移酶（GST)-融合的Fe γ R的结合。值代表一式三份的确定 值。误差线为在平均值附近的标准误差（SE)。如在Mekhaiel等，2011a中所描述的，抗原 融合的Fc蛋白几乎不与Fc受体结合。
[0043] 图3 :六聚体Fc与人⑶19+人B淋巴细胞的结合。特征化流式细胞术图显示了通过 其前向角和侧向角散射的图形（左图）所代表的人白细胞的不同群体。对以抗人CD19-FITC 染色的单个CD19+B淋巴细胞（加框的，中间图片）门控并调查了与六聚体Fc的结合（右 图）。通过右边最远的标记线（箭头所指的六-Fe)表示50 μ g六-Fc与⑶19+B细胞的结 合。用FcRL5特异性单克隆抗体509F6 (箭头所指的六-Fe+阻断FcRL5的mAb 509F6)对 细胞的在先孵育使六聚体Fe的结合脱落，表明FcRL5是六聚体Fe结合B细胞的部分原因。
[0044] 图4 :对Fe蛋白的补体结合分析。通过ELISA确定的Clq(左图）和C5_9(右图） 对Fe融合物的沉积。每个点代表对在给定组内的每个小鼠双重孔的平均光密度（+/-SD)。 显示了来自三个重复实验中的一个实验的数据。
[0045] 图5 :六聚体Fe蛋白在ITP的小鼠模型中保护免受血小板损失。用六-Fc、 IVIG(GammaGard)或PBS腹腔（i.p.)注射了 Balb/C小鼠。一小时以后，在所有小鼠中诱导 了 ITP。在处理之后示出的时间点计算了血小板。
[0046] 本发明的优选实施方案的详述
[0047] 根据本发明的第一方面，提供了用于治疗哺乳动物受试者的自身免疫性疾病或炎 性疾病的方法。通过施用包含5个、6个或7个多肽单体单元的多聚蛋白治疗受试者；其中 每个多肽单体单元包含Fe受体结合部分，所述Fe受体结合部分包含两个免疫球蛋白G重 链恒定区。
[0048] 术语"免疫球蛋白G重链恒定区"意指天然免疫球蛋白G重链区或其变体或片段。 Fe受体结合部分典型地包含免疫球蛋白G的Fe部分、或其片段或变体。术语"Fc部分"包 括通过酶木瓜蛋白酶的有限蛋白水解获得的IgG分子的片段，所述木瓜蛋白酶在IgG的铰 链区起作用。以此方式获得Fe部分包含两个相同的二硫键连接的肽，所述肽包含IgG的 重链CH2和CH3结构域，也被分别称为C γ 2和C γ 3结构域。两个肽通过在肽的N端部分 中半胱氨酸残基之间的两个二硫键连接。对于IgG，描述的二硫键的排列属于天然人抗体。 尽管在本发明的上下文中此类抗体可以是适合的，一些变化可存在于其他哺乳动物物种的 抗体之间。在鸟类、爬行动物和两栖动物中也发现了抗体，且它们同样地可以是合适的。在 例如 Ellison 等（1982)NUCLEIC ACIDS RES. 10:4071-4079 中公开了人 Fe IgG 的核苷酸序 列和氨基酸序列。在例如Bourgois等（1974)EUR. J.BI0CHEM. 43:423-435中公开了小鼠 Fe IgG2a的核苷酸序列和氨基酸序列。免疫球蛋白G重链恒定区可典型地通过重组表达技 术产生，且如在天然抗体中发生的，作为单体单元通过二硫键相缔合。可选地，两个恒定区 可产生作为具有中间接头区的单氨基酸链，即作为典型地还通过重组表达技术产生的单链 Fe (seFe)。在US 2011/0081345中描述了 scFc分子，包括具有以下从N端到C端的一般结 构的实例：铰链-CH2-CH3-接头-铰链-CH2-CH3。
[0049] 典型地，每个免疫球蛋白G重链恒定区包含哺乳动物重链恒定区，优选地人重链 恒定区的氨基酸序列、或其变体。适合的人IgG亚型是IgGl。
[0050] Fe受体结合部分可包含多于免疫球蛋白的Fe部分。例如，它可包括在天然免疫球 蛋白中的CHl与CH2结构域之间出现的免疫球蛋白的铰链区。对于某些免疫球蛋白，铰链 区对于与Fe受体的结合是必需的。优选地，Fe受体结合部分缺少CHl结构域和重链可变 区结构域（VH)。与相应的免疫球蛋白的Fe部分相比，可在C端和/N端截短Fe受体结合部 分。因此，此Fe受体结合部分是Fe部分的"片段"。
[0051] 凭借包含半胱氨酸残基的各个免疫球蛋白G重链恒定区形成了多聚蛋白，所述半 胱氨酸残基通过二硫键连接到毗邻多肽单体单元的免疫球蛋白G重链恒定区的半胱氨酸 残基。由于IgM和IgA天然是聚合体，而IgG天然是单体，基于IgG重链恒定区的单体单 元形成聚合体的能力可通过修饰IgG重链恒定区的部分使其更加类似于IgM或IgA的相 应部分来提高。适合地，每个免疫球蛋白重链恒定区或其变体是包含含有根据EU编号系 统在309位置上的半胱氨酸残基、并优选地还包含在310位置上的亮氨酸残基的氨基酸序 列的 IgG 重链恒定区。在 Kabat EA 等，1983Sequences of proteins of immunological interest. US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Washington DC 中描述了用于 IgG 的 EU 编号系统。Sorensen 等（1996) J Tmmunol 156:2858-2865中描述了在包含IgM尾片段的人IgG分子中Leu 309突变为Cys 309,以促 进聚合体形成。Leu 309通过序列同源性相应于在IgM的Cy 3结构域的Cys 414和在IgA 的Ca 2结构域中的Cys 309。（注意，在IgM和IgA或IgG类别之间氨基酸残基的编号不 同。）其他的突变也可以是有利的。
[0052] 适合地，每个多肽单体单元包含融合到两个免疫球蛋白G重链恒定区中每个的尾 片段区；其中每个多肽单体单元的尾片段区有助于单体单元组装成聚合体。典型地，尾片段 区融合到两个免疫球蛋白重链恒定区中每个的C端。适合地，尾片段区是IgM或IgA尾片 段、或其片段或变体。这些尾片段分别是IgM的C μ 4结构域或IgA的C a 3结构域的最末 的部分。
[0053] 在描述一个区域为融合到另一个区域的C端的情况下，前面的区域可直接地融合 到后面区域的C端，或它可