多潜能成体祖细胞的免疫调节特性及其用图
【专利说明】
[0001] 本申请是国际申请日为2006年11月9日、国际申请号为PCT/US2006/043804、进 入国家阶段的申请号为200680050862. 9、发明名称为"多潜能成体祖细胞的免疫调节特性 及其用途"的PCT申请的分案申请。
[0002] 相关申请的引用
[0003] 本申请是2005年11月9日提交的美国申请系列号11/269,736的部分继续申 请；11/269, 736是2005年6月13日提交的美国申请系列号11/151,689的部分继续申请； 11/151，689是2004年10月11日提交的美国申请系列号10/963,444(放弃）的部分继 续申请；10/963, 444是2002年2月1日提交的美国申请系列号10/048,757的部分继续 申请；10/048, 757是2000年8月4日提交的、2001年2月15日用英语以WO 01/11011公 布的 PCT/US00/21387 的美国国家阶段申请；PCT/US00/21387 根据 35U.S.C. § 119(e)要 求1999年8月5日提交的美国临时申请系列号60/147,324和1999年11月10日提交的 美国临时申请系列号60/164, 650的优先权，是2003年8月11日提交的美国申请系列号 10/467,963的部分继续申请；10/467, 963是2002年2月14日提交的、2002年8月22日用 英语以WO 02/064748公布的PCT/US02/04652的美国国家阶段申请；PCT/US02/04652根据 35U.S.C. § 119(e)要求2001年2月14日提交的美国临时申请系列号60/268,786、2001年 2月15日提交的美国临时申请系列号60/269, 062、2001年8月7日提交的美国临时申请系 列号60/310, 625和2001年10月25日提交的美国临时申请系列号60/343, 836的优先权， 所有这些申请和公开说明书都通过引用整体结合到本文中，且本申请要求所有这些申请和 公开说明书的全部优先权。
技术领域
[0004] 本发明的领域是多潜能成体祖细胞（"MAPCs"）的免疫调节和这些细胞在主要治 疗和辅助治疗中用于调节免疫应答的用途。
【背景技术】
[0005] 包括骨髓移植物在内的器官移植物的治疗应用从一开始就在稳步增加。它已成为 包括但不限于血液疾病、免疫疾病和恶性疾病的多种疾病的重要治疗选择。
[0006] 遗憾的是，移植的治疗用途往往会被移植物所引起的不利免疫应答造成复杂化、 致使无效或妨碍实施。移植疗法所碰到的最为突出的不良反应有（i)宿主抗移植物反应 ("HVG")(有免疫能力的宿主对移植物的排斥）和（ii)移植物抗宿主病（"GVHD")(主 要出现在免疫缺损的（immunocompromised)宿主中的过程，当该宿主被移植物的免疫活性 细胞识别为非己时出现）。
[0007] 当然，可通过完美地匹配供体和宿主避免宿主中的移植排斥。但是，除了自体同 源组织外，只有完全相同的双胞胎可预期是真正同基因的。某个体供体（donor)和另一个 体宿主/接受者（host/recipient)之间的完美匹配事实上是不存在的。因此，自体同源 (autologous)组织的使用是获得完美匹配的唯一另外途径。遗憾的是，宿主组织通常不适 合，或者没有在有需要前进行分离。对移植疗法的需求往往其实是替代宿主中的受损组织。 因此，同基因组织的使用虽然是解决宿主对移植组织的不利应答问题的有效办法，但在实 际应用中通常没有用。
[0008] 如果不可能做到同基因（syngeneic)匹配，那么可通过使异基因的供体和宿主尽 可能紧密地匹配来减轻移植疗法中出现的不利免疫作用。血液和/或组织分型被用来匹配 供体和宿主，以提供最高的治疗成功可能性。但是，即使是异基因（allogeneic)组织的最 紧密匹配也不能防止出现严重HVG，因此移植疗法涉及到免疫抑制和免疫抑制药物的使用， 这在下文中有论述。
[0009] 另一已实行的避免移植疗法中的HVG并发症的方法，是使接受宿主的免疫系统 失效。这已通过使用放射疗法和/或免疫抑制性化学疗法和/或抗体疗法来实现。所 产生的对宿主免疫应答的抑制往往能很有效地帮助移植物（如骨髓）在宿主中建系 (establishment)。但是，免疫切除（immunoablation)或抑制会损及宿主的免疫防御。这 会导致宿主在稍有暴露于传染原后就变得十分易受感染。所产生的感染是移植患者中致病 率或死亡率的主要原因。
[0010] 损及宿主免疫系统还会产生或加剧移植疗法中碰到的另一严重问题一一移植物 抗宿主病（"GVHD")。当供体组织含有能将接受者的MHC蛋白识别为非己的免疫活性细胞 时，会出现GVHD。这会激活T细胞，使T细胞分泌出细胞因子如IL-2(白介素2)、IFN((干 扰素 γ)和TNFa (肿瘤坏死因子α)。这些信号会引发对包括皮肤、胃肠道、肝脏和淋巴器 官在内的接受者靶标的免疫攻击（Ferrara和Deeg，1991) ?GVHD在骨髓移植中特别成问题， 已证实它在骨髓移植中主要是由T淋巴细胞介导（Grebe和Streilein，1976)。实际上，大 约有50%的骨髓移植患者会发展急性GVHD。这些患者中有许多人会死亡（15% -45% )。
[0011] 还存在着作为原发病变和作为其它病变和/或其治疗的继发作用而发生的其它 免疫系统功能异常（dysfunction)、紊乱（disorder)和疾病（disease)。这些包括肿瘤、骨 髓病变、血液病变、自身免疫疾病和一些炎性疾病，这在下文中进一步论述。这些紊乱和疾 病的主要疗法和辅助疗法，如HVG和GVHD的主要疗法和辅助疗法，往往涉及到免疫抑制药 物的使用。所有现行的疗法都有缺点和副作用。
[0012] 免痔抑制药物
[0013] 已作出大量的努力，来开发出治疗这些免疫系统功能异常从而改善或消除它们 的有害作用，而又不引起另外的有害副作用的药物。在这个目标上已获得一定的进步，已 有多种药物被开发出并用于预防和/或治疗这些功能异常。更为有效的这些药物的引入 标志着移植疗法的医学实践的巨大进步；但是，这些药物没有一个是理想的。确实，目前 可供在移植疗法中临床使用的免疫抑制药物没有一个是完全有效的。所有的药物都有严 重的缺点和不利的副作用，这在下文中有概述。有关评论参见Farag(2004)，" Chronic graft-versus-host disease ：where do we go from here ?， " Bone Marrow Transplantation33 :569_577〇
[0014] 主要用于治疗炎症和炎性疾病的皮质类固醇已知具有免疫抑制性，被许多人认为 是HVG和GVHD的最佳主要治疗药。它们至少部分上通过抑制某些涉及T细胞激活和T细 胞依赖性免疫应答的细胞因子基因的表达，来抑制T细胞增殖和T细胞依赖性免疫应答。
[0015] 环胞菌素是HVG和GVHD的免疫抑制和预防的最常用药物之一。它一般具有强烈 免疫抑制性。虽然它能有效地减少移植患者中的不利免疫反应，但它也会极大地削弱免疫 系统，使得患者高度易受感染。因此，患者更容易受病原体暴露所感染，没有什么能力对感 染作出有效的免疫应答。因而即使是温和的病原体也会威胁生命。环胞菌素还会引起多种 其它不想要的副作用。
[0016] 甲氨喋呤单独或与其它药物组合在一起，也广泛用于HVG和GVHD的预防和治疗。 研宄已证实，就算它能有效，它显然也不比环胞菌素有效。和环胞菌素一样，甲氨喋呤也会 引起多种副作用，其中一些副作用对患者健康可能有害。
[0017] FK-506是大环内酯样化合物。与环胞菌素相似，它也衍自真菌来源。环胞菌素 和FK-506的免疫抑制作用相似。它们通过与它们各自的细胞质受体蛋白（即亲环蛋白和 FK-结合蛋白）形成异型二聚复合物来阻断T细胞激活的早期事件。这然后会抑制钙调磷 酸酶的磷酸酶活性，从而最终抑制核调节蛋白和T细胞激活基因的表达。
[0018] 已被用于免疫抑制的其它药物包括抗胸腺细胞球蛋白、硫唑嘌呤和环磷酰胺。它 们被证明并不有利。雷帕霉素也已被用于阻断T细胞激活的免疫应答，它是另一种能干 扰T细胞对IL-2的应答的大环内酯样化合物。RS-61443这种霉酚酸衍生物已被发现能抑 制实验动物中的同种异体移植物排斥。咪唑立宾是一种咪唑核苷，能以类似于硫唑嘌呤和 RS-61443的方式阻断嘌呤生物合成途径和抑制促细胞分裂原刺激的T细胞和B细胞增殖。 脱氧精胍菌素是精胍菌素的合成类似物，已发现它能在临床前移植模型中发挥免疫抑制特 性。抗代谢物布喹那钠是二氢乳清酸脱氢酶的抑制剂，能通过对嘧啶合成的抑制阻断尿苷 和胞苷两种核苷的形成。黄连素及其药理上可耐受的（pharmacologically tolerable)盐 已被用作免疫抑制剂，用来治疗诸如风湿病的自身免疫疾病，用来治疗过敏症和用来预防 移植排斥。据报道，黄连素能抑制B细胞抗体产生和通常能抑制体液免疫应答，但不会影响 T细胞繁殖。参见日本专利07-316051和美国专利6, 245, 781。
[0019] 这些免疫抑制药物无论是单独使用还是与其它药剂组合使用，没有一个是完全有 效的。它们全部都通常会让患者仍易发生HVG和GVHD，削弱患者抵抗感染的能力。这使得 他们更易受感染，在发生感染时更不能抗击感染。此外，所有这些药物都会引起严重副作 用，包括例如胃肠毒性、肾脏毒性、高血压、骨髓抑制、肝脏毒性、高血压和牙龈肥大等等。它 们没有一个证明是完全可接受或有效的治疗药。总之，鉴于这些缺点，对于不利免疫系统功 能异常和/或应答如HVG和GVHD，目前还没有完全令人满意的基于药物的治疗。
[0020] -直认为，可以开发出没有这些缺点的更具特异性的免疫抑制类型。例如，能 特异性抑制或消除同种异体反应性（alloreactive)T细胞的药剂，将能有效抵抗HVG和 GVHD (至少对于异基因移植物），而又不会出现全身性攻击和损及免疫系统的药剂所会出 现的不利副作用。但是，至今还没有开发出这种药剂。
[0021] 局限干细胞（restricted stem cell)在移植中的用涂
[0022] 干细胞代替免疫抑制剂来使用或与免疫抑制剂一起来使用，最近受到了关注。在 这个领域已有一些鼓舞人心的观察结果。近年来已分离和表征了多种干细胞。它们既有分 化潜力高度局限、在培养物中生长的能力有限的干细胞，也有分化潜力明显不受局限、在培 养物中生长的能力无限的干细胞。前者通常更容易衍生，可从多种成体组织获得。后者须衍 自生殖细胞和胚胎，被称为胚胎干（"ES"）细胞、胚胎生殖（"EG"）细胞和生殖细胞。胚 胎干（"ES"）细胞具有无限的自我更新能力，能分化成所有的组织类型。ES细胞衍自胚泡 的内细胞团。胚胎生殖（"EG"）细胞衍自着床后胚胎（post-implantation embryo)的原 始生殖细胞。衍自成体组织的干细胞其价值有限，因为它们具有免疫原性，分化潜力有限和 在培养中繁殖的能力有限。ES、EG和生殖细胞没有这些缺点，但它们有在异基因宿主中形 成畸胎瘤的明显倾向，这引起了对它们在医学治疗中的用途的高度关注。因此，尽管它们的 广泛分化潜力是有利的，但对它们在临床应用中的有用性存在着悲观看法。衍自胚胎的干 细胞还遭到伦理争议，这些争议会妨碍它们在治疗疾病上的使用。
[0023] -些试图寻找ES、EG和生殖细胞的替代物的努力，投向了衍自成体组织的细胞。 虽然成体干细胞在哺乳动物的大多数组织中都已鉴定出，但它们的分化潜力有局限，比ES、 EG和生殖细胞的分化潜力要窄得多。的确，许多这种细胞只能产生一种或少数几种分化细 胞类型，且许多其它细胞局限于单一胚胎谱系。
[0024] 例如，造血干细胞只能分化形成造血谱系的细胞，神经干细胞只分化成神经外胚 层起源的细胞，间充质干细胞（"MSCs"）则限于间充质起源的细胞。出于上述的与ES、EG 和生殖细胞有关的限制、风险和争议的原因，很大一部分的涉及干细胞在移植疗法中的用 途的工作都采用MSCs。最近几年的结果似乎表明，MSCs的同种异体移植物（allograft)并 不产生HVG免疫反应，这种反应是当其它组织在异基因个体之间移植时总能看到的一种应 答。此外，结果提示MSCs至少在一些情况下会削弱淋巴细胞免疫应答。
[0025] 虽然这些结果直接提示到，MSCs可能可用于减少通常会伴随异基因移植出现的 HVG和/或GVHD，但所观察到的MSCs的免疫抑制作用是高度剂量依赖性的，且需要相对较 高的剂量才观察到免疫抑制作用。事实上，在体外混合淋巴细胞测定中，淋巴细胞增殖的 下降只有在MSCs与淋巴细胞之比为I : 10或以上时才"明显"。此外，随着MSCs的剂量 下降，所观察到的抑制作用也下降和变得不可观察，在低于1 : 100的比例下MSCs的存 在实际上似乎刺激T细胞的增殖。在促细胞分裂原刺激的淋巴细胞增殖测定中也观察到 相同的剂量效应。有关评论参见 Ryan et al. (2005)" Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection(间充质干细胞能避免异基因排斥），"T. Inflammation 2:8; Le Blanc(2003)''Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells(胎儿和成体间充质干细胞的免疫调节作用），"Cytotherapy 5(6) :485-489和 Jorgensen et al. (2003)''Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy (X 程化间充质干细胞用于免疫疗法），"Gene Therapy 10:928-931。另外的结果在下文中 总结。
[0026] 例如，Bartholomew和他的同事发现，狒狒MSCs不刺激异基因淋巴细胞在体外增 殖，且在体外混合淋巴细胞测定中MSCs减少了促细胞分裂原刺激的淋巴细胞的增殖超过 50%。他们进一步证实，MSCs的体内给予延长了皮肤移植物存活期（相对于对照）。体外 结果和体内结果要求高剂量的MSCs:对于体外结果要求其与淋巴细胞之比为1 : 1。就 实际而言，为在人体内接近这种比例所要求的MSCs的量可能高得难以达到。这会限制 MSCs 的应用。参见 Bartholomew et al. (2002) :"Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo (间充 质干细胞能在体外抑制淋巴细胞增殖和在体内延长皮肤移植物存活期），"Experimental Hematology30 :42-48〇
[0027] Maitra和他的同事研宄了人MSCs和异基因人脐带血细胞共输注到亚致死福射的 NOD-SCID小鼠后，前者对后者的移入（engraftment)的作用。他们发现，在体外增殖测定 中，人MSCs促进了移入，不刺激异基因 T细胞。他们还发现，人MSCs抑制了促细胞分裂原 对异基因人T细胞的体外激活。这些作用是剂量依赖性的，需要相对较高的比例才能抑制。 (Maitra et al. (2004)Bone Marrow Transplantation33 :597-604)〇
[0028] 最近，Le Blanc他的同事报道说，通过给予"第三方单倍同一性（third party haploidentical) "MSCs，成功地治疗了一名患有通常致命的IV级急性GVHD的患者。该患 者是患有处于第三好转期（third remission)的急性淋巴母细胞性白血病的9岁男孩。最 初，该患者用放射和环磷酰胺进行治疗，然后给予在HLA-A、HLA-B和HLA-DRbetal基因座处 与他自己的细胞完全相同的血细胞。这些细胞获自不相关的雌性供体。尽管进行了积极的 治疗，包括给予了多种免疫抑制剂，但到移植后70天时，患者还是发展了 IV级急性GVHD。 他常常遭受侵入性细菌、病毒和真菌感染的折磨。
[0029] 在这些明显可怕的情况下，尝试了别种血液干细胞移植。从患者的母亲分离了单 倍同一性MSCs，在体外扩增（expand)三个星期。收获细胞，以2x IO6个细胞/公斤静脉 内给予患者。没有与MSCs有关的毒性的迹象，也没有很大的副作用。在移植后几天内许 多症状消退，但残余疾病仍明显。用相同的方法再静脉内注射几次MSCs后，患者的症状和 GVHD完全消退。患者在摆脱疾病后一年仍保持无病。根据作者的经验，这个患者在患上这 么严重的GVHD仍能存活方面是不平常的。Le Blanc等报道的结果既有希望又鼓舞人心， 对开发出利用干细胞的有效疗法来说应该是个激励。Le Blanc et al. (2004) "Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells (用第三方单倍同一"性间充质干细胞治疗严重急性移植物抗宿主 病），"Lancet363 ： 1439-41〇
[0030] 尽管如此，这些结果，包括Le Blanc和他的同事的结果，揭示了 MSCs的潜在缺点。 细胞需要与传统的免疫抑制模式（modality) -起给予，而这会继续产生有害免疫应答。 MSCs的剂量要求需要非常高才能有效，这会造成成本更高、给药更困难、毒性和其它副作用 的风险更大以及其它缺点。
[0031] 鉴于目前的基于干细胞的移植相关疗法的这些限制，显然对这样的祖细胞有强 烈的需求，这种祖细胞能用于所有的一一或者至少大部分的一一接受宿主，而又不需要宿 主-接受者单倍型匹配。此外，还对这样的细胞有需求，这种细胞具有较大的"比活性"，使 得它们在较低剂量下是治疗上有效的，且它们的给予不会造成在使用MSCs获得有利结果 时要求的高剂量模式所伴随产生的问题。还有对这样的细胞也有需求，这种细胞具有几乎 无限的分化潜力，能形成在目的生物中所出现的细胞。
[0032] 因此，一直对这样的细胞有需求，这种细胞具有ES、EG和生殖细胞的自我更新和 分化能力，但没有免疫原性；当同种移植或异种移植到宿主时不会形成畸胎瘤；不会造成 ES、EG和生殖细胞所伴随出现的其它安全问题；保持了 ES、EG和生殖细胞的的其它优点；容 易从易得来源如胎盘、脐带、脐带血、血液和骨髓分离；能长时间安全储藏；能容易获得，对 志愿者、供者或患者没有风险，无须其他人给予同意；不会带来涉及到其获取和与ES、EG和 生殖细胞一起运用的技术上和运销上的困难。
[0033] 最近，有一类本文称之为多潜能成体祖细胞（"MPCs")的细胞得到了分离和表 征（参见例如美国专利，该专利7, 015, 037通过引用整体结合到本文中）。（"MAPCs"也可 称为"MASCs"）。这些细胞能提供ES、EG和生殖细胞的许多优点，又没有它们的许多缺点。 例如，MAPCs能够进行无限期培养而又不失去它们的分化潜力。它们显示出随同NOD-SCID 小鼠的多个发育谱系的有效、长期的移入和分化，在移入和分化的同时没有畸胎瘤形成 (在 ES、EG 和生殖细胞中常见）的迹象（Reyes，M.和 C. Μ· Verfaillie (2001) Ann N Y Acad Sci. 938 :231-5)。
【发明内容】
[0034] 因此，在本发明的一些实施方案中，本发明提供这样的细胞，它们（i)不是胚胎 干细胞、不是胚胎生殖细胞和不是生殖细胞；（ii)能分化成内胚层、外胚层和中胚层胚胎 谱系中的至少两个谱系的每一个的至少一种细胞类型；（iii)在引入到非同基因受试者 (subject)中时不会引起有害免疫应答；和（iv)在引入到受试者中时能调节免疫应答。在 这个方面的某些实施方案中，本发明提供这样的细胞，它们除去如前所述外，还具有免疫抑 制性。此外，本发明的各个实施方案提供这样的细胞，它们是具有免疫调节特性的前述细 胞，该免疫调节特性可用于治疗如排除、防止、改善、减轻、降低、最小化、消除和/或整治宿 主中的有害免疫应答和/或过程。在本发明的一些实施方案中，所述细胞为此作为主要治 疗模式单独使用或者与其它治疗剂和模式一起使用。在本发明的一些实施方案中，所述细 胞在辅助治疗模式中使用，在该模式中它们是作为唯一治疗剂使用或者与其它治疗剂一起 使用。在本发明的一些实施方案中，所述细胞在一种或多种主要治疗模式中和在一种或多 种辅助治疗模式中，都是单独地或者与其它治疗剂或模式一起使用。
[0035] 本发明的细胞在本文中将作更详细的描述，在本文中一般称为"多潜能成体祖细 胞"，其英文首字母缩略词为"MAPC"（单数）和"MPCs"(复数）。应认识到，这些细胞不 是ES、不是EG，也不是生殖细胞，它们具有分化成三种原始胚层谱系（外胚层、中胚层和内 胚层）中的至少两种的细胞类型、例如分化成所有三种原始谱系的细胞的能力。
[0036] 例如，MAPCs能形成以下细胞及其谱系的其它细胞：内脏（splanchnic)中胚层 细胞、肌肉细胞、骨细胞、软骨细胞、内分泌细胞、外分泌细胞、内皮细胞、生发细胞、生齿细 胞、内脏（visceral)中胚层细胞、造血细胞、基质细胞、骨髓基质细胞、神经元细胞、神经外 胚层细胞、上皮细胞、眼细胞、胰细胞和肝细胞样细胞等等。由MAPCs形成的细胞有造骨细 胞、成软骨细胞、脂肪细胞、骨豁肌细胞（skeletal muscle cell)、骨豁肌细胞（skeletal myocyte)、胆上皮细胞、胰腺泡细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、心肌细胞（cardiac muscle cell)、心肌细胞（cardiomyocyte)、骨细胞、血管形成细胞、少突神经胶质细胞、神经元（包 括5-羟色胺能、GABA能、多巴胺能神经元）、神经胶质细胞、小胶质细胞