号）和表现为在人IgGl的Fc区内的N连接糖基化的唯一位点的Asn-297。在此残基处碳 水化合物的存在可有助于与Fc受体的结合。
[0087] 活化性Fcy受体为如上描述的；在人中，低亲和力活化性Fcy受体为Fcy RIIA/ C和Fcy RIIIA。Fcy RI为高亲和力活化性受体。Fcy RIIB为抑制性人Fc受体。由于 Fc γ RIIB和Fc γ RIIA/C的配体结合性质相同，增加对Fc γ RIIA/C的亲和力而同时减少对 FcyRIIB的亲和力是不可能的。Lazar等（2006)PNAS 103:4005-10描述了在人IgG的Fc 部分中的突变，其影响了与不同Fc受体的结合亲和力。与Fc γ RIIIa结合的野生型IgG具 有252ηΜ的KD;I332E突变体的K D为30ηΜ且S239D/I332E突变体的K D为2nM。A330L突变 与S239D/I332E的组合增加了 Fcy RIIIa亲和力并降低了 Fcy RIIb亲和力。Shields RL 等（2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604描述了在人IgGl的Fe部分中的突变，其影响了与 不同Fc受体的结合亲和力。S298A突变增加了对Fc γ RIIIa的亲和力并减少了对Fc γ RIIA 的亲和力；Ε333Α突变增加了对Fe YRIIIa的亲和力并减少了对Fe YRIIA的亲和力；突变 K334A增加了对FcyRIIIa的亲和力。可单独地使用或组合使用以上突变的任何或全部。 可通过常规方法鉴定其他适合的突变。
[0088] Fc受体结合部分对⑶22或DC-SIGN/SIGN-R1的亲和力可通过增加 Fc受体结合部 分上结合的唾液酸的量来增加。典型地，这通过增加 N297聚糖上末端唾液酸残基的量或比 例来实现，其可在翻译之后被添加到内质网中的Fc肽。
[0089] 可适合地进行其他突变以提高Fc受体结合部分的效力。适合地，每个免疫球蛋白 G重链恒定区包含与天然免疫球蛋白G重链恒定区的氨基酸序列相比修饰的氨基酸序列， 以通过增加 Fc受体结合部分对于新生Fc受体的亲和力来适合地增加多聚蛋白的体内半衰 期。增加血清持续性允许更高循环水平、更少施用频率和减少的剂量。这可通过增强Fc区 与新生FcR(FcRn)的结合来实现。表达在内皮细胞表面上的FcRn以pH依赖性的方式结合 Fe并阻止其降解。尽管在实施例中描述的六聚体Fe不能结合人FcRn，它与小鼠 FcRn结合 非常良好。氨基酸取代M252Y/S254T/T256E和/或H433K/N434F可被引入到Fe受体结合 部分以增加 IgG的体内半衰期而不过度地影响Fe YR相互作用（Vaccaro C，等（2005) Nat. Biotech. 23:1283-1288)。另外地或可选地，可重新引入H310。
[0090] 与单个Fe受体被单体Fe蛋白或IgG结合相比，多个Fe受体被聚合体Fe蛋白结 合可引起不同细胞内信号传导现象。多个Fe受体被多聚蛋白结合可在阻断Fe受体对其他 配体结合方面更为有效，特别是在低亲和力Fe受体的情况下。多聚蛋白的效力可对不形成 聚合体的单体单元的效力以许多方式来比较。在此类测试中，聚合体Fe蛋白的单体单元对 于给定Fe受体单独地具有相同的亲和力是典型的，因为单体单元不形成聚合体。
[0091] 多聚蛋白将对低亲和力受体包括Fe受体具有比对照单体单元更大的总亲和力。 它们还可对于FcRL、FcRn、CD22、DC-SIGN或其他Fe受体具有更大的总亲和力。总亲和力是 多价相互作用的整体结合力。在Fe结合区和Fe受体之间的相互作用具有特征性亲和力，而 对于每个相互作用，相互作用的总亲和力几乎按几何级数地增加。对于低亲和力Fe受体， 结合力的增加可允许与多聚蛋白的生物学相关的相互作用，其不可以通过单体单元或二聚 体单元实现。与对照单体蛋白的结合相比，通过多聚蛋白的多价结合导致了如通过平衡常 数（L/m〇l)测量的在稳定性上的可观增加。例如，在Fe部分和Fe受体之间的典型单价相互 作用可具有约IO4LAioI的平衡常数。六价相互作用可提供约10nL/mol的平衡常数。平衡 常数可基于Fe部分和Fe受体而变化。然而，六聚体蛋白将典型地展示在结合能中的增加， 与对照单体蛋白相比增加多达约IO4倍、10 5倍或10 6倍或甚至大于10 6倍。对于与FcRL5、 FcRn、CD22或DC-SIGN的多价相互作用，可预计结合能和平衡常数的类似增加。为了描述总 亲和力和亲和力，参见教科书 Roitt, Brostoff 和 Male 的 Immunology, 2nd edition I9890
[0092] 如以上描述的，可通过表面等离子体共振分析（Biacore)将多聚蛋白的Fe受体的 总亲和力与不形成聚合体的单体单元的总亲和力比较。
[0093] 已发现，将体积大的抗原（bulky antigen)融合到多聚蛋白可减少多聚蛋白与Fe 受体结合的能力（Mekhaiel等，2011a)。适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白 不包含（例如通过融合或缀合）减少与Fe YRII的结合总亲和力的部分。可通过比较包含 被测试部分的多聚蛋白的给定受体的结合总亲和力与通过缺少该部分的多聚蛋白取得的 总亲和力来确定对总亲和力的影响。典型地，如果亲和力减少多于10倍、或多于5倍或多 于2倍，包含该部分的多聚蛋白可以是不适合的。与Fe γ RII减少的结合总亲和力也将指 示与其他Fe受体包括Fe γ RI或Fe γ RIII的减少的结合总亲和力。可选地，可测试这些其 他受体的任一个或两个的结合总亲和力。
[0094] 如在实施例3中所述的，多聚蛋白对低亲和力受体的增加的总亲和力可使用IVIG 疗法潜在的生物学机制，特别是由低亲和力受体Fe γ RIIB、Fe γ RIIIA、CD22和DC-SIGN所 介导的那些机制。对于示例性六聚体蛋白还观察到了对高亲和力IgG受体FcyRI的增 加的总亲和力。FcyRI牵涉在炎性自身免疫性疾病中（Hussein OA等，Immunol Invest 2010,39:699-712)且 FcyRI 定向免疫毒素抑制关节炎（Van Vuuren AJ 等，J. Immunol 2006176:5833-8)。而且微小RNA-127通过靶向Fcy RI抑制肺部炎症（Xie T等，J. Immunol 2012188,2437-44)。此外，在 US 2004/0062763 (Temple Univeristy ;Mosser)中已经提出 了在巨噬细胞上Fey RI的连接以诱导抗炎性细胞因子IL-10的产生。因此，尽管Fey RI 不被认为是IVIG效果的基础，在本发明的上下文中FcyRI的连接也可具有有益效果。
[0095]多聚蛋白的免疫调节性质由在Fc受体结合部分与Fc受体和/或免疫系统的与Fc 部分相互作用的其他受体和组分之间的相互作用产生。根据本发明的第一方面使用的多聚 蛋白不包含另外的免疫调节部分，或当向哺乳动物受试者施用时引起抗原特异性免疫抑 制的抗原部分。与提供免疫抑制剂诸如TNF受体的治疗方法不同，本文所述的多聚蛋白依 赖于不同治疗机制，其可使得它们更广泛地可用于治疗。多聚蛋白都不依赖于抗原特异性 免疫抑制作用，其限制了将其他治疗方法应用于特定疾病。
[0096] "免疫调节部分"是当共价连接到本文所述的多聚蛋白时，或当在缺少所述多聚蛋 白情况下存在时，在健康或患病哺乳动物受试者中具有免疫调节活性的剂。
[0097] "免疫调节活性"是指在受试者中改变免疫应答以增加或减少免疫系统组分诸如 细胞因子或抗体；或增加或减少免疫功能诸如抗原递呈。"调节"部分可以是例如趋化因子 或趋化因子受体、细胞因子或细胞因子受体、Toll样受体（TLR)、急性期蛋白（acute phase protein)、补体成分、免疫受体、CD分子或信号传导分子。已知此类剂在缺少多聚蛋白时 在健康或患病哺乳动物受试者中拥有免疫调节活性。此类剂的实例描述于免疫学教科书 诸如（Abbas 和 Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Saunders, 5thEdn，2005)，且技术人员可在相关文献中发现另外实例。因此，本发明排除了包含任何这些 剂的缀合物或融合蛋白和多聚蛋白。特别地，排除了发现于称为依那西普、alefac印t、阿巴 西普（abatacept)、贝拉西普、阿塞西普、briobacept、利纳西普或阿柏西普的单体Fc融合 蛋白中的免疫调节部分。诸如Fab或scFv的抗体片段也可被认为是"免疫调节部分"。此 类片段可与免疫系统的组分结合，因此具有免疫调节活性。当融合或缀合到聚合体蛋白的 单体单元时，抗体片段可重现完整抗体结构，即Fc和抗原结合区。当共价地连接到多聚蛋 白时，此类剂可以比当孤立地存在时具有更加显著的免疫调节活性。特别地排除了在治疗 性抗体中发现的免疫调节部分，所述治疗性抗体诸如结合TNF α的称为Remicade的抗体。 适合地，除了免疫球蛋白G重链恒定区和任选地铰链区之外，多聚蛋白不包含任何抗体部 分，无论其是否是免疫调节性的。
[0098] 如以上所提到的，多聚蛋白的免疫调节性质由Fc受体结合部分和Fc受体和/或 免疫系统的与Fc部分相互作用的其他受体和组分之间的相互作用引起。Fc受体结合部分 的修饰诸如修饰的糖基化，不被认为是另外的免疫调节部分，而是作为Fc受体结合部分的 组分，所述Fc受体结合部分的修饰修饰与Fc受体、凝集素或其他免疫系统组分的结合。因 此，它们没有从本发明中排除。
[0099] 用于免疫调节部分的适合的实验测试为提供缺少假定的免疫调节部分的多聚蛋 白和包含假定的免疫调节部分的多聚蛋白并在实施例4中所述在ITP小鼠模型中测试任一 个蛋白的效力。如果假定的免疫调节部分拥有免疫调节活性，其可改变应答的参数。例如， 它可改变血小板回收的比率或程度。
[0100] "抗原"是与抗体或TCR特异性结合的分子。与抗体结合的抗原包括所有类别的分 子，且被称为B细胞抗原。分子的示例性类型包括肽类、多肽类、糖蛋白类、多糖类、神经节 苷脂类、脂类、磷脂类、DNA、RNA、其片段、其部分和其组合。TCR仅结合与MHC分子复合的蛋 白的肽片段；其源自的肽配体和天然蛋白被称为T细胞抗原。"表位"是指B细胞或T细胞抗 原的抗原决定簇。当B细胞表位是肽或多肽的情况下，它典型地包含三个或更多个氨基酸， 一般至少5个且更通常至少8个到10个氨基酸。氨基酸可以在多肽的一级结构中是毗邻的 氨基酸残基，或可在折叠蛋白中成为空间并列的。T细胞表位可与MHC I类或MHC II类分 子结合。典型地，MHC I类结合T细胞表位为8个到10个氨基酸长。II类分子结合可为10 个到30个残基长或更长的肽，最佳长度为12个到16个残基。与MHC分子的特定等位形式 结合的肽包含允许肽与等位MHC分子之间互补的相互作用的氨基酸残基。假定的T细胞表 位与MHC分子结合的能力可被预测并实验性地确认（Dimitrov I等，Bioinformatics. 2010 Aug 15 ;26 (16):2066-8)。
[0101] 根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白不包含当向哺乳动物受试者施用时引起 抗原特异性免疫抑制的抗原部分。通过"包含"，我们包括了共价连接到至少一种肽单体单 元的抗原，诸如通过化学缀合或重组融合。典型地，多聚蛋白不包含当向哺乳动物受试者施 用时无论通过引起免疫抑制或免疫刺激的用作抗原的部分。
[0102] 通过"抗原特异性免疫抑制"，我们包括了抗体应答的抑制和/或T细胞应答的抑 制。T细胞应答可通过抗原反应性T细胞的克隆缺失、无反应性或抑制，诸如通过调节性T 细胞的诱导来抑制。T细胞应答还可从较为侵袭性的形式偏离为较不侵袭性的形式，例如从 Thl类型应答到Th2类型应答。
[0103] 对引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分的适当测试为提供缺少抗原部分的多聚 蛋白和包含抗原部分的多聚蛋白并在待治疗自身免疫性疾病或炎性疾病的哺乳动物受试 者中测试任一蛋白。可在相同哺乳动物受试者中顺序地施用缺少或包含抗原的多聚蛋白， 且在用任一蛋白治疗之后，监测了受试者对抗原的免疫应答。可选地，类似受试者的组可用 缺少抗原的多聚蛋白或包含抗原的多聚蛋白治疗。可使用常规技术以鉴定并监测对抗原的 免疫应答，无论是B细胞应答或T细胞应答。如果与包含抗原的多聚蛋白相比，在受试者中 施用缺少抗原的多聚蛋白之后，对抗原的免疫应答的程度或类型没有区别，那么当向哺乳 动物受试者施用时抗原不引起抗原特异性免疫抑制。因此，排除了多聚蛋白的抗原部分引 起的免疫抑制的抗原特异性手段。这不意味着，对特定抗原的免疫应答可以不响应于治疗 降低。对自身免疫性疾病中涉及的自身抗原的免疫应答可响应于治疗降低，然而这可通过 缺少抗原的多聚蛋白以及同样地通过包含抗原的多聚蛋白来实现。可使用类似测试以鉴定 多聚蛋白是否包含向哺乳动物受试者施用时作为抗原的部分。在此类测试中，多聚蛋白施 用的剂量、制剂和特征是相同的以允许有意义的比较。
[0104] 可选地，可在健康哺乳动物受试者中测试多聚蛋白以确定是否存在作为抗原的部 分。此类测试在鉴定抗原特异性免疫刺激中特别有用。适合地，抗原特异性免疫刺激不出 现。此类测试可以在确认多聚蛋白的非免疫原性中是有用的。可以测试并非天然地发现于 哺乳动物受试者中的多聚蛋白的组分诸如接头肽的免疫原性和选择的非免疫原性组分，所 述哺乳动物受试者将被施用该多聚蛋白。在此类测试中，施用了多聚蛋白且，在一段适当的 时间例如两周之后以允许针对假定的抗原发展免疫应答，使用ELISA测试了血液样品以确 定针对假定的抗原的抗体水平。
[0105] 还可使用适合的动物模型来测试引起抗原特异性免疫抑制的抗原部分或当向哺 乳动物受试者施用时用作抗原的部分的存在。例如，可使用在实施例4中所述的ITP小鼠 模型。然后，在施用缺少抗原或假定抗原的多聚蛋白或包含抗原或假定抗原的多聚蛋白之 后，测试了对抗原的免疫应答的程度和类型。
[0106] 适合地，尽管用于根据本发明第一方面使用的多聚蛋白能够与Clq结合，它 不会激活补体的经典途径（Mekhaiel等，2011a)。如在Lewis M等，Mol. Immunol 2008, 45:818-827中所述的并如在实施例3中所进行的，可通过包被多聚蛋白或对照IgG或 单体Fc的孔上的ELISA来评价补体结合和活化。用在碳酸盐缓冲液，pH 9中100 μ 1蛋白 过夜包被96孔板的孔。洗涤之后，室温下用包含0. 5mM MgCl2、2mM CaCl2、0. 05%吐温-20、 〇. I %明胶和〇. 5% BSA的佛罗那缓冲盐水中1/100稀释的100 μ 1人血清孵育板1小时。 洗涤之后，用100 μ 1的1/800稀释的绵羊抗Clq-HRP (Serotec)或1/500稀释的生物素缀合 的抗 C5b-9(Quidel, Santa Clara, CA)孵育板，随后在室温下用 PBS-T, 0· 5% BSA 中 1/1000 稀释的100 μ 1链霉亲和素-HRP(Dako)孵育1小时。认为低于0. 4的吸光度值是阴性的。 在用于Clq结合的典型检测中，当用2 μ g/ml以上、或4 μ g/ml以上或10 μ g/ml以上的多 聚蛋白包被板时取得了 〇. 4以上的吸光度值。在用于指示补体活化的C5b_9沉积的典型检 验中，当用多达2 μ g/ml、多达4 μ g/ml、多达10 μ g/ml、多达20 μ g/ml或多达50 μ g/ml的 多聚蛋白包被板时，没有取得0.4以上的吸光度值。
[0107] 适合地，根据本发明第一方面使用的多聚蛋白能够以足够的总亲和力结合蛋 白G或蛋白A，以允许两个底物的任一个被用作纯化多聚蛋白的捕捉剂。蛋白G结合于 C γ 2-C γ 3结构域间区域中并在实施例中用于纯化六聚体和单体Fc蛋白。与相同区域结合 的其他受体也可结合多聚蛋白，诸如TRIM21 (Mallery DL等，2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 107 (46) : 19985-19990 ;McEwan WA 等 201，BioEssays. 33:803-809)。TRIM21 被认为 在去除病毒和对病毒的免疫性方面是重要的。
[0108] 适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有从约230kD到400kD的分 子量。例如，它可具有约 230kD、240kD、250kD、260kD、270kD、280kD、290kD、300kD、310kD、 320kD、330kD、340kD、350kD、360kD、370kD、380kD、390kD 或 400kD 的分子量。在此大小范围 的聚合体对于哺乳动物细胞比具有更大分子量的分子，像约750kDa的IgM、或像需要表达 并组装两个不同多肽链（轻链和重链）的抗体的复合物蛋白，典型地更容易合成并组装。包 括抗体的具有多个不同多肽链的蛋白更难以在制造中产生同质性。
[0109] 适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有约20nm、诸如从15nm到25nm 或多达30nm的直径。已经证明20nm颗粒比45nm和IOOnm纳米颗粒更容易递送到淋巴系 统，这对于功能和组织渗透可以是重要的（Reddy等，2007)。更小颗粒也更容易通过重组表 达技术制造。
[0110] 作为分子大小和直径的结果，多聚蛋白典型地具有良好程度的组织渗透，其可帮 助其治疗效果（Vollmers和Brandlein, 2006)。与小分子或单体相比，聚合体将天然地 显示出随时间更缓慢的渗透，然而在静脉内（i.v.)或腹腔内（i.P.)施用之后，甚至完整 IgM分子（750kDa)到达小鼠中的植入肿瘤和患者中的原发性肿瘤和转移瘤中（Vollmers 等，1998a, b, Oncol R印5:549-552 ;0ncol R印5:35-40)。通过标准免疫组织化学技术 可证明，当腹腔内注射时五聚体IgM可达到并皮下收缩在动物后背上的移植的肿瘤（所有 Vollmers参考文献，同上）。这显示，大至750kDa的分子能够离开腹膜腔，进入循环并到达 植入的肿瘤。在它们的途中，在分子到达其靶之前，它们不得不穿过淋巴管和血管的若干内 皮障碍，Jain等，2001J. Control. ReleaSe74:7-25。总之，预测根据本发明使用的多聚蛋 白，包括示例的六聚体Fc蛋白，将显示出在更大的IgM(几天）和更小的IgG(几分钟）之 间的中间渗透时间（几小时）。对于像ITP需要生物活性的状况，中间渗透和积聚可比优选 快速渗透的情况下使用抗体作为载体的治疗有优势。
[0111] 适合地，根据本发明的第一方面使用的多聚蛋白具有相对于细胞表面为顺式（每 个Fc在平行于细胞表面的相同平面中且每个Fc的长轴为垂直于细胞表面）的空间定向， 而不是反式的。顺式定向允许在相同细胞上连接多个受体，因为受体结合部分全部紧密地 与相同细胞相对。相反地，在其中Fc在与细胞表面垂直的平面中的反式定向可导致两个细 胞通过相同蛋白交联。以顺式定向，受体结合的生物效果集中于特定细胞，并因此更可能为 富有成效的。
[0112] 根据本发明的第一方面，预期多聚蛋白用于治疗自身免疫性疾病或炎性疾病。"自 身免疫性疾病"包括在其中免疫系统攻击身体自身组织的任何疾病。"炎性疾病"包括通过 特征为破坏性炎症的任何疾病，其可为复发的或慢性的且不涉及正常组织修复。此类疾病 特别地包括在其中先天免疫系统引起可以因为未知原因的炎症的"自身炎性疾病"。自身炎 性紊乱特征为导致此类症状诸如发烧、皮瘆或关节肿胀的炎症强烈发作。这些疾病还带来 淀粉样变性的风险，淀粉样变性是在重要器官中血液蛋白潜在致命聚集。
[0113] 用于治疗的适合自身免疫性疾病或炎性疾病包括那些可用静脉内免疫球蛋 白（IVIG)治疗的疾病。这些可以是当前常规地用IVIG治疗的或已经发现IVIG在 临床上有用的疾病，诸如自身免疫血细胞减少症、格林-巴利综合征、重症肌无力、抗 因子VIII自身免疫性疾病、皮肌炎、血管炎和葡萄膜炎（参见，van der Meche FG 等，Lancet i，406 (1984) ;Sultan Y等，Lancet ii, 765(1984) ;Dalakas MC等，N.Engl. J.Med. 329, 1993(1993) ; Jayne DR 等，Lancet 337,1137(1991) ;LeHoang P 等，Ocul. Immunol. Inf lamm. 8, 4