O稀释至25nM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为5nM);
[0080] 对照组 I (5nM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至25nM)混匀得到的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为5nM，体系内不含蛋白）；
[0081] 实验组 2 (IOnM):将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (储存母液为100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至50nM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为IOnM);
[0082] 对照组 2 (IOnM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至50nM)混匀得到的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为10nM，体系内不含蛋白）；
[0083] 实验组 3 (15nM):将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (储存母液为100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至75nM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为15nM);
[0084] 对照组 3 (15nM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至75nM)混匀得到的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为15nM，体系内不含蛋白）；
[0085] 实验组 4 (20nM):将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (储存母液为100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至IOOnM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为20nM);
[0086] 对照组 4 (20nM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至IOOnM)混匀得到的测活体系（后续加入 IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为20nM，体系内不含蛋白）；
[0087] 实验组 5 (30nM):将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (储存母液为100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至150nM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为30nM);
[0088] 对照组 5 (30nM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至150nM)混匀得到的测活体系（后续加入 IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为30nM，体系内不含蛋白）；
[0089] 实验组 6 (40nM):将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (储存母液为100 % DMSO溶解浓度为5mM，使用前12 % DMSO稀释至200nM)混匀得到 的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中的终浓度为 25nM、DBeQ在体系中的终浓度为40nM);
[0090] 对照组 6 (40nM 对照）：将 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (储存母液为 100% DMSO溶解浓度为5mM，使用前12% DMSO稀释至200nM)混匀得到的测活体系（后续加入 IOul ATP，体系终体积为50ul，故DBeQ在体系中的终浓度为40nM，体系内不含蛋白）；
[0091] 对照组 0 :将 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶剂为 5*assay buffer)和 IOul 12 % DMSO混匀得到的测活体系（后续加入IOul ATP，体系终体积为50ul，故Vps4蛋白在体系中 的终浓度为25nM，体系内不含DBeQ);
[0092] 将上述各组测活体系，每个体系做4个平行。混匀后室温孵育lOmin。
[0093] 2、测活反应
[0094] 向上述各组测活体系中加入IOul ImM的ATP (ATP终浓度为200mM)，混匀，室温反 应30min ;避光加入50ul孔雀绿试剂，混勾，室温反应10min ;加入IOul 0. 2M柠檬酸钠，混 匀，室温反应5min ;测定0D630。
[0095] 3、数据处理
[0096] 计算相对活性（RA，relative activity)。相对活性=(实验组η-对照组η)/(对 照组O-对照组η)，最后用SPSS19. O分析IC50。
[0097] 使用孔雀绿法可以通过测定磷酸根的浓度，来测定Vps4蛋白的ATPase的活性。结 果如图3所示：随着DBeQ浓度的增加，RA的值越来越低，进而说明DBeQ可以抑制白色念珠 菌Vps4蛋白的ATPase活性，其IC 5。为13. 325 μ M。
[0098] 实施例2、DBeQ对白色念珠菌Cps (羧肽酶）分布的影响
[0099] 白色念珠菌中含有液泡这一结构（图8a)，如果野生型的ESCRT系统完好时，细胞 表达连有绿色荧光蛋白的cps (GFP-CPS)，其液泡内会充满绿色（图8b);如果突变型（比如 敲除Vps4)的ESCRT系统缺陷时，细胞表达连有绿色荧光蛋白的cps (GFP-CPS)不能有效的 被转运进入液泡，所以只有液泡膜是绿色，而且由于细胞的膜转运体系缺陷，在液泡膜的某 处还会有积聚，显示为绿色的亮点，此结构成为E型区域（class E compartment)(图8c)， 本实施例通过研究DBeQ对白色念珠菌Cps分布的影响，进而研究DBeQ对ESCRT系统的影 响。具体步骤如下：
[0100] 1、重组载体 Pmet-GFP-Cps CIplO 的构建
[0101] (1)以白色念珠菌BWP17gDNA为模板，采用Cps-ClaI F和Cps-PstI R引物进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物，即Cps基因，引物序列如下：
[0102] Cps-ClaI F:5'GCCGATCGATATGATTGGACTTCCATTG3' ；
[0103] Cps-PstI R :5'CGAACTGCAGTTATTTATTGTTTGCCTTG3'。
[0104] 将PCR扩增产物1 %琼脂糖凝胶电泳，100V，30min，切胶回收。
[0105] (2)用ClaI和PstI将步骤⑴得到的PCR产物双酶切，得到大小为1743bp的 PCR产物；用ClaI和PstI酶将Pmet-GFP CIplO载体双酶切，得到大小为约5500bp的骨 架载体，过夜将1743bp的PCR产物和大小为约5500bp的骨架载体连接，得到重组载体 Pmet-GFP-Cps CIp 10。并对其进行测序验证。
[0106] 结果表明：重组载体Pmet-GFP-Cps CIplO为将Pmet-GFP CIplO载体的ClaI和 PstI酶切位点间的DNA片段替换为序列表中序列3所示的Cps基因，保持Pmet-GFP CIplO 载体的其他序列不变得到的载体。
[0107] 2、重组载体的线性化
[0108] 用Sail内切酶将重组载体Pmet-GFP-Cps CIplO线性化，得到线性化的重组载体 Pmet-GFP-Cps CIp10。
[0109] 3、重组菌的获得
[0110] 采用醋酸锂法将线性化的重组载体Pmet-GFP-Cps CIplO分别转化BWP17菌株 和 vps4-/_ 菌株，分别得到重组菌 Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17 和 Pmet-GFP-Cps CIplO/ vps4_/_〇
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