0. 568)和精子活动力（p= O. 472)改善更显著，接近正常水平。（见表1)
[0059] 表IICA和ICAII治疗对大鼠模型精液常规的影响
[0060]
[0061] *p〈0. 05,STZ组比较NC组、STZ组+ICA组及STZ+ICAII组具有显著统计学差异；
[0062]#p〈0. 05,STZ+ICAII组比较STZ组+ICA组具有显著统计学差异。
[0063] 生殖腺质量测定：用生殖腺质量/体重来表示生殖腺的相对重量。SD大鼠造模后 体重、睾丸质量、附睾质量和精囊腺质量均显著下降，经ICA和ICAII治疗后，体重无显著变 化（P= 0. 472)。与ICA治疗组相比，ICAII治疗后能显著提高大鼠模型的睾丸质量（p= 〇. 〇〇〇)、精囊腺质量（P= 〇. 024)、附睾质量（p= 0. 013)，结果见表2。
[0064] 表2ICA和ICAII治疗对大鼠模型体重和生殖腺质量的影响
[0065]
[0066] *p〈0. 05,STZ组比较NC组、STZ+ICA组和STZ+ICAII组具有显著统计学差异；
[0067]#p〈0. 05,STZ+ICA组比较STZ+ICAII组具有显著统计学差异。
[0068] 实施例3淫羊藿次苷II治疗生殖功能障碍大鼠模型睾丸组织病理学变化的效果
[0069] 取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织病理学检测：按苦味酸饱和液 (1. 22% )75ml、福尔马林25ml、冰醋酸5ml配制bouin氏液固定睾丸组织，Bouin液的用 量大约为组织的10倍，固定时间为24h。组织从bouin液取出后直接移入70%酒精中冲 洗。常规石蜡包埋，切片厚度5iim，HE染色。观察发现，正常对照组SD大鼠生精上皮厚度 为5. 0±1. 1层细胞，但是STZ组较正常对照组生精上皮厚度显著降低（2. 7±0. 8层，p= 0. 000)。STZ+ICA治疗组和STZ+ICAII治疗组，生精上皮厚度较STZ组均有不同程度提高。 但与ICA组相比，ICAII治疗后，生精上皮厚度较STZ组显著提高（4. 2± 1.2,p= 0.004) (图2)，接近正常对照组水平（p= 0. 1)，曲细精管内有大量的精子存在，在生精上皮中可观 察到处于精子发育不同时期的细胞（结果见图2)。
[0070] 实施例4 :淫羊藿次苷II对睾丸组织氧化还原水平的影响
[0071] 采用MDA检测试剂盒（S0131，碧云天，中国）对睾丸组织的脂质氧化水平进行评 估，探讨脂质氧化水平与睾丸生精功能之间的相关性。简要步骤为：在离心管内加入〇.Iml 裂解液或PBS作为空白对照，加入0.Iml不同浓度标准品MDA用于制作标准曲线，加入 0.Iml样品用于测定；随后加入0. 2mlMDA检测工作液；混匀后，KKTC或沸水浴加热15分 钟。水浴冷却至室温，1000 g室温离心10分钟。取200微升上清加入到96孔板中，随后用 酶标仪在532nm测定吸光度。计算出样品溶液中的MDA含量后，通过单位重量的蛋白含量 来表示最初样品中的MDA含量，单位为mmol/g蛋白。
[0072] 根据WST-I法检测睾丸组织中SOD活性。根据试剂盒说明书（S0102,碧云天，中 国）说明操作，将待测样品和其他溶液加入到96孔板中，37°C孵育30分钟，在波长450nm 处测定吸光度。抑制百分率计算公式为：抑制百分率=[(A空白对照1 一A空白对照2) - (A样品一A空白对照3)V(A空白对照1 一A空白对照2)照AA制。SOD酶活力的计算： 待测样品中SOD酶活力单位=抑制百分率八1 一抑制百分率）units。根据样本中蛋白浓度 和稀释倍数，将SOD活力单位换算为Units/mg蛋白。
[0073] SD大鼠造模后，STZ组较正常对照组脂质氧化水平（MDA含量）显著升高（p= 0. 006)。但是，STZ+ICA治疗组和STZ+ICAII治疗组较STZ组MDA含量相比显著降低； STZ+ICAII治疗组（p= 0? 009)更优于STZ+ICA治疗组，（p= 0? 034)。
[0074] SD大鼠造模后，STZ组较正常对照组睾丸组织内SOD酶活力降低明显（p= 0. 015)。但是，STZ+ICA治疗组和STZ+ICAII治疗组较STZ组SOD酶活力相比显著提高； STZ+ICAII治疗组（p= 0. 022)更优于STZ+ICA治疗组（p= 0. 649)。结果提示淫羊藿次 苷II比淫羊藿苷能更加有效的降低生殖功能障碍睾丸组织氧化还原水平，其机制可能与自 身的抗氧化水平有关，而并不是因为提高了SOD活力水平。
[0075] 表3ICA和ICAII治疗对STZ大鼠睾丸氧化还原水平的影响
[0076]
[0077] *p〈0. 01，STZ组比较NC组、STZ+ICA组和STZ+ICAII组具有显著统计学差异；
[0078] #p〈0. 05,STZ+ICA组比较STZ+ICAII组具有显著统计学差异。
[0079] 实施例5淫羊藿次苷II增强生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子生成标记 物Ki67表达的效果
[0080] 取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织增殖情况检测：睾丸石蜡包埋组 织4ym切片（参见实施例3)，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。以免疫组织化学染色法检测 睾丸内细胞增殖情况，切片微波修复，于微波炉中高火3min，低火IOmin;室温下在切片 滴加H2O2封闭内源性过氧化物酶；3 %山羊血清封闭；一抗为抗Ki67抗体（abeam公司， abl5580, 1:500)，4°C过夜，二抗用即用型快捷免疫组化试剂盒（KIT-5001，迈新，中国）， 37°C孵育 20min，DAB显色。
[0081] 观察结果发现（图3)，正常对照组（NC)睾丸精曲小管生精上皮中有大量生精细胞 增殖；STZ组比较NC组，诱导糖尿病合并生殖功能障碍模型大鼠睾丸生精上皮中增殖细胞 数量显著减少（P〈〇. 05)，仅靠近生精小管基底膜的一层细胞存在增殖现象；STZ+ICA治疗 组和STZ+ICAII治疗组比较STZ组，增殖生精细胞经ICA和ICAII治疗，增殖细胞数量均有 不同程度提高。其中STZ+ICAII组较STZ+ICA组，治疗后增殖细胞数量增加更显著（p〈0. 05) (结果见图3)。
[0082] 实施例6淫羊藿次苷II防治生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子凋亡的效 果
[0083] 取实施例2模型大鼠的睾丸组织进行睾丸组织凋亡情况检测：睾丸石蜡包埋组织 4iim切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水合。切片放入1 %TritonX-100通透液中，室温5min， IXPBS漂洗3次，每次5min。3%H202封闭内源性过氧化物酶，室温10min，lXPBS漂洗 3次，每次5min。睾丸组织凋亡检测使用凯基TUNEL细胞凋亡原位检测试剂盒（KGA7035， 凯基，中国）进行检测，具体过程见试剂说明书（KGA7035)。观察发现（图4)，正常对照组 (NC)睾丸精曲小管凋亡细胞罕见；STZ组较NC组睾丸生精上皮中凋亡细胞数量显著增多 (p〈0.05) ;STZ+ICA治疗组和STZ+ICAII治疗组较STZ组凋亡细胞数量均有不同程度减少。 STZ+ICAII组较STZ+ICA组凋亡细胞数量减少更显著（p〈0.05)(结果见图4)。
[0084] 实施例7淫羊藿次苷II防治生殖功能障碍大鼠模型睾丸曲细精管精子生成相关 Wnt/ 0-catenin信号通路的效果
[0085]Wnt/0-catenin信号通路在ICAII影响睾丸生精功能中的作用：全细胞蛋白提 取试剂盒提取蛋白（P0033,碧云天，中国），检测蛋白浓度并按实验分组标记。将样品放 入钠十二烷基硫酸盐聚丙烯酰胺凝胶电泳，随后转移到聚偏二氟乙烯膜上，封闭后分别加 入一抗GAPDH(FL-335,santacruz，USA, 1:2000)、Wntl(abl5251，Abeam,USA, 1:1000)及 3-catenin抗体（ab32572，Abcam，USA，l:200)。4°C过夜，次日加入二抗，电化学发光后通 过MolecularAnalyst图像分析软件分析每条条带的整合密度值（Integrateddensity value,IDV)。观察发现（图5)，正常对照组（NC)睾丸组织中Wnt/ 0 -catenin信号通路被 激活，信号分子Wntl和P-catenin高表达；STZ组较NC组睾丸生精上皮中凋亡细胞数量 显著增多（P〈〇. 05) ;STZ+ICA治疗组和STZ+ICAII治疗组较STZ组Wntl和P-catenin表 达量均有不同程度降低。其中STZ+ICAII组较STZ+ICA组Wntl和P-catenin表达量的影 响更显著（p〈〇. 05)。
[0086]小结：
[0087] 以上实施例的实验数据表明，按剂量浓度lmg/kg连续口服4周，ICAII可以改善 生殖功能障碍辜丸生精功能，增加精子数量，提商精子活动力，提商生殖腺质量（辜丸、精 囊）。与STZ组相比，经ICA、ICAII治疗后，睾丸组织脂质过氧化水平（MDA)显著降低，组 织中SOD酶活力显著升高，提示ICA、ICAII改善睾丸功能的机制，与调节睾丸组织的抗氧化 酶活性有关。
[0088]文献报道，Wnt/ @ -catenin通路对睾丸生精功能有重要影响，成熟睾丸中 sertoli细胞过量表达P-catenin可显著降低精原性母细胞的活性，促进生殖细胞的凋 亡。本研究中，与STZ组相比，ICA、ICAII治疗后，睾丸生精上皮中增殖细胞数量均有所 增加，凋亡细胞数量显著减少。但是，与ICA相比，ICAII在调节增殖细胞数量和凋亡细 胞数量方面更佳。此外，STZ组睾丸组织信号分子Wntl和P-catenin表达量显著增加 (p〈0. 05)