DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及DBeQ在抑制白色念珠菌菌丝生长中的应用。
【背景技术】
[0002] 白色念珠菌（Candida albicans)是一种常见的条件致病真菌，通常在人体粘膜表 面造成局部感染，在免疫缺陷病人中白色念珠菌往往可造成系统性感染。由于HIV的感染 以及肿瘤病人和器官移植病人数量的增加，白色念珠菌的感染日益成为重要的临床问题。 研究表明在癌症病人中，白色念珠菌是最常见的造成感染的真菌（在癌症病人体内分离出 的真菌病原体中70%属白色念珠菌），同时，具有抗药性菌株的出现和传播也进一步增加 了治疗的难度。例如，传统上fluconazole是有效的治疗药物，然而目前已出现多个抗该药 物的白色念珠菌菌株，因此，开发新型药物成为了一个日渐迫切的课题。
[0003] 白色念珠菌的一个特点是其形态可以在单细胞的酵母态与纤维状的菌丝态之间 变化。研究表明，只有菌丝态的白色念珠菌才能完成其对内皮或粘膜的侵袭。感染的病人取 样研究还发现，侵入上皮组织的白色念珠菌都以菌丝态存在。因此，目前证据表明菌丝态的 形成是白色念珠菌得以侵袭人体组织的一个决定因子。由于局部感染的建立是导致白色念 珠菌进入血液导致系统性病变的基础，该菌的形态变化很可能是其致病性的关键因素。因 此，干预菌丝形成有可能成为开发新型药物的基础。
[0004] 转运必需内体分选复合物（endosomalsortingcomplexrequiredfortransport， ESCRT)最初是在内体（endosome)内陷形成多囊泡体（multivecicular body，MVB)的过程 中发现的，其作用是完成膜蛋白的降解，其包括5种蛋白复合物，分别命名为ESCRT 0、I、 II、III和Vps4/Vtal。其中，Vps4属于AAA ATPase。研究表明，ESCRT系统的缺失会导致MVB 形成的障碍，并且在内体上出现一个特殊的结构，称为E型区域（class E compartment)。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供式I所示的DBeQ的新用途。
[0006] 本发明提供了式I所示的DBeQ在制备抗白色念珠菌的产品中的应用：
[0007]
[0008] 上述应用中，所述抗白色念珠菌是通过抑制白色念珠菌的菌丝生长体现的。
[0009] 上述应用中，所述抑制白色念珠菌的菌丝生长是通过抑制Vps4蛋白活性体现的。
[0010] 上述应用中，所述抑制白色念珠菌Vps4蛋白活性是通过1)抑制Vps4蛋白的 ATPase活性和/或2)抑制ESCRT系统功能体现的。
[0011] 本发明还提供了式I所示的DBeQ在抑制白色念珠菌的菌丝生长中的应用。
[0012] 本发明还提供了式I所示的DBeQ在制备抑制白色念珠菌的菌丝生长的产品中的 应用。
[0013] 本发明还提供了式I所示的DBeQ在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的应用。
[0014] 本发明还提供了式I所不的DBeQ在制备抑制Vps4蛋白的ATPase活性的广品中 的应用。
[0015] 本发明还提供了式I所示的DBeQ在抑制ESCRT系统功能中的应用。
[0016] 本发明还提供了式I所示的DBeQ在制备抑制ESCRT系统功能的产品中的应用。
[0017] 上述应用中，所述Vps4蛋白来源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具体为白色念珠 菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ;所述Vps4蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列2所 不。
[0018] 本发明的另一个目的是提供一种抗白色念珠菌的产品。
[0019] 本发明提供的产品的活性成分为式I所示的DBeQ，所述产品的用途为如下 (1)-(4)中的至少一种：
[0020] 1)抗白色念珠菌；
[0021] 2)抑制白色念珠菌的菌丝生长；
[0022] 3)抑制Vps4蛋白的ATPase活性；
[0023] 4)抑制ESCRT系统功能。
[0024] 上述产品在抑制白色念珠菌的菌丝生长中的应用也属于本发明的保护范围。
[0025] 上述产品在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的应用也属于本发明的保护范围。
[0026] 上述产品在抑制ESCRT系统功能中的应用也属于本发明的保护范围。
[0027] 上述应用中，所述抑制ESCRT系统功能是通过抑制Cps转运进入液泡中体现的。
[0028] 上述产品或上述应用中，所述Vps4蛋白来源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具体 为白色念珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ;所述Vps4蛋白的氨基酸序列具体如序列表 中序列2所示。
[0029] 本发明发现了 DBeQ可以抑制白色念珠菌菌丝的生长，并通过实验进一步证明 DBeQ是一个白色念珠菌Vps4蛋白的有效抑制剂，DBeQ是通过对Vps4蛋白的抑制作用进而 对ESCRT系统产生影响，表现为白色念珠菌菌丝的生长受到了抑制。因此，DBeQ不仅可以 作为进一步开发抗白色念珠菌感染的基础，还可以被开发为一种研究细胞功能的研究工具 用于观察细胞在ESCRT系统被抑制后的变化。
【附图说明】
[0030] 图1为白色念珠菌Vps4蛋白的纯化。M为标准蛋白；1为未诱导的E. coli全菌； 2为诱导后的E. coli全菌；3为细胞破碎液；4为亲和层析柱的穿过峰；5为凝血酶酶切后 亲和层析柱的洗脱峰。
[0031] 图2为DBeQ的分子式。
[0032] 图 3 为 DBeQ 抑制 Vps4 的 ATPase 活性。
[0033] 图4为DBeQ影响Cps的分布。图4a为GFP-Cps在BWP17中充满整个液泡；图4b 为GFP-Cps在vps4-/-中只是集中在液泡表面，呈现戒指状；图4c为GFP-Cps BWP17在30uM DMSO处理4h后，GFP-Cps的分布和a基本相同；图4d为GFP-Cps BWP17在30uM DBeQ处理 4h后，GFP-Cps的分布与a相比发生改变，但不如Vps4敲除作用明显。
[0034] 图5为白色念珠菌的不同菌丝生长状态。图5a为白色念珠菌的酵母态；图5b为 单菌丝态，当酵母态处于诱导条件（37°C，20% serum或Ph7)下会长出菌丝；图5c为多菌 丝态，当菌丝不能正常维持极性时，会出现两根或多根菌丝。
[0035] 图6为Vps4的缺失抑制了白色念珠菌菌丝生长。图6a为使用pH诱导；图6b为 使用血清诱导。其中，T为总菌丝数；S为单菌丝数；M为多菌丝数；BWP17URA3为野生型； V4-/-URA3为Vps4敲除型；V4-/-EQV4URA3为Vps4敲除后补充入Vps4E235Q显性负突变 体。
[0036] 图7为DBeQ抑制白色念珠菌菌丝生长。图7a为使用Ph7诱导菌丝；图7b为使用 血清诱导菌丝。
[0037] 图8为GFP-Cps在BWP17和vps4-/_中分布模式图。图8a为酵母型白色念珠菌； 图8b为GFP-Cps在BWP17中的分布；图8c为GFP-Cps在vps4-/_中的分布。
【具体实施方式】
[0038] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040] 大肠杆菌DH5a感受态细胞是北京全式金生物技术有限公司的产品。
[0041] 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞是北京全式金生物技术有限公司的产品。
[0042] 白色念珠菌 BWP17 (营养型为 arg-/his-/ura_)在文献 "Wilson, R. B. , Davi s,D. , and Mitchell,A.P. 1999. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181(6) :1868 - 1874. PMID: 10074081"中公开过，公众可从北京师范大学获 得。
[0043] 白色念珠菌vps4-/_(简写v4-/_，营养型为arg+/his+/ura_)是运用基因敲除的 方法将白色念珠菌BWP17基因组中的两个vps4拷贝敲掉，且其余基因与白色念珠菌BWP17 一致的菌株。基因敲除的方法在文献"Fonzi W. A.，and Irwin Μ. Y. · Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics, 1993, 134:717-728.'， 中公开过，公众可以从北京师范大学获得。
[0044] 白色念珠菌BWP17URA