素（EPR)或epigen及其截短物或肽类似 物，包括LONG*? EGF (TGF a +14氨基酸的N-末端伸展肽的重组类似物）。
[0043] 在一个实施方案中，本发明的TM结合成纤维细胞生长因子受体，优选FGFJ。 这样的TMs的适合的实例包括成纤维细胞生长因子受体配体FGF及其截短物或肽类似 物，包括PG-FGF-I (FGF与蛋白聚糖（PG)核心蛋白的融合体）、碱性FGF ([Val112])、碱 性FGF(106-146)NH2)。其它适合的结合成纤维细胞生长因子受体的TMs详细描述在US 6294, 359中，将该文献完整的引入本文参考。
[0044] 在一个实施方案中，本发明的TM结合肽YY(PYY)受体，优选神经肽Y受体Y 1SY2c 这样的TMs的适合的实例包括肽YY及其截短物和肽类似物，包括PYY (22-36) (B頂-43004)、 PYY(1-36)、PYY(9-36)、PYY (14-36)、PYY (22-36)，PYY(27-36)。
[0045] 在一个优选的实施方案中，TM结合IL13受体，优选IL13Ra 1;还优选TM是IL13 肽或其截短物或肽类似物。
[0046] 易位结构域
[0047] 本发明的易位成分能够使非细胞毒性蛋白酶（或其片段）易位入靶细胞，以便蛋 白酶活性的功能表达发生在靶细胞胞液内。易位成分优选能够在低PH条件下在脂质膜（例 如内体膜）内形成离子可渗透孔。所述易位成分可以得自微生物蛋白来源，例如细菌或病 毒蛋白来源。因此，在一个实施方案中，所述易位成分包含酶的易位结构域或由其组成，例 如细菌毒素。在另一个实施方案中，所述易位结构域包含病毒蛋白的易位结构域或由其组 成。在一个实施方案中，本发明的易位成分可以包含梭菌神经毒素H-链或其片段例如梭菌 神经毒素的Hn结构域（或其易位片段）或由其组成。
[0048] 多肽制备
[0049] 本发明的多肽类包含3种主要成分：'生物活性成分'（即非细胞毒性蛋白酶）； TM;和易位结构域。与制备这的融合蛋白相关的通用技术通常称作再定向毒素技术。作 为示例。我们涉及：W094/21300 ;TO96/33273 ;TO98/07864 ;TO00/10598 ;TO01/21213 ; W006/059093 ;W000/62814 ;W000/04926 ;W093/15766 ;W000/61192 ;和 W099/58571。将所有 这些公开文献引入本文参考。
[0050] 更详细地，本发明的TM成分可以与本发明的蛋白酶成分或易位成分融合。所述融 合优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔基/连接分子进行。所述蛋白酶成分和易位 成分优选通过共价键例如直接共价键或通过间隔基/连接分子彼此连接。适合的间隔基/ 连接分子是本领域众所周知的，且典型地包含基于氨基酸的5 - 40个、优选10 - 30个氨 基酸残基长度的序列。
[0051] 在应用中，所述多肽类具有双-链构型，其中蛋白酶成分和易位成分优选通过二 硫键彼此连接。
[0052] 本发明的多肽类可以通过本领域技术人员众所周知的常规化学缀合技术制 备。作为实例，参照 Hermanson，G.T. (1996)，Bioconjugatetechniques, Academic Press 和 Wong, S.S. (1991), Chemistry of protein conjugation and cross-linking, CRC Press, Nagy等人，PNAS 95 pl794-99 (1998)。易于连接合成TMs与本发明多肽的其它详细 方法提供在例如EP0257742中。将上述举出的缀合出版物引入本文参考。
[0053] 或者，可以通过单一多肽融合蛋白的重组制备方法制备多肽类（参见，例如 TO98/07864)。这项技术基于体内细菌机制，通过该机制制备天然梭菌神经毒素（即全毒 素），且导致融合蛋白具有如下'简化'的结构排列：
[0054] NH2-[蛋白酶成分]-[易位成分]-[TM] -C00H
[0055] 根据W098/07864, TM定向于融合蛋白的C-末端。然后通过用蛋白酶处理活化该 融合蛋白，使其在蛋白酶成分与易位成分之间的位点上裂解。由此产生双_链蛋白，其包含 蛋白酶成分作为单一多肽链，其与包含易位成分+TM的另一单一多肽链共价连接（通过二 硫键）。
[0056] 或者，根据W006/059093,融合蛋白的TM成分面向蛋白酶裂解位点与易位成分之 间的线性融合蛋白序列的中间定位。这确保TM连接至易位结构域（即，如使用天然梭菌全 毒素发生的），尽管在这种情况中，两种成分以相对天然全毒素的次序反向。随后在蛋白酶 裂解位点上上裂解暴露TM的N-末端部分，并且提供双-链多肽融合蛋白。
[0057] 另一种选择在于融合蛋白的TM成分的'分裂配体'呈递。此处作为配体起作用 的TM成分具有游离N-末端结构域和游离C-末端结构域。因此，TM能够通过靶向部分 的N-末端部分与结合位点的结构域之间的相互作用与靶细胞上的结合位点（例如受体 (receptor)或受体（oracceptor))发生相互作用。或者，TM能够在祀向部分与结合位点 的结构域之间发生相互作用。或者，TM能够发生双重相互作用，其中靶向部分的N-末端部 分与结合位点的结构域发生相互作用，且靶向部分的C-末端部分与结合位点的结构域发 生相互作用。在这种后面的实施方案中，TM的N-和C-末端部分可以结合相同或不同的结 合位点结构域，和/或可以结合不同结合位点上的结构域。有关这种排列的另外的信息可 以在W02012/156743中找到，将该文献引入本文参考。
[0058] 可以通过常规方式例如定点诱变在DNA水平上导入上述举出的蛋白酶裂解序列 (和/或除去任意固有的序列）。证实存在裂解序列的筛选可以手动进行或在计算机软件 辅助下（例如DNASTAR，Inc.的MapDraw程序）进行。尽管可以使用任意蛋白酶裂解位点 (即梭菌属或非梭菌属），优选如下：
[0060] 另外的蛋白酶裂解位点包括被非细胞毒性蛋白酶例如被梭菌神经毒素切割的识 别序列。它们包括被非细胞毒性蛋白酶例如梭菌神经毒素裂解的SNARE(例如SNAP-25、突 触融合蛋白、VAMP)蛋白识别序列。具体实例提供在US2007/0166332中，将该文献完整地 引入本文参考。
[0061] 术语蛋白酶裂解位点还包括内蛋白，其为自我裂解的序列。例如，可通过改变存在 的还原剂的浓度控制自我剪接反应。还可以使用上述举出的'活化'裂解位点作为'毁坏性' 裂解位点（下述），如果一个被并入本发明的多肽。在一个优选的实施方案中，本发明的融 合蛋白可以包含一种或多种N-末端和/或C-末端定位的纯化标记。尽管可以使用任意纯 化标记，但是优选如下标记：
[0062] Hi S-标记（例如6X组氨酸）（SEQIDNO: 7)，优选为C-末端和/或N-末端标记
[0063]MBP-标记（麦芽糖结合蛋白），优选为N-末端标记
[0064]GST-标记（谷胱甘肽S-转移酶），优选为N-末端标记
[0065] Hi S-MBP-标记，优选为N-末端标记
[0066] GST-MBP-标记，优选为N-末端标记
[0067] 硫氧还蛋白-标记，优选为N-末端标记
[0068] CBD-标记（壳多糖结合结构域），优选为N-末端标记
[0069] 在所述融合蛋白中可以包括一种或多种肽间隔物/连接分子。例如，可以在纯化 标记与融合蛋白分子的其余部分之间使用肽间隔物。
[0070] 本发明还提供编码上述举出的融合蛋白的DNA序列。在本发明的一个优选的方面 中，将该DNA序列制备成DNA载体的部分，其中所述载体包含启动子和终止子。
[0071] 在一个优选的实施方案中，所述载体具有选自如下的启动子：
[0073] 优选通过计算机模拟（in silico)设计本发明的DNA构建体，且然后用通过常规 DNA合成技术合成。
[0074] 任选地根据将要使用的最终宿主细胞（例如大肠杆菌（E. coli))表达系统为偏性 密码子（codon-biasing)改变上述举出的DNA序列信息。
[0075] 优选筛选DNA主链的任意固有核酸序列，当转录和翻译时，其可以产生相当于由 编码第二种肽的序列编码的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列。这种筛选可以手动进行或在计 算机软件（例如DNASTAR, Inc?的MapDraw程序）的辅助下进行。
[0076] 本文所涉及的"抑制"和"治疗"是指给受试者提供治疗有益性的方式。它包括， 例如施用如本文所定义的融合蛋白以预防骨质疏松症或减轻骨质疏松症的严重性。
[0077] 本发明的另一个方面提供预防或抑制骨质疏松症的方法，其中该方法包括对所述 受试者施用治疗有效量的融合蛋白，其包含：
[0078] (i)非细胞毒性蛋白酶，该蛋白酶能够裂解肠嗜铬细胞中的SNARE蛋白；
[0079] (ii)能够结合到肠嗜络细胞上的结合位点的革El向部分（I'M)，所述结合位点能够 进行胞吞作用以并入肠嗜铬细胞内的内体，且其中所述肠嗜铬细胞表达所述SNARE蛋白； 和
[0080] (iii)能够使所述蛋白酶从内体内易位、通过内体膜并且进入肠嗜铬细胞胞液的 易位结构域；
[0081] 条件是所述多肽不是梭菌神经毒素（全毒素）分子。
[0082] 本发明的融合蛋白可以包括毁坏性蛋白酶裂解位点，其对融合蛋白可能迀移至非 位点位置的情况中的裂解（被局部蛋白酶）敏感。这种方法有助于将脱离靶向位点的风险 降至最低限度。因此，可以将本发明的融合蛋白设计成包括一个或多个毁坏性裂解位点，例 如如W02010/094905和W02002/44199中所述-将这些对比文件各自完整地引入本文参 考。
[0083] 多肽递送
[0084] 在应用中，本发明使用药物组合物，其包含多肽与至少一种选自药学上可接受的 载体、赋形剂、佐剂、推进剂和/或盐的成分。
[0085]本发明的多肽类可以配制为口服、胃肠外、连续输注、植入、吸入或局部应用。适合 于注射的组合物可以是溶液、混悬液或乳剂形式，或在使用前溶于或混悬于适合的媒介物 的干粉。
[0086] 局部递送方式可以包括口服或胃递送。在这方面，可以使用包肠溶衣胶囊或其它 颗粒系统例如微球形式的制剂。通过腹腔镜手术局部施用于十二指肠也是可能的。局部递 送的其它实例还可以包括透皮递送（通过粘着贴剂）。
[0087]优选的施用途经选自：全身、口服、腹腔镜和/或限局性注射。
[0088] 在注射用制剂的情况中，任选地包括药物活性物质以有助于使多肽保留在施用部 位上或减少从施用部位除去多肽。这样的药物活性物质的一个实例是血管收缩剂，例如肾 上腺素。这样的制剂赋予增加施用后多肽保留时间且由此增加和/或增强其效果的优点。 [0089]施用本发明多肽类的剂量范围是产生期望的治疗效果的那些。可以理解所需的剂 量范围取决于多肽或组合物的性质、施用途经、制剂的性质、患者年龄、患者病症的性质、程 度或严重性、禁忌证（如果有的话）和主治医师的判断。可以使用标准实验途经调整这些 剂量水平的变化用于优化。
[0090] 适合的每日剂量（/kg患者体重）是0? 0001-lmg/kg，优选0? 0001-0. 5mg/kg，更优 选0? 002-0. 5mg/kg，且特别是优选0? 004-0. 5mg/kg。单位剂量可以在低于1微克至30mg 之间改变，但典型地在〇. 01至lmg/剂量区间，可以每日或优选以较低频率施用，例如每周 施用或每6个月施用。
[0091] 特别优选的施药方案基于2. 5ng多肽作为IX剂量。在这方面，优选的剂量在 IX - 100X(即 2. 5-250ng)。
[0092]典型地使用所述多肽和无热原灭菌媒介物制备流体剂型。根据所用媒介物和浓度 不同改变的多肽可以溶于或混悬于该媒介物。在制备溶液的过程中，可以将多肽溶于媒介 物，如果必要，通过添加氯化钠使该溶液等渗并且使用无菌技术通过灭菌滤器灭菌，然后填 充入适合的灭菌小瓶或安瓿并且密封。或者，如果溶液稳定性足够，则可以通过高压灭菌使 在其密封容器中的溶液灭菌。可以将有利的添加剂例如缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或 杀菌剂、助悬剂或乳化剂和/或局部麻醉剂溶于媒介物。
[0093]可以通过使用无菌技术在无菌区将预先灭菌的成分填充入无菌容器制备在使用 前溶于或混悬于适合的媒介物的干粉。或者，可以使用无菌技术在无菌区将所述成分溶入 适合的容器。然后将产品冷冻干燥并且无菌密封容器。
[0094]基本上按照相同方式制备适合于肌内、皮下或皮内注射的胃肠外混悬液，除外将 无菌成分混悬于无菌媒介物而不是将其溶解且不能通过过滤进行灭菌。
[0095]可以以无菌状态分离所述成分，或者可以在分离后，例如通过Y射线照射将所述 成分灭菌。
[0096] 有利地，组合物中包括助悬剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，以便有利于成分均匀分布。
[0097] 本发明的施用可以利用各种递送技术，包括微粒包囊、病毒递药系统或高压气雾 剂碰撞。
[0098] 定义部分
[0099]靶向部分（TM)是指在功能上与结合位点发生相互作用以导致本发明多肽与靶细 胞表面之间的物理结合的任意化学结构。在本发明的上下文中，靶细胞是肠嗜铬细胞。术 语TM包括能够结合靶细胞上的结合位点的任意的分子（即天然存在的分子或其化学/物 理学修饰的变体），所述结合位点能够内化（例如内体形成）-也称作受体-介导的胞吞作 用。TM可以具有内体膜易位功能，在这种情况中，无需分开的TM和易位结构域成分存在于 本发明的活性剂中。在上述通篇描述中，描述了特定TMs。涉及的所述TMs仅是示例性的， 且本发明包括其所有的变体和衍生物，它们保留了示例性TMs的基本结合（即靶向）能力。
[0100] 本发明的TM包括抗体（例如抗体片段）和结合骨架；尤其是为结合（例如特异 性）靶细胞目的设计的商购抗体/片段和骨架。
[0101] 蛋白质骨架代表新一代补充治疗性单克隆抗体和衍生物例如scFvs、Fab分子、 dAbs (单结构域抗体）、camelids、双体和minibodies的伸展的所有组成成分的通用结合构 架，它们各自可以用作本发明