嘧啶（5-Fu)、环磷酰胺；本发明组合物（蟾毒配基类，以下简称样品A)。
[0060] 4. 1. 2细胞及动物
[0061] 4. 1.2. 1细胞：BEL7402(人肝癌细胞），H22(小鼠肝癌细胞），!fepG2(人肝癌细胞）
[0062] 4. 1. 2. 2动物：SPF级KM小鼠，雌雄各半，20±2g ;SPF级ICR小鼠，雌雄各半， 20±2g ;SPF级BALB/c-nu裸鼠，5周龄，雌雄各半（供应单位：北京维通利华实验动物技术 有限公司，许可证号：SCXK (京）2012-0001)。
[0063] 4. 1. 3 试剂
[0064] 二氯甲烧、甲醇（分析纯，北京化工公司）；乙腈（HPLC级，Fisher Scientific)， HW-40C凝胶（日本tosoh公司）；PR頂-1640培养基，DMEM/F12高糖培养基，胎牛血清，双抗 (Gibco公司产品）；噻唑蓝（MTT)，二甲基亚砜（DMSO) (Sigma公司产品）；生理盐水。
[0065] 4. 1. 4耗材及仪器
[0066] 戴安-Ultimate 3000,四元高压栗，DAD检测器，Thermo-Velos Pro双压线性离 子阱串联静电场轨道阱质谱；96孔细胞培养板（Costar，3596)，水套式C02细胞培养箱 (Sanyo,日本），Safire2高速多通道连续波长酶标仪（TECAN，奥地利），电子天平（型号 ML104,梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），游标卡尺（0.02mm精度，上海申量）；C1S 色谱柱（Thermo公司）。
[0067] 4. 2实验方法
[0068] 4. 2. 1体外抗肝癌细胞的活性筛选
[0069] 4. 2. 1.1样品的配置
[0070] 将样品A配置成50、10、2、8、0.4、0.08、0.016μg/ml用于抗肿瘤评价（以上皆指 样品加入筛选体系前浓度）。
[0071] 4. 2. 1.2 细胞培养
[0072] 将BEL7402 人肝癌细胞用含10%胎牛血清、200U/ml青霉素、200 μg/ml链霉素的 DiffiM培养液，置于37 °C、5 % C02培养箱中培养。
[0073] 4. 2. 1. 3药物体外抗肝癌细胞活性筛选
[0074] 取对数生长期的BEL7402细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，计数调整细胞浓度至 I X 104个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100 μ L，待细胞贴壁生长18~24h后弃培养基， 加入不同浓度的本发明组合物样品和阳性药5-Fu 50 μ L，另设细胞对照组（只加细胞不加 药）和空白对照组（只加培养基）。每组设3个平行孔，每孔总体积为200 μ L。置于37°C、 5% C02培养箱中培养48h。孵育结束后，小心吸弃细胞上清，加入终浓度为0. 5mg/ml MTT 溶液，继续培养4h后吸弃上清，每孔加入150 μ L DMS0,置摇床上低速振荡lOmin，使结晶物 充分溶解，用酶标仪（570nm)测定吸光度（A)值，计算细胞生长抑制率，Bliss法计算半数 抑制浓度（IC50)值。实验重复3次。细胞生长抑制率=X 100%
[0075] 4. 2. 2体内抗肝癌细胞研究
[0076] 4. 2. 2. 1 检测样品
[0077] 将样品A用生理盐水稀释为lmg/ml的浓度作为初始浓度用于体内抗肝癌细胞的 研究；
[0078] 4. 2. 2. 2药物的急性毒性试验
[0079] ⑴预实验
[0080] 将药物的初始浓度按组间剂量比0· 5进行稀释，即1、0· 5、0· 025和0· 00625mg/ml 四个浓度组，按0. l-o. 2ml/10g的剂量范围每组对K. M小鼠进行腹腔注射，于2h、4h、24h、 48h和72h连续观察并记录小鼠死亡情况，找出引起0~100 %的药物估计致死浓度。
[0081] (2)正式试验
[0082] 取K. M小鼠60只，体重20 ± 2g，雌雄各半，随机分为6组，10只/组。根据预实验 获得的药物剂量范围，按等比级数增减，相邻两剂量比值1:〇. 6~0. 9,设5个剂量组和一个 空白对照组，腹腔注射药物，空白组给以生理盐水。给药后连续观察7d，记录不同剂量组小 鼠死亡情况，通过改良寇氏法公式计算获得药物的LD50。
[0083] LD50 = lg-1 [Xm-i ( Σ P-0. 5)]
[0084] Xm :最大剂量组剂量对数值
[0085] i :相邻两组剂量高剂量与低剂量之比的对数（相邻两组对数剂量的差值）
[0086] P :各组动物死亡率，用小数表示（如果死亡率为80%应写成0· 80)
[0087] Σ P :各组动物死亡率之总和
[0088] η :每组动物数
[0089] 4. 2. 3药物对小鼠 Η22肝癌肿瘤生长的抑制作用研究
[0090] 将Η22肝癌细胞（腹水/肿瘤悬浮液）于37°C复苏后以生理盐水1:3稀释，腹腔 注射于ICR小鼠，每只小鼠注射0.2ml。取接种肿瘤7~10天状态良好的荷瘤（腹水型） 动物脱颈处死，于无菌环境下常规消毒后抽取少量腹水，推片瑞氏染色细胞分类证实肿瘤 细胞数不少于75%后，相同条件下将腹水抽出，腹水与预冷生理盐水按1 :4比例稀释，制备 成肿瘤细胞混悬液。尽快吸取该混悬液〇. 2ml接种于同种异体小鼠右侧腋窝皮下，从取出 肿瘤腹水至肿瘤接种完毕在60分钟内完成。24h后将小鼠随机分组给药，每组10只，雌雄 各半，阳性药物环磷酰胺（CTX)腹腔注射给药1次，药物组每天腹腔注射给药1次，连续7 天，对照组给予同体积生理盐水。末次给药后24小时，处死动物，称体重，解剖并取出肿瘤 组织，称量肿瘤重量，以平均瘤重及肿瘤生长抑制率来评价药物的体内抗癌效果，计算公式 为：肿瘤生长抑制率=(1 一 T/C) X 100%，式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。 试验进行3次。
[0091] 4. 2. 4对人肝癌细胞HepG2裸鼠移植模型的治疗作用
[0092] !fepG2肝癌细胞体外常规培养，待细胞生长至对数生长期后，稳定传代2-3次，收 集细胞，台盼蓝染色计数细胞成活率大于95%时，调整细胞密度至5X 106个/ml，皮下接 种于裸鼠右侧腋下，接种体积为0. 2ml/只。连续观察肿瘤生长情况，待体内成瘤后进行体 内瘤块传代2-3次后取肿瘤生长良好的荷瘤裸鼠，常规消毒后，处死剥离肿瘤，选取透亮肉 色部分切成约2mmX2mmX2mm小块，接种于裸鼠右侧腋皮下，待肿瘤长至100mm3以上时， 淘汰肿瘤体积过大或过小的裸鼠，按随机区组法将动物分为对照组、阳性药（华蟾素注射 液）组，药物低剂量组、高剂量组，每组6只。随后腹腔注射给药，一周给药3次，连续给 药4周。给药期间用0. 02_精度游标卡尺测量肿瘤的长径和短径，同时称量体重，2次/ 周，按下式计算肿瘤体积及相对肿瘤体积：肿瘤体积（V，_3)=肿瘤长径（mm) X肿瘤短径 2 (mm) X0. 5 ;相对肿瘤体积（RTV) = Vt/V0 (V0为给药前肿瘤体积，Vt为每次测量时的肿瘤 体积）。
[0093] 于末次给药24h后处死动物，称量体重、测量瘤径，解剖并取出肿瘤组织，称量肿 瘤重量。计算相对肿瘤增殖率（T/C%) =TRTV/CRTVX100% (TRTV:治疗组RTV，CRTV:对 照组RTV)，肿瘤生长抑制率=(1 一 T/C) X 100% (式中T为给药组平均瘤重，C为对照组 平均瘤重）。以相对肿瘤体积、相对肿瘤增殖率及瘤重、肿瘤生长抑制率综合评价药物的体 内抗癌效果。
[0094] 4. 2· 5统计方法
[0095] 计量数据以均值土标准差表示，采用SPSS 16.0统计软件进行检验分析。采用 One-Way AN0VA(0ne_Way Analysis of Variance，单因素方差分析）评价整体性差异，方差 齐性用LSD t-test分析方法进行组间比较，方差不齐用Dunnett' s T3分析方法进行组间 比较，P〈〇. 05为有显著性差异。
[0096] 4. 3实验结果
[0097] 4. 3. 1体外抗肝癌细胞的活性筛选：结果见表2。
[0098] 表2药物体外抗BEL7402肝癌细胞的抑制率
[0099]
[0100] 4. 3. 2本发明组合物的急性毒性试验
[0101] 按表3的分组和给药后，连续7天观察小鼠的状况，给药后短时间内小鼠呼吸加 快，呼吸幅度加大，后肢僵直，角弓反张，浑身抖动，剧烈挣扎，身体反应消失，l〇_15min后死 亡，并且雌鼠对药物的耐受性略强于雄鼠，当给药量在l〇mg/g以下时，小鼠才无任何明显 的不适反应。具体实验结果如表4所示。
[0102] 表3样品A对KM小鼠的急性毒性实验结果（η = 10)
[0103]
[0104] 4. 3. 3药物对小鼠 Η22肝癌肿瘤生长的抑制作用研究
[0105] 按表4所示，动物接种24小时后随机分组给药，每组10只，环磷酰胺（CTX)腹腔注 射给药1次，华蟾素注射液腹腔注射给药1次，静脉滴注日用量为10-20ml，取最大值20ml， 人体重