与rex-l、rox_l和sox-2 -起的存在，是与MAPCs培养物中的大多数原始细胞的 存在有关联的。
[0329] 培养MAPCs的方法是本领域公知的。（参见例如美国专利7, 015, 037,其关于培养 MAPCs的方法通过引用结合到本文中）。培养MPCs的密度可在约100个细胞/cm2或约150 个细胞/cm2至约10, 000个细胞/cm 2之间变动，包括约200个细胞/cm2至约1500个细胞 /cm2至约2000个细胞/cm2。对于不同的物种，密度可不同。另外，最佳密度可随培养条件 和细胞来源而变。为给定的一组培养条件和细胞确定最佳密度是技术人员技能所及的。
[0330] 还有，在培养中MAPCs的分离、生长和分化过程中的任何时间，都可使用小于约 10%、包括约3-5%的有效大气氧浓度。
[0331] 本发明另外通过以下示例性非限制性实施例进行描述。
[0332] 实施例
[0333] 实施例1 :人MAPCs (来自骨髓单核细朐）
[0334] 骨髓单核细胞获自80个以上的健康人志愿者后髂棘的骨髓吸出物。从每个受试 者获得10-100立方厘米的骨髓。单核细胞（"MNCs"）是通过将骨髓以Fic0Il-Paque密度 梯度（Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)进行离心获得。将骨髓MNCs与CD45和血型糖 蛋白 A 微珠 （Miltenyi Biotec，Sunnyvale，CA) -起温育 15 分钟，将样品放在 SuperMACS 磁体前来除去⑶45+GlyA+细胞。洗脱的细胞为99. 5%⑶45 _GlyA_。
[0335] CD45+GlyA+细胞的耗减导致回收到CD45 -GlyA-细胞，其占总骨髓单核细胞的大约 0. 05-0. 10%。选出不表达共同白细胞抗原⑶45或红细胞系前体标志血型糖蛋白A(GlyA) 的细胞。⑶45TlyAl田胞占骨髓单核细胞的1/103。将⑶45TlyAl田胞接种在包被有纤连 蛋白的各孔中，该纤连蛋白是在2% ?0536?、？06?-88、地塞米松、胰岛素、亚油酸和抗坏血 酸中。7-21天后，有小簇的黏附细胞发展。使用有限稀释测定得知，产生这些粘附细胞簇的 细胞的频数是l/5x IO3个⑶45 TlyAl田胞。当出现细胞集落时（约10 3个细胞），通过胰 蛋白酶消化回收细胞，并每隔3-5天在相同的培养条件下以1 : 4稀释度再接种。细胞密 度维持在2-8x IO3个细胞/cm 2之间。
[0336] 实施例2 :小鼠 MAPCs
[0337] 所有组织均按照明尼苏达州大学IA⑶C的指导方针获得。BM单核细胞（BMMNC) 通过Ficoll Hypaque分离来获得。BM获自5-6周龄R0SA26小鼠或C57/BL6小鼠。或者， 肌肉和大脑组织获自3天龄129小鼠。将前后肢近端的肌肉切除并彻底切碎。将组织用 0· 2%胶原酶（Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)在 37°C下处理 1 小时，然后用 0· 1%胰 蛋白酶（Invitrogen，Grand Island，NY)处理45分钟。然后将细胞剧烈研磨，通过70μηι 滤器。收集细胞悬浮液，在1600rpm下离心10分钟。将大脑组织解剖并彻底切碎。将细胞 通过在37°C下（与0. 1 %胰蛋白酶和0. 1% DNA酶Sigma)温育30分钟使它们解离。然后 将细胞剧烈研磨，通过70 μ m滤器。收集细胞悬浮液，在1600rpm下离心10分钟。
[0338] 将BMMNC或者肌肉或大脑悬浮液以lx IOVcm2接种在扩增培养基中[2% FCS于 低葡萄糖Dulbecco's极限必需培养基（LG-DMEM)中，血小板衍生生长因子（PDGF)、表皮生 长因子（EGF)和白血病抑制因子（LIF)各10ng/ml]，并维持在5x 103/Cm2。3-4个星期后， 通过胰蛋白酶/EDTA回收细胞，用微磁珠去掉⑶45+GlyA+细胞。所得的⑶45 _GlyA_细胞以 10个细胞/孔再接种在包被有FN的96孔板中，扩增到0. 5-1. 5x 103/cm2的细胞密度。无 论MAPCs衍自何种组织，它们的扩增潜力都相似。
[0339] 实施例3 :大鼠 MAPCs
[0340] 从 Sprague Dawley、Lewis 或 Wistar 大鼠获得 BM 和 MNCs，在与对 mMAPCs 所述的 条件类似的条件下进行接种。
[0341] 卖施例4 :小鼠和大鼠 MAPCs的可克降件
[0342] 为证明分化的细胞是单细胞衍生的且MAPCs的确是"克隆的"多潜能细胞，制备出 其中MPCs已转导有反转录病毒载体的培养物。发现未分化的MPCs和它们的后代在基因 组中的相同位点有反转录病毒插入。
[0343] 用两种独立衍生的R0SA26MAPCs、两种C57BL/6MAPCS和一种扩增了 40至大于 90H)的rMPC群，以及用eGFP转导的"克隆"小鼠和"克隆" rMPCs，进行了研宄。在eGFP 转导和未转导细胞之间未见差异。值得注意的是，eGFP表达在分化的MAPCs中持续出现。
[0344] 具体的说，与EGF、PDGF-BB和LIF -起在FN上培养三个星期的小鼠和大鼠 BMMNCs，在连续两天被转导上eGFP癌反转录病毒载体。然后去掉CD45+和GlyA +细胞，将细 胞以10个细胞/孔进行亚培养。将eGFP转导的大鼠 BMMNCs扩增85H)。或者，使用扩增了 80H)的小鼠 MAPCs。未分化MAPCs的亚培养物，是通过将100个来自维持了 75H)的培养物 的MPCs进行接种并将它们再扩增到大于5x IO6个细胞来产生。将扩增的MPCs在体外 诱导分化成内皮、神经外胚层和内胚层。用对这些细胞类型有特异性的抗体进行染色，来证 实谱系分化。
[0345] 实施例5 :人MAPCs没有免痔原件
[0346] 已证实间充质干细胞具有低体外免疫原性和能够在异基因接受者之间发生 移入（Di Nicola，M. et al. (2002)Blood99 :3838-3843 ；Jorgensen, C. et al. (2002) Gene TherapylO :928-931 ;Le Blanc, K. et al. (2003)Scandinavian Tournal of Tmmunol 〇gv57:11-20 ;McIntosh，K. et al. (2000)Graft 6:324-328 ；Tse, ff. et al. (2003) Transplantation75 :389-397)〇
[0347] 图3表明，人MAPCs显示出低体外免疫原性，当加入到强效的T细胞MLRs中时是免 疫抑制性的（Tse，W.et al. (2003))。在所有试验过的供体细胞和应答细胞对（donor and responder pairs)，结果均一致。
[0348] 应答细胞和刺激细胞是为这些实验而制备，MLRs是按照Tse，W. et al. (2003)描 述的程序来进行。
[0349] 实施例6 :MAPCs能调节T细朐应答
[0350] MPCs调节（在这里的情况下是抑制）免疫应答性的能力通过T细胞增殖测定来 证明，该测定例如可如下来进行。
[0351] 应答T细胞的制备
[0352] 应答细胞从Lewis大鼠的淋巴结制备。从大鼠手术切除淋巴结，立即放入60x 15mm平板中的3-5ml培养基（完全RPMI或完全DMEM)中。将淋巴结分散通过尼龙滤器（使 用注射器的手动柱塞）。将分散液装入50ml试管中，在l，250rpm下离心8分钟。将所得的 上清液（培养基）弃去。将沉淀（含有细胞）重悬于新鲜培养基（完全RPMI或完全DMEM) 中。将细胞洗涤三次，然后重悬于新鲜培养基中。重悬细胞密度通过计数已知体积中的细 胞数来确定。将细胞保持在冰上。使用前，将细胞以1.25x IO6个细胞/ml的密度重悬于 培养基（完全RPMI或完全DMEM)中。
[0353] MAPCs 的制备
[0354] 从Lewis或从Sprague-Dawley大鼠制备MAPCs，然后如上所述冰冻。将它们解冻， 然后以300(^&(1进行辐射。将辐射过的细胞以0.知106个细胞>1、0.8110 6个细胞>1 和I. 6x IO6个细胞/ml的密度重悬于培养基（完全RPMI或完全DMEM)中。
[0355] 伴刀豆球蛋白A的制备
[0356] 伴刀豆球蛋白A("ConA"）用来激活T细胞。将ConA溶于PBS(完全RPMI或完全 DMEM)中至最终浓度为0(只含PBS)、10、30和100μg/ml。
[0357] 测定程序
[0358] 每个数据点基于至少三个测定值。
[0359] 将20 μ 1的每种ConA溶液加到微量滴定板（96孔，平底）的各孔中，然后加入 80 μ 1/孔的应答细胞和100 μ 1/孔的MAPCs。将各板在加湿培养箱中在37°C、5% 0)2下温 育4-5天。在培养的最后14-18小时中，给各板脉冲输送IyCi/孔的3H-胸苷。之后，用 Tomtec收获机将细胞自动收获在玻璃纤维滤器上。胸苷摄取是在微板闪烁计数器中进行定 量。结果以每分钟平均计数（CPM)+/-SD表示。
[0360] 各孔中生长培养基中的ConA最终浓度为0、1、3. 16和10 μ g/ml。MPCs在各孔中 的存在量为〇、〇. 4、0. 8和I. 6x IO5个细胞/孔。
[0361] 结果在图4中显示，以下进行讨论。
[0362] 结果
[0363] 递增量的ConA导致了 T细胞增殖的剂量依赖性刺激（图4,仅LN)。Lewis MPCs 抑制了 ConA刺激的T细胞的增殖。该抑制取决于MPCs的剂量。最大抑制（50%)出现 在这些实验中所用的最高MAPCs剂量下，此时ConA剂量为低到中等。这些结果图示于图4 中，表明MAPCs能抑制被激活的T细胞的增殖。
[0364] 实施例7 :MAPCs能抑制被刺激的T细朐的增葙
[0365] MAPCs抑制同基因的和非匹配的（异基因的）T细胞增殖应答的能力，通过混合淋 巴细胞反应的结果进行证明。以下实施例证实MAPCs对来自Lewis大鼠的、受来自DA大鼠 的被辐射脾细胞刺激的T细胞的抑制作用。来自同基因的Lewis大鼠和非匹配的（异基因 的）Sprague-Dawley大鼠的MPCs均以剂量依赖性方式抑制T细胞应答。实验如下进行。
[0366] 应答T细胞的制备
[0367] 应答细胞如上所述从Lewis大鼠的淋巴结制备。
[0368] 被辐射的脾脏刺激细胞
[0369] 从DA大鼠手术切除脾脏。然后基本上如以上关于从Lewis大鼠淋巴结分离应答 细胞的描述，从脾脏分离脾细胞。将分离的脾细胞以ISOOrad进行辐照。然后将细胞重悬 至4x IOfVml，保持在冰上备用。MAPCs的制备
[0370] 如上所述从Lewis大鼠制备同基因的MAPCs。以同样方式从Sprague-Dawley大鼠 制备非匹配的（异基因的）MAPCs。将 Lewis MAPCs 和 Sprague-Dawley MAPCs 均以 3000rad 进行辐射，然后以 〇·〇3χ l〇7ml、0.06x 106/ml、0.125x 106/ml、0.25x 106/ml、0.5x IO6/ ml、lx 106/ml和2x l〇7ml的密度重悬在完全RPMI培养基中。
[0371] 测定程序
[0372] 给96孔微量滴定板的各孔装入：100 μ 1的MAPCs (在上述各稀释度下）或100 μ 1 的培养基；50 μ 1的刺激细胞原液或对照；各50 μ 1的应答细胞原夜或对照；和使总体积等 于200 μ 1/孔的最终体积所需的培养基（完全RPMI或完全DMEM)。所有测定都是使用96 孔平底微量滴定板。
[0373] 每个数据点基于至少三个测定值。
[0374] 将各板在加湿培养箱中在37°C、5% CO2下温育4-5天。在培养的最后14-18小时 中，给各板脉冲输送1 μ Ci/孔的3H-胸苷。之后，用Tomtec收获机将细胞自动收获在玻璃纤 维滤器上。胸苷摄取是在微板闪烁计数器中进行定量。结果以每分钟平均计数（CPM)+/_SD 表不。结果
[0375] 衍自Lewis大鼠淋巴结的T细胞（应答细胞）暴露于由来自DA大鼠的被福射脾 细胞组成的刺激细胞，导致了应答细胞的非常强烈的增殖应答，如图5A和5B中的"无 MAPC" 所示。
[0376] 递增剂量的同基因 Lewis MAPCs (图5A)和非匹配（异基因）第三方 Sprague-Dawley MAPCs (图5B)的加入，导致了 T细胞激活受到显著和剂量依赖性的抑制。 最大抑制水平约为80%。即使是在最低剂量的MAPCs下，也有40-50%抑制。
[0377] 如图5A和5B所示，对照中没有3H-胸苷掺入，表明掺入只因为被激活的应答T细 胞的增殖而发生。
[0378] 总之，结果表明，同基因的和第三方的（异基因的）MAPCs即使是在来自非匹配大 鼠的强效激活性脾细胞存在下，也能抑制T细胞增殖。在这些实验中，当反应中的刺激细 胞、应答细胞和MAPCs各自数量相近（200, 000个细胞）时抑制达到最高值。在这些条件下， 有大约80%抑制。在反应中MAPCs与其它细胞之比极低的情况下，也有很大的抑制。例如 在I. 5% MAPCs下有50%抑制（MAPCs 3, 000个，而每种其它细胞200, 000个）。结果不但 证明MAPCs具有很强的免疫抑制作用，而且还证明相对较少量的MAPCs甚至在非常强效的 T细胞激活剂存在下也足以抑制相对较大量的有活性的T细胞。
[0379] 实施例8 :MAPCs是安全的
[0380] 静脉内注射大量细胞的主要直接危险是细胞团块在肺中的积累，这会导致呼吸窘 迫和可能导致心搏停止。为在这点上证实MAPCs的安全性，我们测量了 MAPCs的静脉内注 射对Buffalo大鼠的呼吸频率的影响。
[0381] 如上所述从Lewis大鼠制备MAPCs ( "Lewis MAPCs")。还如上所述从Lewis大鼠 制备脾细胞用作对照（"Lewis脾细胞"）。
[0382] 每组有一只雌性Lewis大鼠充当脾细胞供体（实验条件）。每种有两只Buffalo 大鼠用作接受者（实验条件）。
[0383] 将细胞如下所示给予大鼠。数据图示于图6中。各数据点与以下编号的各个大鼠 的对应关系在图6右边的竖排图例中列举。所有大鼠均为Buffalo大鼠。
[0384] 1. 1，I. 210x IO6Lewis MAPC 每鼠
[0385] 2. 1，2. 25x IO6Lewis MAPC 每鼠
[0386] 3. 1，3. 22. 5x IO6Lewis MAPC 每鼠
[0387] 4. 1，4. 21. 2x IO6Lewis MAPC 每鼠
[0388] 5. 1，5. 2IOx IO6Lewis 脾细胞每鼠
[0389] 6. 1，6. 25x IO6Lewis 脾细胞每鼠
[0390] 7. 1，7. 22. 5x IO6Lewis 脾细胞每鼠
[0391] 8. 1，8. 21. 2x IO6Lewis 脾细胞每鼠
[0392] 如上所述，各大鼠注射以I. 2、2. 5、5或10*106个MAPCs或者I. 2、2. 5、5或10*106个脾细胞。这对应于5、10、25或50*106个细胞/kg。呼吸频率在静脉内注射MAPCs或脾细 胞前（〇分钟）和1、5和10分钟后测量。呼吸频率是测量20秒钟，然后将计数乘以3得到 每分钟呼吸频率。正常大鼠呼吸频率在每分钟60-140次之间。
[0393] 结果
[0394] 所有大鼠在静脉内细胞注射后均存活。没有观察到呼吸频率在不同条件下有显著 差异或趋向。结果在图6中显示。初始呼吸速率（0分钟）稍低，因为各大鼠在注射细胞前 进行了麻醉。在每个时间点，各测量值簇集在一起，没有任何明显趋向。
[0395] 总之，静脉内注射5_50*106个MAPCs/kg在任何条件下在任何大鼠中都没有引起 呼吸频率或死亡率的变化。结果证实MAPCs的静脉内注射即使在高剂量下也是安全的。
[0396] 实施例9 :MAPC的免痔标志表汰
[0397] 通过测定MAPCs中的免疫调节标志，如Barry et al. (2005)所描述的标志，来进 一步表征MAPCs的免疫调节特性。这些标志用标志特异性抗体和FACS分析来测定。
[0398] 如上所述分离大鼠骨髓MAPCs并进行培养和收获。对于FACS分析，将细胞以l-2x IO8个细胞/ml悬浮于PBS中。将200 μ 1的细胞悬浮液加到一系列的12x 75聚丙烯管中 的每一个管。将标记特异性抗体或对照加到每个管中，然后将它们在室温下温育15-20分 钟。温育结束时，向每个管加入2ml PBS，然后在400x g下离心5分钟。弃去上清液，将每 个管中的细胞重悬于100 μ I PBS。将荧光标记的第二抗体以适当的量加到每个管中，将各 管再次在室温下温育15-20分钟，这回是在暗处温育。然后向每个管加入2ml PBS，再次在 400x g下离心5分钟。弃去上清液，将每个管中的细胞重悬于200 μ I PBS，然后保持在冰 上以待FACS分析。
[0399] 结果在表1中列出。如表中所示，大鼠 MAPCs :(a)对I类MHCXDllc、⑶29和⑶90 阳性，（b)对 II 类 MHC、CDllb、CD31、CD40、CD45、CD54、CD80、CD86、CD 95 和 CD106 阴性。 由对照细胞（包括大鼠外周血细胞和内皮细胞）的阳性染色证实了每种抗体的阴性结果。 这些标志表达模式（包括在MPCs中检测到的标志和没有检测到的标志）完全符合MPCs 的低免疫调节截面图（cross-section) 〇
[0400] 表1-MAPCs中免痔细朐相关标志的检测
[0401]
【主权项】
1. 一种细胞在制备对有遭受涉及不期望的T-细胞活化和/或增殖的免疫功能异常危 险或者遭受了涉及不期望的T-细胞活化和/或增殖的免疫功能异常的受试者进行辅助治 疗的药物中的用途，其中所述细胞：不是胚胎干细胞、胚胎生殖细胞或生殖细胞；能分化成 内胚层、外胚层和中胚层胚胎谱系中的至少两个谱系的每一个的至少一种细胞类型；不会 在受试者中引起有害免疫应答；能有效治疗受试者的涉及不期望的T-细胞活化和/或增殖 的免疫功能异常；并通过有效的途径和以有效量辅助于一种或多种其它的给予受试者以治 疗同样的事情、治疗别的事情或两种情况都治疗的治疗法来进行给予，其中所述细胞对端 粒酶和oct-3/4阳性。
2. 权利要求1的用途，其中所述细胞能分化成内胚层、外胚层和中胚层胚胎谱系中的 每一个谱系的至少一种细胞类型。
3. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞在培养中进行了至少10-40次细胞倍增再给 予受试者。
4. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞与受试者异基因。
5. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞是辅助于在给予所述细胞之前、同时或之后给 予的另一治疗法来给予受试者。
6. 权利要求1或2的用途，其中所述细胞以一个或多个包含10 4-108个所述细胞/公 斤受试者质量的剂量给予受试者。
7. 权利要求1或2的用途，其中所述受试者将接受或已接受移植物，将会有发展宿主抗 移植物反应或移植物抗宿主病的危险或者已发展宿主抗移植物反应或移植物抗宿主病，且 所述细胞是辅助于该移植物来给予。
8. 权利要求7的用途，其中所述移植物是器官、骨髓或血液移植物，所述受试者有发展 宿主抗移植物反应的危险或者已经发展宿主抗移植物反应，且所述细胞是辅助于该移植物 来给予以治疗宿主抗移植物反应。
9. 权利要求7的用途，其中所述受试者正在接受或将要接受放射疗法或化学疗法或放 射疗法和化学疗法的组合，使得受试者的免疫系统会被削弱，用所述细胞进行的治疗是辅 助于放射疗法或化学疗法或两者的组合。
10. 权利要求7的用途，其中所述细胞给予免疫系统缺损的受试者。
【专利摘要】描述了不是胚胎干细胞、不是胚胎生殖细胞和不是生殖细胞的分离细胞。这些细胞能分化成内胚层、外胚层和中胚层胚胎谱系中的至少两个谱系的每一个的至少一种细胞类型。这些细胞不会引起有害的免疫应答。这些细胞能调节免疫应答。举例说，这些细胞能抑制宿主中的由异基因细胞、组织和器官引起的免疫应答。描述了使用这些细胞本身或者辅助地治疗受试者的方法。例如，这些细胞可在移植疗法中辅助地用于免疫抑制。还描述了获得这些细胞的方法和使用它们的组合物。
【IPC分类】A61K35-28, A61K35-44, A61K35-48, A61K35-26, A61P37-06, A61K35-14, A61P37-02, A61K35-12
【公开号】CN104873540
【申请号】CN201510185968
【发明人】R.迪恩斯, 霍夫 W.范特, R.马齐尔兹, M.科瓦索维克斯, P.斯特里特
【申请人】阿特西斯公司, 俄勒冈健康与科学大学
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2006年11月9日
【公告号】CA2628254A1, CN101336112A, CN101336112B, CN104095878A, EP1951294A1, EP2684571A1, US8147824, US20060263337, US20090104163, US20120135043, US20150118193, WO2007056578A1