可单独使用或与色素沉着的其它抑制剂或促进剂(诸如对苯二酚、曲酸等)组合使用。这些抑制剂可以与其它化妆品或皮肤病学有用的化合物(诸如防晒剂、消炎药、维生素A及其衍生物、维生素C及其衍生物和其它维生素、微量矿物质和营养素)组合。所述抑制剂可以与常用的皮肤递送形式(诸如乳剂、洗剂、霜剂、精华素、水凝胶、聚合物、有机硅等)混合。它们可以与香料、抗微生物化合物、防腐剂和抗氧化剂组合。
实施例
[0039]实施例1-棕榈酰化抑制剂2-BP对酪氨酸酶的棕榈酰化的影响
将正常人表皮黑色素细胞(NHEM)与2-溴棕榈酸盐(2-BP)孵育24小时，并且通过Western印迹(WB)使用小鼠单克隆抗酪氨酸酶IgG抗体T311 (1:120稀释液)测定总酪氨酸酶。总酪氨酸酶蛋白水平通过微管蛋白进行归一化。棕榈酰化酪氨酸酶通过酰基-RAC和WB评估。图2A和2B中显示的结果是三次测定的平均值SE。兮〈0.05 ks.DMS0。
[0040]NHEM与各种浓度的2-BP (棕榈酰化的抑制剂)的孵育，与DMSO对照相比，导致每个细胞的酪氨酸酶蛋白的总量的统计学显著增加。此外，尽管总蛋白的量增加，但棕榈酰化酪氨酸酶的量减少。
[0041]实施例2 - 2-BP对NHEM和重构的人皮肤模型中的黑色素合成的影响
NHEM用所示浓度的2-BP处理48小时。测量黑色素含量(实心柱)和细胞数(空心柱)。值是三次测定的平均值土SE。*p < 0.05 vs.DMS0。通过数码相机摄取细胞沉淀的宏观图(图3A)。重构的人皮肤模型(亚洲型)与25 μΜ 2-BP孵育17天。测定真黑色素(EM)和褐黑色素(PM)含量，并且通过下式计算。EM=PTCA*25，PM=4_AHP*9。值是三次测定的平均值土SE。*p < 0.05 vs.DMS0。通过数码相机摄取17天后人皮肤模型的宏观图(图3B)。
[0042]NHEM与各种浓度的2_BP的孵育，与DMSO对照相比，导致每个细胞的黑色素含量的统计学显著增加。此外，将人皮肤模型与2-BP的孵育还导致组织的总黑色素(真黑色素(EM)和褐黑色素(PM))含量的统计学显著增加。
[0043]实施例3 - 2-BP对酪氨酸酶的mRNA表达和糖基化的影响。
[0044]将NHEM与2-BP培养6或24小时。通过实时定量PCR分析酪氨酸酶mRNA水平。所示结果是三次测定的平均值土SE。*p < 0.05 vs.DMSO (图4A)。将NHEM与5 μ M 2-BP孵育24小时。通过WB对酪氨酸酶的成熟和未成熟的形式进行通过endo H的糖苷酶消化处理和WB分析(图4B)。据观察，NHEM与2-BP的孵育导致酪氨酸酶mRNA表达的降低，但对酪氨酸酶的糖基化没有影响。
[0045]实施例4- 2-BP对酪氨酸酶的降解的影响
NHEM用I μ g/ml环己酰亚胺(蛋白合成抑制剂)在有(■)或没有(? ) 10 μ M2-BP的情况下处理4小时。通过WB使用小鼠单克隆抗酪氨酸酶IgG抗体T311 (1:120稀释液)分析酪氨酸酶水平。对于每个条件，将酪氨酸酶的条带强度通过作为内部对照的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的条带强度进行归一化。所示结果是三次测定的平均值土SE。*/7 < 0.05 vs.DMSO (图 5A 和 5B)。
[0046]如图中显示，当NHEM用环己酰亚胺(蛋白合成抑制剂)处理时，酪氨酸酶水平降低。然而，孵育培养基中2-BP的额外存在抑制了环己酰亚胺的影响，表明2-BP抑制酪氨酸酶的降解。
[0047]实施例5- 2-BP对酪氨酸酶的泛素化的影响
将NHEM用5 μΜ 2-BP处理24小时。相等蛋白量的细胞裂解物用于通过酪氨酸酶的IP，并且酪氨酸酶的泛素化(UB)水平通过WB使用抗UB抗体分析。
[0048]图6中显示的结果表明2-BP对酪氨酸酶的泛素化没有影响。因此，据观察，如图7中的示意图所示，尽管2-BP抑制酪氨酸酶降解，并且导致黑色素合成的活化，但泛素蛋白酶体系统不参与该现象。
[0049]实施例6 -酪氨酸酶特异性DHHC的筛选
如本文上面所示，PAT共享富含DHHC的结构域，并且可以成簇为遗传保守的DHHC家族蛋白(Tsutsumi R, Fukata Y, Fukata M “Discovery of protein-palmi toy latingenzymes”，Eur T Phys1l.2008 Sep; 456 (6): 1199-206.)。这不意性地显不于图 8。为了阐明这些DHHC中的何者参与酪氨酸酶棕榈酰化，HEK293T细胞用酪氨酸酶和个别DHHC转染。用[3H]棕榈酸盐代谢标记后，将蛋白通过SDS-PAGE分开(图9)。上小图显示通过抗酪氨酸酶抗体的WB ;下小图显示放射自显影。DHHC 3、7、15各显示对酪氨酸酶棕榈酰化的强烈影响，且DHHC 2、6、11、17、21、22各显示对酪氨酸酶棕榈酰化的微弱影响。
[0050]实施例7 - DHHC 2、3、7和15沉默对MNT-1细胞中的酪氨酸酶棕榈酰化的影响为了评价DHHC 2、3、7和/或15是否参与酪氨酸酶棕榈酰化，本发明人评价了敲低
DHHC 2、3、7或15对酪氨酸酶的影响。MNT-1细胞用针对DHHC 2、3、7和15的siRNA或对照siRNA转染。3天后，重复siRNA转染。初始转染后6天，通过酰基-RAC和WB分析酪氨酸酶棕榈酰化。结果(图10)显示六次测定的平均值土SE。丸P < 0.05 F5.DMS0。结果表明，DHHC 2、3、7和15可参与酪氨酸酶棕榈酰化。使用针对DHHC 2和15的siRNA观察到的棕榈酰化酪氨酸酶的量的降低是统计学显著的。
[0051]实施例8 - NHEM中的DHHC 2、3、7和15_myc的细胞内定位的分析
用具有myc标签的DHHC 2、3、7和15转染的NHEM (亚洲)用抗myc抗体染色，并且还用针对Vtilb (高尔基体)或HMB45(黑色素体)的抗体标记。结果显示于图1lA和11B。发现DHHC 2定位于黑色素体、质膜和高尔基体中。还发现定位于高尔基体中的是DHHC 7和15。发现DHHC 3定位于内质网(ER)中。
[0052]实施例9 -人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点
MNT-1细胞用野生型酪氨酸酶或三种酪氨酸酶之一(在三个关键半胱氨酸密码子之一处突变，其导致半胱氨酸替换为丙氨酸，如下:C8A、C35A或C500A)转染。48小时后，通过酰基-RAC和WB分析酪氨酸酶的棕榈酰化。图12A中显示的结果表明，Cys500的密码子的突变导致酪氨酸酶棕榈酰化的丢失，表明Cys500是人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点。通过软件CSS-Palm 3.0对人酪氨酸酶中最可能S-棕榈酰化位点的预测(如图12B中显示)支持该发现。
[0053]实施例10 -人酪氨酸酶中的棕榈酰化位点
HEK293T细胞用酪氨酸酶和个别DHHC转染。用[3H]棕榈酸盐代谢标记4小时后，将蛋白通过SDS-PAGE分开。在图13A和13B的每个中，上小图是放射自显影，且下小图显示使用抗酪氨酸酶抗体的WB分析。结果表明，具有C500A的突变的酪氨酸酶没有被DHHC 2、3、7或15棕榈酰化(白色星号)，进一步支持了上述实施例9中的酪氨酸酶的棕榈酰化位点是Cys500的观察。
[0054]实施例11- PP2对NHEM中的黑色素合成的影响
NHEM (亚洲)在PP2存在的情况下在有或没有2-BP的情况下孵育120小时。PP2抑制2-BP处理的细胞和没有用2-BP处理(无细胞毒性)的细胞两者中的黑色素合成(图14A和 14B)。平均值土 S.E.(N=3) *p〈0.05, ks.对照。
[0055]曲酸(KA)用作阳性对照。如图14C和14D中显示，KA轻度抑制2-BP处理的细胞和没有用2-BP处理的细胞两者中的黑色素合成。
[0056]实施例12- PP2对黑色素生成的作用机制:PP2对NHEM中的黑色素合成的影响如图15中显示，PP2不抑制人酪氨酸酶(D0PA氧化)体外活性，而曲酸(阳性对照)以剂量依赖的方式抑制酪氨酸酶活性。平均值土S.E.(N=4) *p〈0.05，F5.对照。
[0057]实施例13- PP2对黑色素生成的作用机制:PP2对NHEM中的酪氨酸酶蛋白水平的影响
NHEM在PP2存在的情况下在有或没有2-BP的情况下孵育48小时。如图16中显示，PP2降低2-BP处理的人NHEM(亚洲)中的酪氨酸酶蛋白水平。平均值土S.E.(N=3) *p〈0.05，vs.对照。
[0058]尽管本文上面已经参照具体实施方案、特征和方面描述了本发明，但是应当认识到，本发明并不因此受到限制，反而在效用中延伸到其它修改、变化、应用和实施方案，并且因此，所有此类其它修改、变化、应用和实施方案应被视为在本发明的精神和范围内。
【主权项】
1.用于增加需要此类增加的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法，其包括用黑色素增加有效量的DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的至少一种抑制剂处理所述皮肤或毛发。2.权利要求1的方法，其中所述至少一种抑制剂是2-BP。3.用于减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法，其通过用黑色素减少有效量的PPT的至少一种抑制剂处理所述皮肤或毛发而实现。4.权利要求3的方法，其中所述PPT的至少一种抑制剂是含有至少一个棕榈酰化氨基酸的至少一种肽。5.权利要求4的方法，其中所述至少一种抑制剂包含PPl。6.权利要求4的方法，其中所述至少一种抑制剂包含PP2。7.用于减少需要此类减少的哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的方法，其通过用黑色素减少有效量的至少一种棕榈酰化肽处理所述皮肤或毛发而实现。8.权利要求7的方法，其中所述至少一种棕榈酰化肽是含有至少一个棕榈酰化氨基酸的至少一种肽。9.权利要求7的方法，其中所述至少一种棕榈酰化肽包含PPl。10.权利要求7的方法，其中所述至少一种棕榈酰化肽包含PP2。11.用于增加哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素增加有效量的DHHC 2、3、7、15、6、11、17、21或22的至少一种抑制剂。12.权利要求11的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述至少一种抑制剂是2-BP。13.用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的PPT的至少一种抑制剂。14.根据权利要求13的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述PPT的至少一种抑制剂包含含有至少一个棕榈酰化氨基酸的至少一种肽。15.根据权利要求14的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述PPT的至少一种抑制剂包含 PPl016.根据权利要求14的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述PPT的至少一种抑制剂包含 PP2。17.用于减少哺乳动物皮肤或毛发中黑色素的出现的化妆品或皮肤病学组合物，其在化妆品或皮肤病学可接受的媒介物中包含黑色素减少有效量的至少一种棕榈酰化肽。18.权利要求17的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述至少一种棕榈酰化肽包含PP1。19.权利要求17的化妆品或皮肤病学组合物，其中所述至少一种棕榈酰化肽包含PP2。20.权利要求17的化妆品或皮肤病学组合物，其进一步包含额外的增白活性剂。
【专利摘要】提供了用于通过修饰酪氨酸酶棕榈酰化调节黑色素生成的组合物和方法。
【IPC分类】A61Q5/00, A61K8/64, A61Q19/02
【公开号】CN104918602
【申请号】CN201380067441
【发明人】D.B.亚罗什, L.德克莱克, Y.尼基, N.塞托
【申请人】Elc 管理有限责任公司
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2013年12月12日
【公告号】CA2895238A1, EP2934474A1, US20140178319, US20150283054, US20150283104, US20150283105, WO2014099609A1