的TM。骨架系统通过生成新的骨架或修饰已知蛋白质结合结 构域生成或改变已知的蛋白质识别结构域。这样的骨架包括、但不限于：
[0102] ⑴基于蛋白质A的骨架-亲合体（affibodies) (Nord, K?等人1997 "Binding proteins selected from combinatorial libraries of an alpha-helical bacterial receptor domain^ . Nat Biotechnol15, 772 - 777)；
[0103] (ii)基于脂质运载蛋白的骨架-模拟抗体（anticalins) (Skerra 2008 "Alternative binding proteins:antical ins-harnessing the structural plasticity of the lipocalin ligand pocket to engineer novel binding activities^. FEBS J. 275:2677-83)；
[0104] (iii)基于纤连蛋白的骨架-adnectin(Dineen 等人 2008 "The Adnectin CT_322is a novel VEGF receptor 2inhibitor that decreases tumor burden in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer" ? BMC Cancer 8:352)；
[0105] (iv) avimers (Silverman 等人 2005 "Multivalent avimer proteins evolved by exon shuffling of a family of human receptor domai ns" .Nat Biotechnol 23:1556-61)；
[0106] (v)基于固定蛋白的骨架-darpins (Zahnd 等人 2006 "Selection and characterization of Her2 binding-designed ankyrin repeat proteins". J Biol Chem. 281:35167-75);和
[0107] (vi)centyrin骨架-基于蛋白质折叠，其具有与带有类似于⑶Rs的环的Ig结构 域的显著结构同源性。Ig结构域是人体蛋白质中常见的组件且已经广泛应用于可选的骨架 蛋白。将上述'骨架'出版物各自（以其完整的形式）引入本文参考。
[0108] 结合骨架可以用于通过与特异性细胞表面蛋白、受体或其它细胞表面表位例如糖 基发生相互作用靶向特定细胞类型。这样修饰的骨架可以被改造在本发明基于重组非细胞 毒性蛋白酶的多肽类上。
[0109]本发明的TM结合（优选特异性结合）所述肠嗜铬靶细胞。术语"特异性结合"优 选是指指定TM以具有IO6M1或以上、优选IO7M1或以上、更优选IO 8M1或以上且最优选IO9M1 或以上的结合亲和力（Ka)结合靶细胞。术语"特异性结合"还可以指指定TM以IO6M1或 以上、优选IO 7M 1或以上、更优选IO8M 1或以上且最优选IO9M 1或以上的结合亲和力（Ka)结 合指定受体、IL13受体（例如IL13R a 1);生长抑素受体（例如SSTR2或SSTR5) ;VPAC受体 (例如 VPAC1S VPAC 2) ;TGF f3 I 受体（例如 TGF f3 RI 或 TGF f3 RII);速激肽受体（例如 TAC1 或TAC2) ; y -氨基丁酸（GABA)受体（例如GABAa受体，特别是a 6或P 2);表皮生长因子 (EGF)受体（例如EGFr);成纤维细胞生长因子受体（例如FGFJ);或肽YY(PYY)受体（例 如神经肽Y受体Y1S Y 2)。
[0110] 本说明书中涉及的TM包括其片段和变体，它们保留结合到所述靶细胞的能力。作 为实例，变体可以与所称TM(例如本说明书中出现的任意SEQ ID N0,其定义一种TM)具有 至少80%、优选至少90%、更优选至少95 %且最优选至少97或至少99 %的氨基酸序列同 源性。因此，变体可以包括氨基酸的（例如非天然氨基酸）一种或多种类似物或取代键。此 外，作为实例，术语片段在用于涉及TM时是指具有所称TM的至少10个、优选至少20个、更 优选至少30个且最优选至少40个氨基酸残基的肽。术语片段还涉及上述举出的变体。因 此，作为实例，本发明的片段可以包含具有至少10、20、30或40个氨基酸的肽序列，其中所 述肽序列与所称肽的氨基酸的相应肽序列（连续）相比具有至少80%的序列同源性。
[0111] 证实TM结合到所选择的靶细胞是常规的。例如，可以使用单纯放射性置换实验， 其中使所述靶细胞的组织或细胞代表在过量未标记的TM的存在下暴露于标记的（例如氚 标记的）TM。在这一实验中，可以评价非特异与特异结合的相对比例，由此能够证实TM结合 靶细胞。任选地，试验可以包括一种或多种结合拮抗剂，且试验还可以包括观察TM结合的 损失。这种类型的实验的实例可以在Hulme, E.C. (1990) ,Receptor-binding studies,概 要，pp. 303-311，In Receptor biochemistry, Practical Approach, Ed. E. C. Hulme, Oxford University Press〇
[0112] 在本发明的上下文中，涉及的肽TM包括其肽类似物，只要该类似物结合与相应 '参比' TM相同的受体。所述类似物可以包括合成残基，例如：
[0113] P-Nal = P -萘基丙氨酸
[0114] P-Pal = P -吡啶基丙氨酸
[0115] hArg (Bu) = N-胍基-(丁基）-高精氨酸
[0116] hArg (Et) 2 = N，N' -胍基-(二甲基）-高精氨酸
[0117] hArg(CH2CF3)2 = N，N' -胍基-双-(2,2,2，-三氟乙基）-高精氨酸
[0118] hArg(CH3,己基）=N，N'-胍基-(甲基，己基）-高精氨酸
[0119] Lys (Me) = Ne-甲基赖氨酸
[0120] Lys (iPr) = Nf5-异丙基赖氨酸
[0121] AmPhe =氨基甲基苯丙氨酸
[0122] AChxAla =氨基环己基丙氨酸
[0123] Abu= a-氨基丁酸
[0124] Tpo = 4-硫代脯氨酸
[0125] MeLeu = N-甲基亮氨酸
[0126] 〇rn=鸟氨酸
[0127] Nle-正亮氨酸
[0128] Nva=正缬氨酸
[0129] Trp (Br) = 5-溴-色氨酸
[0130] Trp (F) = 5-氟-色氨酸
[0131] Trp (NO2) = 5-硝基-色氨酸
[0132] Gaba= y-氨基丁酸
[0133] Bmp= J-疏丙酰
[0134] Ac=乙酰基
[0135] Pen-青霉胺
[0136] 本发明的融合蛋白（本文也称作多肽类）可以缺乏梭菌神经毒素的功能性Hc或 Hcx结构域。在一个实施方案中，所述多肽类缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后50个C-末端氨 基酸。在另一个实施方案中，所述多肽类缺乏梭菌神经毒素全毒素的最后100、150、200、250 或300个C-末端氨基酸残基。或者，可以通过诱变消除/降低He结合活性-作为实例，为 便利起见涉及的BoNT/A，改变神经节苷脂结合袋中的一个或两个氨基残基突变（W1266 -L 和Y1267 -F)导致氏区失去其受体结合功能。可以对非血清型A梭菌属肽成分进行类似突 变，例如基于具有突变的肉毒菌毒素B(W1262 -L和Y1263 -F)或肉毒菌毒素E(W1224 - L和Y1225 -F)的构建体。对活性位点的其它突变实现了He受体结合活性的相同消除，例 如肉毒菌毒素型A毒素中的Y1267S和其它梭菌神经毒素中相应的高度保守的残基。这种 和其它突变的细节描述在Rummel等人（2004) (Molecular Microbiol. 51:631-634)中，将 该文献引入本文参考。
[0137] 天然梭菌神经毒素的HJ太包含约400-440个氨基酸残基，且由各自约25kDa的两 种功能不同的结构域组成，即N-末端区（通常称作Hcn肽或结构域）和C-末端区（通常 称作H ee肽或结构域）。此外，充分记录了构成C-末端160-200个氨基酸残基的C-末端区 (Hcc)负责使梭菌神经毒素结合其天然细胞受体，即结合神经肌肉接点上的神经末梢。因此， 本说明书通篇涉及的梭菌属重-链缺乏功能性重链HJ太（或结构域），使得该重-链不能 结合天然梭菌神经毒素所结合的细胞表面受体，这意味着梭状芽胞杆菌重_链仅是缺乏功 能性太。换句话说，太区域部分或完全缺失，否则被修饰（例如通过常规的化学或蛋 白水解处理），以使其对神经肌肉接点上的神经末梢的天然结合能力失活。
[0138]因此，在一个实施方案中，本发明的梭菌属Hn肽缺乏梭菌神经毒素的部分C-末端 肽部分（H ee)且由此缺乏天然梭菌神经毒素的氏结合功能。作为实例，在一个实施方案中， C-末端延伸的梭菌属&肽缺乏梭菌神经毒素重-链的C-末端40个氨基酸残基或C-末端 60个氨基酸残基或C-末端80个氨基酸残基或C-末端100个氨基酸残基或C-末端120个 氨基酸残基或C-末端140个氨基酸残基或C-末端150个氨基酸残基或C-末端160个氨 基酸残基。在另一个实施方案中，本发明的梭菌属&肽缺乏梭菌神经毒素的完整的C-末 端肽部分（H ee)且由此缺乏天然梭菌神经毒素的氏结合功能。作为实例，在一个实施方案 中，梭菌属&肽缺乏梭菌神经毒素重-链的C-末端165个氨基酸残基或C-末端170个氨 基酸残基或C-末端175个氨基酸残基或C-末端180个氨基酸残基或C-末端185个氨基 酸残基或C-末端190个氨基酸残基或C-末端195个氨基酸残基。作为另一个实例，本发 明的梭菌属Hn肽缺乏梭菌属H 参比序列，其选自：
[0139] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（Ylll 1-L1296)
[0140] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（Y1098-E1291)
[0141] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（Y1112-E1291)
[0142] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（Y1099-E1276)
[0143] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（Y1086-K1252)
[0144] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（Y1106-E1274)
[0145] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（Y1106-E1297)
[0146] 破伤风神经毒素-氨基酸残基（Y1128-D1315)
[0147] 上述举出的参比序列应被视为指导，因为适度改变可以根据亚血清型进行。
[0148] 本发明的蛋白酶包括所有非细胞毒性蛋白酶，它们能够裂解真核细胞中细胞外融 合器的一种或多种蛋白质。
[0149] 本发明的蛋白酶优选是细菌蛋白酶（或其片段）。更优选所述细菌蛋白酶选自梭 菌属（Clostridium)或奈瑟球菌属（Neisseria)/链球菌属（Streptococcus)(例如梭菌属 L-链或奈瑟球菌属IgA蛋白酶，其优选自淋病奈瑟氏球菌或肺炎链球菌）。另一个非细胞 毒性蛋白酶的实例包括蝎子毒液蛋白酶，例如来自巴西全蝎巴西钳蝎的毒液的那些或蛋白 antarease〇
[0150] 本发明还包括变体非细胞毒性蛋白酶（即天然存在的蛋白酶分子的变体），只要 该变体蛋白酶仍然显示必需的蛋白酶活性。作为实例，变体可以与参比蛋白酶序列具有至 少70 %、优选至少80 %、更优选至少90 %且最优选至少95 %或至少98 %的氨基酸序列同源 性。因此，术语变体包括具有增强（或降低的）内肽酶活性的非细胞毒性蛋白酶-本文特 别举出的是增加的BoNT/A突变体Q161A、E54A和K165L的Kcat/Km，参见Ahmed, S. A. (2008) Protein J. DOI 10. 1007/sl0930-007-9118-8,将该文献引入本文参考。术语片段在涉及蛋 白酶使用时典型地是指具有参比蛋白酶的至少150个、优选至少200个、更优选至少250且 最优选至少300个氨基酸残基的肽。与TM '片段'成分（上述）一样，本发明的蛋白酶'片 段'包括基于参比序列的变体蛋白酶的片段。
[0151] 本发明的蛋白酶优选显示丝氨酸或金属蛋白酶活性（例如内肽酶活性）。所述蛋 白酶优选对SNARE蛋白（例如SNAP-25、突触泡蛋白/VAMP或突触融合蛋白）具有特异性。
[0152] 特别举出的是神经毒素蛋白酶结构域，例如细菌神经毒素的蛋白酶结构域。因此， 本发明包括天然发生的神经毒素结构域以及所述天然发生神经毒素的重组制备形式的用 途。
[0153] 示例性神经毒素由梭菌属产生，且术语梭菌神经毒素包括由破伤风梭菌 (C. tetani) (TeNT)和肉毒梭菌（C. botulinum) (BoNT)血清型A-G产生的神经毒素以及由巴 氏梭菌（C. baratii)和拜氏梭菌（C. butyricum)产生的紧密相关的BoNT-样神经毒素。上 述举出的缩写在本说明书中通篇使用。例如，命名BoNT/A表示神经毒素来源为BoNT (血清 型A)。相应的命名适用于其它BoNT血清型。
[0154] BoNTs是已知最有效的毒素，其对小鼠的半数致死剂量（LD50)值为0. 5 - 5ng/ kg，视血清型的不同而定。BoNTs在胃肠道中吸收，且在进入全身循环之后，结合胆碱能神 经末梢的突触前膜并且防止其神经递质乙酰胆碱释放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G 裂解突触泡蛋白/小泡缔合性膜蛋白（VAMP) ;B〇NT/C、B〇NT/A和BoNT/E裂解25kDa的突触 体-缔合性蛋白（SNAP-25);且BoNT/C裂解突触融合蛋白。
[0155] BoNTs共有共同的结构，其为~150kDa的双-链蛋