以70kg，小鼠体重20g计算，小鼠等效剂量为3. 4ml/kg，其余各组每天腹腔注射给药 1次，连续7天，对照组给予同体积生理盐水，试验全部受试物均现用现配，末次给药后24小 时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率 来评价药物的体内抗癌效果，计算公式为：肿瘤生长抑制率=(1-T/C) X 100%，式中T为给 药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。
[0106] 结果由表4可见，3次抑瘤试验显示，样品A在3mg/kg、1. 5剂量下对H22肿瘤生长 均有显著的抑制作用，抑瘤率近30%及以上。
[0107] 表4药物对小鼠 H22肿瘤生长的抑制作用（J士s >
[0109] 与对照组比较，***Ρ〈0· 001，**Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05。
[0110] 4. 3. 4药物对人肝癌细胞H印G2裸鼠移植模型的治疗作用
[0111] 试验时，待肿瘤长至IOOmm3左右，依肿瘤体积大小按随机区组法将动物分为对照 组、阳性药（华蟾素）组，A低剂量（0· 5mg/kg)组、高剂量（2mg/kg)组每组6只。现用现配， 腹腔注射给药，一周给药3次，连续给药6周；于给药期间用0. 02mm精度游标卡尺测量肿瘤 的长径和短径，同时称量体重，2次/周。按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积 (V，mm 3)=肿瘤长径（mm) X肿瘤短径2 (mm) X0. 5 ;相对肿瘤体积（RTV) = Vt/VQ(V。为给药 前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤体积）。于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤 径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿瘤重量。计算相对肿瘤增殖率（T/C% ) = Trtv/CrtvX100% (Trtv:治疗组RTV，C RTV:对照组RTV)，肿瘤生长抑制率=(1 - T/C) X 100% (式中T为给药 组平均瘤重，C为对照组平均瘤重）。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑 制率综合评价药物的体内抗癌效果。
[0112] 从图3可知，华蟾素注射液和样品A对HepG2肿瘤体积有明显抑制作用 (**P〈0. 01，*P〈0. 05)，给药2周后已显示对肿瘤生长速度体验延缓作用，样品A2mg/kg剂 量组的抑制效果比华蟾素注射液明显（***P〈〇. 001);从图4药物对荷瘤裸鼠体重的影响 可知，华蟾素注射液和样品A2mg/kg剂量组对裸鼠体重有一定影响，但没有统计学意义， 0. 5mg/kg剂量几乎无影响；药物对HepG相对肿瘤体积和增殖率计算的结果显示（图5,图 6)，华蟾素注射液和样品A可抑制H印G2肿瘤的增殖，其中样品A2mg/kg给药6周后对肿瘤 增值率的影响达44%。表5对肿瘤和脾脏的结果可知，给药6周后，给药组肿瘤的重量低于 对照组，其中样品A2mg/kg剂量组的瘤重显著低于对照组和华蟾素注射液组，对肿瘤生长 抑制率高达57. 6%，脾重则低于对照组，而华蟾素注射液和样品A 0. 5mg/kg剂量组的脾重 高于对照组，尤其样品A 0. 5mg/kg剂量组（#P〈0. 01)。
[0113] 表5药物对!fepG2肿瘤和脾脏的影响C f
[0116] 与对照组比较，***Ρ〈0· 001，**Ρ〈0· 01，*Ρ〈0· 05
[0117] 实验例5 :本发明组合物的体内外抗胃癌的药效研究
[0118] 5.1实验材料
[0119] 5. I. 1实验药物及阳性药物
[0120] 华蟾素注射液（批号131101-1，安徽华润金蟾药业股份有限公司）；华蟾素中间 体、5-氟尿嘧啶（5-Fu)、环磷酰胺，本发明组合物（蟾毒配基类，以下简称样品Α)。
[0121] 5. 1.2细胞及动物
[0122] 5. L 2. 1细胞：BGC823 (人胃癌细胞），MFC (小鼠胃癌细胞），MKN45 (人胃癌细胞）
[0123] 5. 1. 2. 2动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，20±2g ;SPF级ICR小鼠，雌雄各半， 20±2g ;SPF级BALB/c-nu裸鼠，5周龄，雌雄各半（供应单位：北京维通利华实验动物技术 有限公司，许可证号：SCXK (京）2012-0001)
[0124] 5. 1.3 试剂
[0125] 二氯甲烧、甲醇（分析纯，北京化工公司）；乙腈（HPLC级，Fisher Scientific)， HW-40C凝胶（日本tosoh公司）；
[0126] PR頂-1640培养基，DMEM/F12高糖培养基，胎牛血清，双抗（Gibco公司产品）；噻 唑蓝（MTT)，二甲基亚砜（DMSO) (Sigma公司产品）；生理盐水；
[0127] 5. L 4耗材及仪器
[0128] 戴安-Ultimate 3000,四元高压栗，DAD检测器，Thermo-Velos Pro双压线性离子 阱串联静电场轨道阱质谱；C18色谱柱（Thermo公司）；
[0129] 96孔细胞培养板（Costar，3596)，水套式CO2细胞培养箱（Sanyo,日本），Safire2 高速多通道连续波长酶标仪（TECAN，奥地利），电子天平（型号ML104,梅特勒-托利多仪器 (上海）有限公司），游标卡尺（〇.〇2mm精度，上海申量）。
[0130] 5. 2实验方法
[0131 ] 5. 2. 1有效组分体外抗胃癌细胞的活性筛选
[0132] 5. 2. 1.1 检测样品
[0133] 将样品A配置成50、10、2、8、0.4、0. 08、0.016μ g/ml用于抗肿瘤评价；以上皆指样 品加入筛选体系前浓度。
[0134] 5. 2. 1.2 细胞培养
[0135] 将人胃癌细胞BGC823用含10%胎牛血清、2001]/1111青霉素、200以8/1111链霉素的 DiffiM培养液，置于37 °C、5 % (：02培养箱中培养。
[0136] 5. 2. 1. 3药物体外抗胃癌细胞活性筛选
[0137] 取对数生长期的BGC823细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，计数调整细胞浓度至 I X IO4个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100 μ L，待细胞贴壁生长18~24h后弃培养基， 加入不同浓度的样品和阳性药5-Fu50yL，另设细胞对照组（只加细胞不加药）和空白对照 组（只加培养基）。每组设3个平行孔，每孔总体积为200 yL。置于37°C、5%C02培养箱 中培养48h。孵育结束后，小心吸弃细胞上清，加入终浓度为0. 5mg/ml MTT溶液，继续培养 4h后吸弃上清，每孔加入150 μ L DMS0,置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，用酶 标仪（570nm)测定吸光度（A)值，计算细胞生长抑制率，Bliss法计算半数抑制浓度（IC50) 值。实验重复3次。
[0138] 细胞生长抑制率=[1_八样品组/A对照组]X 100 %
[0139] 5. 2. 2样品A抗胃癌细胞研究
[0140] 5. 2. 2.1 检测样品
[0141] 将样品A用生理盐水稀释为lmg/ml的浓度作为初始浓度用于体内抗胃癌细胞的 研究。
[0142] 5. 2. 2. 2药物的急性毒性试验
[0143] (1)预实验
[0144] ?将药物的初始浓度按组间剂量比0. 5进行稀释，即1、0. 5、0. 025和0. 00625mg/ ml四个浓度组，按0. 1-0. 2ml/10g的剂量范围每组对K. M小鼠进行腹腔注射，于2h、4h、 24h、48h和72h连续观察并记录小鼠死亡情况，找出引起O~100%的药物估计致死浓度。
[0145] (2)正式试验
[0146] 取K. M小鼠60只，体重20±2g，雌雄各半，随机分为6组，10只/组。根据预实验 获得的药物剂量范围，按等比级数增减，相邻两剂量比值1:〇. 6~0. 9,设5个剂量组和一个 空白对照组，腹腔注射药物，空白组给以生理盐水。给药后连续观察7d，记录不同剂量组小 鼠死亡情况，通过改良寇氏法公式计算获得药物的LD50。LD50 = lg-l[Xm-i( Σ P-0. 5)]
[0147] Xm :最大剂量组剂量对数值
[0148] i :相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数（相邻两组对数剂量的差值）
[0149] P :各组动物死亡率，用小数表示（如果死亡率为80%应写成0. 80)
[0150] Σ P :各组动物死亡率之总和
[0151] η:每组动物数
[0152] 5. 2. 3药物对小鼠 MFC胃癌肿瘤生长的抑制作用研究
[0153] 将MFC胃癌细胞（腹水/肿瘤悬浮液）于37°C复苏后以生理盐水1:3稀释，腹腔 注射于ICR小鼠，每只小鼠注射0.2ml。取接种肿瘤7~10天状态良好的荷瘤（腹水型） 动物脱颈处死，于无菌环境下常规消毒后抽取少量腹水，推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤 细胞数不少于75%后，相同条件下将腹水抽出，腹水与预冷生理盐水按1 :4比例稀释，制备 成肿瘤细胞混悬液。尽快吸取该混悬液〇. 2ml接种于同种异体小鼠右侧腋窝皮下，从取出 肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。24h后将小鼠随机分组给药，每组10只，雌雄 各半，阳性药