一种蟾皮中抗肿瘤活性组合物、其制备方法及用图
【技术领域】
[0001] 本发明属中药技术领域，具体涉及一种蟾皮组合物、其制备方法及用途。其中特别 涉及一种水溶性蟾毒配基类成分的蟾皮提取物，该类成分抗癌效果显著。
【背景技术】
[0002] 蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍等的干燥皮，具有清热解毒、利水消胀 之功效，临床用于治疗痈疽、肿毒、肿瘤、疳积腹胀、慢性气管炎等病症。蟾皮水溶性部位 开发的药品已有多个上市，尤其华蟾素注射液，是从中华大蟾蜍皮经加工制成的水溶性制 剂，治疗原发性肝癌和中晚期肺癌分别获得44%和56%的综合有效率，瘤体缩小率分别为 10%和16%，且对化疗和放疗具有协同作用。临床应用表明，华蟾素注射液具有解毒、消 月中、止痛之功效，用于治疗中、晚期肿瘤、慢性乙型肝炎等症，文献报道其生理活性物质主要 是蟾蜍毒素类（bufotoxins)及其水解产物蟾毒配基类（bufageins)等。
[0003] 从蟾蜍（主要是蟾皮）中已经确定的化合物来看，其成分主要可以分为：蟾毒配基 类、蟾蜍毒素类、蟾毒色胺类三大类以及胆留醇、多肽、氨基酸等其他化合物。但蟾皮的药用 价值还没有得到充分的开发利用。目前为止，国内外关于蟾蜍以及华蟾素的研究焦点主要 集中在其脂溶性蟾毒配基类等成分。该类成分具有明显的细胞毒性抗肿瘤活性。然而，众 所周知华蟾素为水溶性制剂，基本不含有或极少量含有华蟾酥毒基、酯蟾毒配基等脂溶性 蟾毒配基类成分。因此该产品在肿瘤治疗方面的良好表现，根据我们的研究结果，主要来源 于水溶性蟾毒配基类成分。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的在于提供一种具有抗肿瘤作用的蟾皮提取物。
[0005] 本发明的另一个目的是提供一种主要为蟾毒配基类成分的蟾皮提取物，其具有较 好的水溶性，同时指认了其中多种成分。
[0006] 本发明的另一个目的是提供所述蟾皮提取物的制备方法。
[0007] 本发明还有一个目的是提供所述蟾皮提取物的应用。
[0008] 以下通过【具体实施方式】对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领 域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发 明所附权利要求的范围。
[0009] 本发明的目的是通过如下技术方案实现：
[0010] A -种蟾皮提取物
[0011] -种蟾皮提取物，其特征在于它是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制 成的。
[0012] B -种蟾皮组合物
[0013] -种蟾皮中的组合物，是以干蟾皮为原料经过水提或水提醇沉的方法制成蟾皮提 取物后，以层析色谱的方法得到的一种或N种蟾毒配基类成分组合而成的组合物。照高效 液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，联用 质谱（HPLC-MS)，通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品比对，指认出蟾皮脂溶性组合物 中33个色谱峰代表的化合物。日蟾毒他灵、沙蟾毒精、嚏根草苷元等。其具有较好的水溶 性。
[0014] C本发明所得到的组合物具有较好的抗肿瘤活性：
[0015] 1.对肝癌：
[0016] (1)体外抗癌试验结果显示，本发明组合物的体外抗肝癌肿瘤细胞的效果好，毒性 低；
[0017] (2)动物体内实验，本发明组合物对鼠源性肝癌有较好的治疗作用，效果优于华蟾 素注射液；对人源肝癌荷瘤裸鼠也具有抗肿瘤作用，且抗肿瘤效果优于华蟾素注射液。
[0018] 2.对胃癌：
[0019] (1)体外抗癌试验结果显示，本发明组合物的体外抗胃癌肿瘤细胞的效果好，毒性 低；
[0020] (2)动物体内实验，本发明组合物对鼠源性胃癌有较好的治疗作用，效果优于华蟾 素注射液；对人源胃癌荷瘤裸鼠也具有抗肿瘤作用，且抗肿瘤效果优于华蟾素注射液。
[0021] 本发明的意义在于：本发明对蟾皮进行提取后制备得到水溶性较好的一类蟾毒配 基类成分，该组合物在体内外实验中显示，具有比较显著的抗癌活性，同时与其他抗肿瘤药 物相比毒副作用小，具有抗肿瘤类药物开发的良好前景。
【附图说明】
[0022] 图 I HPLC(296nm)色谱图
[0023] 图2 LC-MS离子流图
[0024] 图3药物对!fepG2肿瘤体积的影响(之士S)
[0025] 图4药物对荷HepG2肿瘤裸鼠体重的影响（/土S)
[0026] 图5药物对!fepG2相对肿瘤体积的影响(茫遥）
[0027] 图6药物对HepG2相对肿瘤增值率的影响
[0028] 图7药物对MKM5肿瘤体积的影响（Z±s)
[0029] 图8药物对荷MKN45肿瘤裸鼠体重的影响（万土S)
[0030] 图9药物对MKN45相对肿瘤体积的影响(f ±s:>
[0031] 图10药物对MKN45相对肿瘤增值率的影响
【具体实施方式】
[0032] 下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
[0033] 实验例1 :本发明蟾皮提取物的制备
[0034] 干蟾皮洗净，用5~15倍的水提取2次，浓缩至小体积后分别用50~70%、75~ 90%的乙醇沉淀，滤过，回收乙醇得到蟾皮提取物；或者，干蟾皮洗净，用5~15倍的水提取 2次，浓缩至相对密度为I. 01~1. 35 (80°C )后，分别用40~70%、75~90%的乙醇沉淀， 滤过，将滤液回收乙醇得到蟾皮提取物。具体操作方法为：取干蟾皮进行修治后，加入8倍 水（V/m)，煎煮2次，每次30min，滤过，合并滤液，浓缩。浓缩至小体积（相对密度在1.0 l~ 1. 35,80 °C )，冷却至40 °C，加入95%乙醇调节醇浓度为40~60 %进行一次醇沉，后倾出上 清液；将上清液回收乙醇至无醇味，加入95%乙醇调节醇浓度为75~90%进行二次醇沉， 静置后常压滤过，滤液浓缩至稠膏，冷藏24h，离心，即得蟾皮提取物。
[0035] 实验例2 :本发明蟾皮组合物的制备
[0036] 使用葡聚糖凝胶Sephadex G10、G15、G25、G50、G75或LH20对实施例1中所述蟾 皮提取物进行分离纯化，装柱径高比1:15,上样体积比1:40,恒流速3ml/min去离子水洗 脱，或者，使用聚甲基丙燔酸醅凝胶服40、HW50或HW65对蟾皮提取物行分离纯化，装柱径 高比1:15~20,上样体积比1:10~40,恒流速3~lOml/min去离子水洗脱，按照柱体积 1/5进行收集，以假蟾毒精、日蟾毒它灵、沙蟾毒精为标志物，采用HPLC分析进行跟踪，收集 反应阳性馏分合并。合并液用十八烷基键和硅胶进行纯化后，冷冻干燥，得到组合物。
[0037] 实验例3 :本发明组合物的定性鉴别
[0038] 3. 1仪器与分析条件：
[0039] 分析仪器：Solarix FT-ICR-MS 9· 4T(德国 Bruker 公司）；Agilent 1260 高效液 相色谱仪；
[0040] 色谱条件：Diamonsil C18 色谱柱（4. 6_X 250_，5 μ m);流动相：甲醇（A)-水 (B)，梯度洗脱程序：0_5min，5-20 % A ;5-45min，20-42 % A ;45-70min，42 % -100 % A ;流速： 1.0 ml/min ;柱温：30°C ;进样量：10 μ L ;检测波长：296nm。
[0041] 质谱条件：电喷雾离子源喷雾电压：+4000V，干燥气温度：180°C，干燥气流速： 4. OL/min，喷雾气压力：0. 5bar ;正离子扫描模式采集，质谱扫描范围m/z :70~1500。
[0042] 3. 2对照品制备
[0043] 分别精确称量酯蟾毒配基，华蟾酥毒基、日蟾毒他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、蟾毒 他灵、华蟾毒他灵、蟾毒灵对照品，加甲醇溶解，配置成以上给对照品〇. 2mg/ml的混合标准 溶液，0. 22 μ m滤膜过滤，即得对照品溶液。
[0044] 3. 3供试品的制备
[0045] 取本发明实施例1制备得到的蟾皮提取物，按照1:1的比例与硅胶拌匀，分散，加 热混合物至完全干燥。用二氯甲烷进行索氏回流提取，滤过得到提取液，减压干燥，得到脂 溶性组合物部分。取该组合物Smg加2ml甲醇溶解，0.22μπι微孔滤膜滤过，即得供试品。
[0046] 3. 4结果与讨论
[0047] 通过推导质谱的碎片信息并与已知标准品对比，从组合物供试品色谱峰中推断出 33个化合物。分别为日蟾毒他灵，沙蟾毒精，远华蟾毒精，蟾毒他灵，华蟾毒他灵，蟾毒灵、酯 蟾毒配基、华蟾酥毒基等。结果见表1、图1、2。
[0048] 表1 HPLC-MS解析数据
[0049]
[0056] 实验例4 :本发明组合物的体内外抗肝癌的药效研究
[0057] 4. 1实验材料
[0058] 4. I. 1实验药物及阳性药物
[0059] 华蟾素注射液（批号131101-1，安徽华润金蟾药业股份有限公司）；华蟾素中间 体、5-氟尿