量的选择可以由本领域普通技术人员综合各因素来确定。所 述因素包括但不限于：miR-487的药代动力学参数、被治疗的患者的健康状况、体重、给药 途径等。
[0036] 本发明中，所述药物组合物的给药途径为静脉内、动脉内灌注或局部注射等，也可 以采用本领域技术人员所熟知的给药技术进行给药。
[0037] 本发明的药物组合物可以与其它治疗手段联合，用于前列腺癌的治疗。
[0038] 实施例1
[0039] 实例中所使用的细胞PC-3购自ATCC，即美国模式培养物保藏所，转染试 剂 lipofectamine 2000 贝勾自 invitrogen, miR-487mimic 贝勾自 Life Technologies Corporation(产品 ID 号为 MC10648)miR-487 inhibitor 购自 Life Technologies Corporation (产品 ID 号为 MH10648)。
[0040] 本实施例通过体外细胞生物学实验证明miR-487对前列腺肿瘤细胞转移的功能 的抑制作用。
[0041] 培养PC-3细胞系，分为实验组和对照组分别转染miR-NC(阴性对照）和miR-487， 检测细胞增殖、迀移以及凋亡变化。
[0042] (1)miR-487能够抑制细胞增殖及克隆成球：
[0043]用 lipofectamine 2000 将 miR-487 的模拟物 miR-487mimics 转染（用转染试剂 lipofectamine 2000直接转染）前列腺细胞系PC-3,并用Q-PCR检测其表达量如图1A，结 果表明，miR-487mimics转染PC-3后细胞中miR-487表达量显著性上升，证明mimics能够 模拟miR-487 的表达。miR-487mimics 转染PC-3 细胞 24、36、48、72和9611后，体外用0〇(-8 试剂盒检测细胞增殖，如图1B，结果表明，miR-487能够显著性抑制前列腺癌细胞的增殖。 用软琼脂培养克隆形成实验检测细胞群体依赖性和增殖能力。取对数生长期的单层培养细 胞，用0. 25%的胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM/F12 培养液中备用。将细胞悬液倍数稀释接种于软琼脂培养板中，静置培养10-14周，计算克隆 形成率，如图1C，结果表明miR-487能够显著性抑制PC-3的克隆成球能力。
[0044] (2)miR_487能够促进前列腺癌细胞凋亡。
[0045] 将miR-487mimics转染PC-3后Annexin V-FITC/PI染色，流式细胞术检测凋亡细 胞的数目。
[0046] 结果见图2 :miR-487mimics转染PC-3能够显著提高Annexin V阳性的细胞数，证 明miR-487能够显著引起PC-3细胞凋亡，
[0047] (3) miR-487能够抑制前列腺癌细胞迀移和侵袭。
[0048]miR-487mimics转染PC-3细胞，细胞划痕实验检测细胞的迀移，如图3A-D，另外用 transwell侵袭实验验证细胞的迀移和侵袭能力，如图3E-F，结果表明miR-487mimics转染 PC-3，细胞迀移和侵袭能力下降。
[0049] (4) Western blot检测细胞迀移侵袭相关的蛋白分子变化
[0050] miR-487mimics转染PC-3细胞24小时后，细胞形态发生变化，如图4A所示，提取 蛋白质，检测细胞粘附蛋白N-caderin(神经f丐粘素）和E-caderin(上皮细胞f丐黏蛋白） 的表达，结果表明，miR-487能够抑制癌细胞表面N-caderin，促进E-caderin的表达，如图 4B所示，表明miR-487能够抑制前列腺癌上皮间质转化，抑制癌细胞发生转移。
[0051] 实施例2
[0052] 本实施例通过体内实验证明miR-487对前列腺肿瘤细胞转移的功能的抑制作用。
[0053] 将10只裸鼠随机分为两组，对照组尾静脉注射表达对照miRNA的PC-3M-1UC (该 细胞为将荧光素酶报告载体转染来源于ATCC的PC-3细胞获得）。细胞个数为6X 106;实 验组注射表达miR-487的PC-3M-luc细胞系，细胞个数为6 X 106;注射细胞5周后，每只鼠 每周注射100 y 1浓度为30 y g/ y 1的荧光素酶底物D-luciferin，然后小动物活体成像观 察荧光素酶分布，连续三周统计癌细胞转移率。PC-3细胞系转染miR-NC和miR-487后，用 transwell方法检测细胞的迀移变化，用CCK-8试剂盒检测细胞增殖变化，用Annexin V/PI 方法检测细胞凋亡变化。体内转移实验用小动物活体成像观察细胞转移到的器官部位，进 行相关统计。
[0054] 10周后对取小鼠的肿瘤部分，进行称重和比较，miR-487转化的PC-3细胞成瘤大 小明显低于对照组，经体积和称重结果统计抑制效率为80%。结果见图5。
[0055] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. miR-487在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，所述miR-487的核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括制备抑制前列腺癌细胞迀 移、侵袭和增殖的药物。3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，包括将miR-487与载体结合后与抗肿 瘤药物和/或药物可接受的辅料复配制成药物组合物。 4. miR-487在制备抑制前列腺癌细胞高转移性细胞系PC-3和/或DU145的迀移能力的 药物中的应用。5. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以miR-487为活性成分，其中，所述 miR-487的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。6. 根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有与载体结合 的miR-487和/或药物可接受的辅料。7. 根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为慢病毒表达载体。8. 根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述载体为脂质体或壳聚糖。9. 根据权利要求7或8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物中含有铂类抗 肿瘤药物。10. 根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述抗肿瘤药物为顺铂或卡铂。
【专利摘要】本发明涉及miR-487在制备治疗前列腺癌的药物中的应用，以及一种以miR-487为活性成分的药物组合物，本发明所提供的药物组合物能够通过miR-487对前列腺癌细胞转移能力的抑制作用来抑制前列腺癌的发展过程，抑制效率高达80％。
【IPC分类】A61K45/00, A61K33/24, A61P35/04, A61K31/7105, A61K48/00, A61K31/282, A61P35/00
【公开号】CN105056250
【申请号】CN201510416470
【发明人】李向东, 于万鹏
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月15日