)、中剂 量组（250mg/kg)、高剂量组（500mg/kg)、阳性对照组黄芪多糖，每组8只，灌胃给药，每天 一次，连续14d，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水。于给药第8d除正常对照组 外，其余各组注射环磷酰胺（50mg/kg/d, ip),连续3d,造成免疫功能抑制小鼠模型。免疫 抑制小鼠模型造成后，除空白组外，每只小鼠腹腔注射5%的SRBC 0. 2ml，初次免疫，3天后 再次进行免疫，免疫后的第4天，小鼠脱颈处死，制备脾细胞悬液（lX106/ml)，每管依次加 入各组脾细胞悬液、0. 2% SRSC及补体（生理盐水以1 :10稀释豚鼠血清）各0. 5ml，振荡混 匀，另设不加补体的空白对照。置37°C水浴中温育lh，冰浴终止反应。离心（3000rpm，5min) 取上清。酶标仪413nm测OD值。实验结果见表3。
[0039] 表3柳生金针菇多糖蛋白复合物对免疫抑制小鼠抗体细胞生成的影响
[0041] 注：与模型对照组相比，〈0. 01，*P〈0. 05
[0042] 抗体生成细胞反应脾脏中B细胞分泌抗体的能力，是机体体液免疫功能的重要指 标。由表3的结果可以看出，与正常组相比模型组抗体生产细胞OD值显著降低（p〈0. 01)， 柳生金针菇多糖蛋白复合物高、中剂量组可明显改善免疫抑制小鼠抗体生成细胞能力 (p〈0. 05)。
[0043] 试验例4
[0044] 定量溶血分光光度测定法（QHS)测定抗体生成细胞。昆明雄鼠48只，随机分为6 组，即为正常对照组、模型对照组、柳生金针菇多糖蛋白复合物低剂量组（125mg/kg)、中剂 量组（250mg/kg)、高剂量组（500mg/kg)、阳性对照组黄芪多糖，每组8只，灌胃给药，每天 一次，连续14d，正常对照组和模型对照组给予等量的生理盐水。于给药第8d除正常对照 组外，其余各组注射环磷酰胺（50mg/kg/d, ip),连续3d,造成免疫功能抑制小鼠模型。免 疫抑制小鼠模型造成后，每只小鼠腹腔注射10 %的SRBCO. 2ml，5天后小鼠脱颈处死，眼球 取血并分离血清，PBS将血清稀释200倍，依次向离心管中加入血清lml、5%的SRSCO. 5ml 和补体（I: 10稀释）lml，另设PBS空白对照。置37°C恒温培养箱中温育lh，冰浴终止反应。 2000rpm离心10min，取Iml上清液加入3ml都氏试剂中，摇勾，酶标仪置波长540nm测定OD 值。另取〇. 25ml5%的SRBC，加入都氏试剂至4ml，混匀，室温放置IOmin后，读取OD值，即 得到SRBC的半数溶血值。按下述公式计算样品半数溶血值（HC 5tl):
[0045] 样品HC5tl=(样品OD值/SRBC半数溶血OD值）X稀释倍数。实验结果见表4。
[0046] 表4柳生金针菇多糖蛋白复合物对免疫抑制小鼠血清血溶素含量的影响
[0048] 注：与模型对照组相比，〈0. 01，*P〈0. 05
[0049] 溶血素测定反应了血清中溶血素的含量，也是机体体液免疫功能的重要指标之 一。从表4结果显示柳生金针菇多糖蛋白复合物高、中、低剂量组可以不同程度的提高血清 溶血素的含量，高剂量组和低剂量组都具有极显著差异（P〈〇. 01)。
[0050] 试验例5
[0051] 取昆明种雄鼠48只，称重后随机分成6组，即正常组（生理盐水）、模型组（生理盐 水）、阳性组（环磷酰胺30mg/kg)和柳生金针葫多糖蛋白复合物高（500mg/kg)、中（250mg/ 1^)、低（12511^/1^)剂量组。抽取3180荷瘤小鼠腹水，生理盐水调整细胞浓度为1\10 7个 /mL，除正常组外，其余各组以每只0.1 mL接种于小鼠左侧腋下，建立小鼠 S180肉瘤模型。 各实验组均灌胃给药，体积为0.2mL/10g。于接瘤后第三天开始给药，连续给药10天。末 次给药后，小鼠断食不断水12h，称重，眼球取血，脱颈处死，剥离肿瘤，取出胸腺及脾脏并称 重，按下述公式计算胸腺指数并计算抑瘤率。实验结果见表5
[0052] 胸腺指数=胸腺重量（mg)/体重（g)
[0053] 表5柳生金针菇多糖蛋白复合物对S180荷瘤小鼠胸腺的影响
[0055] 注：与模型对照组相比，〈0. 01，乍〈0. 05
[0056] 由表5的实验结果可以看出，与模型组比，柳生金针菇多糖蛋白复合物高、中、低 剂量组均能显著提高胸腺指数（P〈〇. 05)，中剂量组效果最好。说明其对S180荷瘤小鼠有较 好的免疫调节作用且可抑制其肿瘤生长，在柳生金针菇多糖蛋白复合物浓度为500 (mg/kg-d)时，抑瘤率达到34. 44%。
【主权项】
1. 一种柳生金针菇多糖蛋白复合物，其特征在于是由下列方法得到的： (一） 发酵：将柳生金针葫菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度22-26°C， 转速120-16017/111111，培养5-6(1后，以10-20%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度 22-26°C，转速 120-160r/min，培养 5-6d后，4000r/min-6000r/min离心收集上清液，获得粗 多糖蛋白复合物发酵液； (二） 提取：将步骤（一）所香粗多糖蛋白复合物发酵液经旋转蒸发浓缩至原体积的 1/10-1/8,加入3-5倍体积无水乙醇4°C沉淀12~16h，离心10-20min，转速3000-5000r/ min，收集沉淀，45-50°C干燥，即得。2. 根据权利要求1所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物，其特征在于所述的种子培养 基组成为：马铃薯 200-300g;葡萄糖 15-20g，KH2PO4L5-2. 0g，MgSO4 ? 7H20,0. 75-lg，VB1， 1-1. 5mg，水，1000mL。3. 根据权利要求I所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物，其特征在于所述发酵培养基组 成为：葡萄糖 100-200g;玉米粉 200-400g;酵母浸粉 60g;KH2P04,1. 5-2.Og;MgS04 ? 7H20， 7. 5_10g;VB1，10_15mg;水，1000mL。4. 根据权利要求I所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物，其特征在于通过苯酚-硫酸法 测定其中多糖含量为38% -46%，通过考马斯亮蓝法测定蛋白含量为12% -15%。5. 如权利要求1所述一种柳生金针菇多糖蛋白复合物的制备方法，其特征在于包括下 列步骤： (一） 发酵：将柳生金针葫菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度22-26°C， 转速120-16017/111111，培养5-6(1后，以10-20%接种量接入发酵培养基，发酵条件为 ：温度 22-26°C，转速 120-160r/min，培养 5-6d后，4000r/min-6000r/min离心收集上清液，获得粗 多糖蛋白复合物发酵液； (二） 提取：将步骤（一）所香粗多糖蛋白复合物发酵液经旋转蒸发浓缩至原体积的 1/10-1/8,加入3-5倍体积无水乙醇4°C沉淀12~16h，离心10-20min，转速3000-5000r/ min，收集沉淀，45-50°C干燥，即得。6. 根据权利要求5所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物的制备方法，其特征在于所述 的种子培养基组成为：马铃薯200-300g;葡萄糖15-20g，KH2PO4L5-2. 0g，MgSO4 ? 7H20， 0. 75-lg，VB1，1-1. 5mg，水，1000 mL;所述发酵培养基组成为：葡萄糖100-200g;玉米粉 200-400g;酵母浸粉60g;KH2P04,1. 5-2.Og;MgS04.7H20,7. 5-10g;VB1，10-15mg;水，1000mL。7. 根据权利要求I所述的柳生金针菇多糖蛋白复合物的制备方法，其特征在于通过 苯酚-硫酸法测定所得多糖含量为38% -46%，通过考马斯亮蓝法测定所得蛋白含量为 12% -15%〇8. 如权利要求1所述一种柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备具有免疫调节活性的药 物中的应用。9. 如权利要求1所述一种柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备提高正常小鼠血清中的 细胞因子INF-Y、TNF-a和CRP的表达和脾淋巴细胞亚⑶47⑶8+的比值的药物中的应用。10. 如权利要求1所述一种柳生金针菇多糖蛋白复合物在制备提高免疫抑制小鼠抗体 生成细胞数量和血清中血溶素含量，以及S180瘤小鼠的胸腺指数抑制其肿瘤生长的药物 中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种柳生金针菇多糖蛋白复合物及其制备方法及应用，属于天然药物开发领域。将柳生金针菇菌种接种于种子培养基内，培养条件为：温度22-26℃，转速120-160r/min，培养5-6d后，以10-20％接种量接入发酵培养基，发酵条件为：温度22-26℃，转速120-160r/min，培养5-6d后，4000r/min-6000r/min离心收集上清液，经旋转蒸发浓缩至原体积的1/10-1/8，加入3-5倍体积无水乙醇4℃沉淀12～16h，离心10-20min,转速3000-5000r/min，收集沉淀，45-50℃干燥。本发明填补了市场上对柳生金针菇资源开发和利用的空白。同时，对于深度开发多糖类免疫促进剂药物和具有免疫调节作用的保健食品开发提供了重要的基础，具有重要的经济价值和市场价值。
【IPC分类】A61K36/06, A23L1/29, A61P37/02, A61P35/00
【公开号】CN104922162
【申请号】CN201510292653
【发明人】王 琦, 朱宴妍, 刘洋, 魏巍, 朱相杨, 王瑞
【申请人】吉林农业大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月1日