物环磷酰胺（CTX)腹腔注射给药1次，药物组每天腹腔注射给药1次，连续7 天，对照组给予同体积生理盐水。末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤 组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式 为：肿瘤生长抑制率=(1 一 T/C) X 100%，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。 试验进行3次。
[0154] 5. 2. 4对人胃癌细胞MKN45裸鼠移植模型的治疗作用
[0155] MKN45胃癌细胞体外常规培养，待细胞生长至对数生长期后，稳定传代2-3次，收 集细胞，台盼蓝染色计数细胞成活率大于95 %时，调整细胞密度至5 X 106个/ml，皮下接种 于裸鼠右侧腋下，接种体积为〇. 2ml/只。连续观察肿瘤生长情况，待体内成瘤后进行体内 瘤块传代2-3次后取肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠，常规消毒后，处死剥离肿瘤，选取透亮肉色 部分切成约2mmX2mmX2mm小块，接种于裸鼠右侧腋皮下，待肿瘤长至100mm3以上时，淘 汰肿瘤体积过大或过小的裸鼠，按随机区组法将动物分为对照组、阳性药（华蟾素注射液） 组，药物低剂量组、高剂量组，每组6只。随后腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药4周。 给药期间用〇. 〇2_精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周，按下式 计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：
[0156] 肿瘤体积（V，mm3)=肿瘤长径（mm) X肿瘤短径2 (mm) X0. 5 ;
[0157] 相对肿瘤体积（RTV) = Vt/V0 (V0为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体 积）。
[0158] 于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿 瘤重量。计算相对肿瘤增殖率（T/C%) =TRTV/CRTVX100% (TRTV:治疗组RTV，CRTV:对 照组RTV)，肿瘤生长抑制率=(1 一 T/C) X 100% (式中T为给药组平均瘤重，C为对照组 平均瘤重）。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体 内抗癌效果。
[0159] 5. 2. 5统计方法
[0160] 计量数据以均值土标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行检验分析。采用 One-Way AN0VA(0ne_Way Analysis of Variance，单因素方差分析）评价整体性差异，方差 齐性用LSD t-test分析方法进行组间比较，方差不齐用Dunnett' s T3分析方法进行组间 比较，P〈〇. 05为有显著性差异。
[0161] 5. 3实验结果
[0162] 5.3.1
[0163] 样品A体外抗胃癌细胞的活性筛选：结果见表6,从表中可以看出，样品A的体外 抑瘤 IC50为 0· 49 ± 0· 08 ( μ g/ml)。
[0164] 表6药物体外抗BGC823胃癌细胞的抑制率
[0165]
[0166] 5. 3. 2急性毒性试验
[0167] 按表7的分组和给药后，连续7天观察小鼠的状况，给药后短时间内小鼠呼吸加 快，呼吸幅度加大，后肢僵直，角弓反张，浑身抖动，剧烈挣扎，身体反应消失，l〇_15min后死 亡，并且雌鼠对药物的耐受性略强于雄鼠，当给药量在l〇mg/g以下时，小鼠才无任何明显 的不适反应。具体实验结果如表7所示。
[0168] 表7样品A对KM小鼠的急性毒性实验结果（η = 10)
[0169]
[0170] 5. 3. 3药物对小鼠 MFC胃癌肿瘤生长的抑制作用研究
[0171] 按表8所示，动物接种24小时后随机分组给药，每组10只，环磷酰胺（CTX)腹腔注 射给药1次，华蟾素注射液腹腔注射给药1次，静脉滴注日用量为10-20ml，取最大值20ml， 人体重以70kg，小鼠体重20g计算，小鼠等效剂量为3. 4ml/kg，其余各组每天腹腔注射给药 1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水，试验全部受试物均现用现配，末次给药后24小 时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率 来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率=(1-T/C) X 100%，式中T为给 药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
[0172] 结果由表8可见，3次抑瘤试验显示，样品A在3mg/kg、l. 5mg/kg剂量下对MFC月中 瘤生长均有显著的抑制作用，抑瘤率在25 %以上。
[0173] 表8药物对小鼠 MFC肿瘤生长的抑制作用（
[0175] 与对照组比较，***Ρ〈0· 001，**Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05。
[0176] 5. 3. 4药物对人胃癌细胞ΜΚΝ45裸鼠移植模型的治疗作用
[0177] 试验时，待肿瘤长至IOOmm3左右，依肿瘤体积大小按随机区组法将动物分为对照 组、阳性药（华蟾素）组，A低剂量（0.5mg/kg)组、高剂量（2mg/kg)组每组6只。药物现用 现配，腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药6周；于给药期间用0. 02_精度游标卡尺测 量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/周。按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：月中 瘤体积（V，mm 3)=肿瘤长径（mm) X肿瘤短径2 (mm) X0. 5 ;相对肿瘤体积（RTV) = Vt/VQ(V。 为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积）。于末次给药24h后处死动物，称量体 重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率（T/C%) =Trtv/ CrtvX 100% (Trtv:治疗组 RTV，C RTV:对照组 RTV)，肿瘤生长抑制率=(1 - T/C) X 100% (式 中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重）。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、 肿瘤生长抑制率综合评价药物的体内抗癌效果。
[0178] 从图7可知，华蟾素注射液和酯蟾毒配基对MKN45肿瘤体积有明显抑制作用 (*P〈0. 05)，给药2周后已显示对肿瘤生长速度起延缓作用，酯蟾毒配基2mg/kg剂量组的抑 制效果比华蟾素注射液明显（*P〈〇. 05);从图8药物对荷瘤裸鼠体重的影响可知，华蟾素注 射液和酯蟾毒配基2mg/kg剂量组对裸鼠体重有一定影响，但没有统计学意义，0. 5mg/kg剂 量几乎无影响；药物对MKN45相对肿瘤体积和增殖率计算的结果显示（图9,图10)，华蟾素 注射液和酯蟾毒配基可抑制MKN45肿瘤的增殖，其中酯蟾毒配基2mg/kg给药4周后对肿瘤 增值率的影响达63. 1%。表9对肿瘤瘤重的结果可知，给药4周后，给药组肿瘤的重量低于 对照组，其中酯蟾毒配基2mg/kg剂量组的瘤重显著低于对照组和华蟾素注射液组，对肿瘤 生长抑制率高达33. 0% (#P〈0. 01)。
[0179] 表9药物对MKN45肿瘤的影响(f进)
[0180]
[0181] 与对照组比较，*P〈0. 05。
【主权项】
1. 一种蟾皮组合物，其特征在于该蟾皮提取物由以下步骤制备得到：（1)取干蟾皮，洗 净，加5~15倍蒸馏水提取，第一次30~60分钟，第二次30~60分钟，合并水提液，滤过，滤液 浓缩至含Ig生药/ml，或浓缩至相对密度I. 0~1. 4 (80°C )后，分别用40~70%、75~90%的乙 醇沉淀1~3次，滤过，将滤液回收乙醇得到； 或以3000r/min转速离心20分钟，取上清液，超滤，得到蟾皮提取物； (2)以上述所得提取物为原料，进行凝胶色谱分离、烷基键合硅胶色谱纯化；或溶剂分 配结合层析色谱的方法得到的蟾毒配基类成分为主的蟾皮组合物，该组合物具有较好的水 溶性。2. 如权利要求1所述的组合物，制备材料涉及：凝胶--包括葡聚糖凝胶（Sephadex G10、G15、G25、G50、G75、LH20等）和聚甲基丙烯酸基质凝胶（HW40、HW50、HW65等）；烷基键 合硅胶一一包括C4、C8、C18键合硅胶的亲水及一般型；溶剂分配所用有机系溶剂涉及二氯 甲烷、三氯甲烷，分配方法涉及溶剂萃取、超临界萃取。3. 权利要求1所述的组合物、含有所述组合物的制剂的检测方法，其特征在于：采用高 效液相-质谱联用检测系统（HPLC-MS)对该组合物成分进行定性检测及成分指认。4. 权利要求1任一项所述的蟾皮提取物/组合物，具有明显的抗肿瘤活性，应用于肿瘤 治疗、辅助药物。
【专利摘要】本发明公开了一种蟾皮具有抗肿瘤作用的组合物、其制备方法及用途。特别是该蟾皮提取物是由蟾皮提取，并利用葡聚糖凝胶、烷基键和硅胶等高分子填料进行分离纯化得到的。经过液相-质谱联用分析，鉴定出其中33个化合物，确定为水溶性蟾毒配基类成分部位。利用本方法制备的蟾毒配基类成分，经过药理学实验结果表明，本组合物具有很好的抗肿瘤作用，可用于抗癌治疗、辅助医药产品的开发。
【IPC分类】A61P35/00, A61K35/65
【公开号】CN104997811
【申请号】CN201510391023
【发明人】边宝林, 司南, 魏晓璐, 杨健, 王宏洁, 赵海誉, 高波, 罗川
【申请人】安徽华润金蟾药业股份有限公司, 中国中医科学院中药研究所
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月1日