白，由通过单一二硫键共价连 接~50kDa轻链（L-链）的~IOOkDa重链（H-链）组成。H-链由两个各自~50kDa的结 构域组成。C-末端结构域（H e)是高度亲和神经元结合所需的，而N-末端结构域（Hn)被提 议牵涉膜易位。L-链是负责裂解底物SNARE蛋白的锌-依赖性金属蛋白酶。
[0156] 术语L-链片段是指神经毒素的L-链成分，该片段显示金属蛋白酶活性且能够以 蛋白水解方式裂解牵涉细胞胞吐作用的囊泡和/或质膜相关蛋白。
[0157] 适合的蛋白酶（参比）序列的实例包括：
[0158] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（1-448)
[0159] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（1-440)
[0160] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（1-441)
[0161] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（1-445)
[0162] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（1-422)
[0163] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（1-439)
[0164] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（1-441)
[0165] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（1-457)
[0166] IgA蛋白酶 -氨基酸残基（1-959)*
[0167] *Pohlner, J?等人（1987) .Nature 325, pp. 458-462,将该文献引入本文参考。
[0168] 上述举出的参比序列应被视为指导，因为适度改变可以根据亚血清型进行。作为 实例，US 2007/0166332(引入本文参考）引述了适度不同的梭菌属序列：
[0169] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（M1-K448)
[0170] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（M1-K441)
[0171] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（M1-K449)
[0172] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（M1-R445)
[0173] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（M1-R422)
[0174] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（M1-K439)
[0175] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（M1-K446)
[0176] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（M1-A457)
[0177] 包含轻链的各种梭菌属毒素片段可以用于本发明的各方面，条件是这些轻链片段 可以特异性地靶向神经递质释放器的核心成分且由此参与执行完整的细胞机制，借此梭菌 属毒素以蛋白水解方式裂解底物。梭菌属毒素的轻链约为420-460个氨基酸长度且包含酶 结构域。研究证实全长梭菌属毒素轻链并非酶结构域的酶活性所必需的。作为非限制性 实例，BoNT/A轻链的前8个氨基酸并非酶活性所必需的。作为另一个非限制性实例，TeNT 轻链的前8个氨基酸并非酶活性所必需的。同样，轻链的羧基末端并非活性所必需的。作 为非限制性实例，BoNT/A轻链的最后32个氨基酸（残基417-448)并非活性所必需的，作 为另一个非限制性实例，TeNT轻链的最后31个氨基酸（残基427-457)并非酶活性所必需 的。因此，该实施方案的方面可以包括包含酶结构域的梭菌属毒素轻链，所述酶结构域具有 例如至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸和至少 450个氨基酸的长度。该实施方案的其它方面可以包括包含酶结构域的梭菌属毒素轻链，所 述酶结构域具有例如至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425 个氨基酸和至多450个氨基酸的长度。
[0178] 适合的非细胞毒性蛋白酶的另外的实例详细描述在W02007/106115中，将该文献 完整地引入本文参考。
[0179] 在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶裂解非神经元SNARE蛋白，例如SNAP-23 蛋白。在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是能够裂解SNAP-23的修饰的肉毒毒素 L-链。这样的修饰的L-链的实例由Chen和Barbieri描述在PNAS，第106卷，第23 期，P9180-9184, 2009 中。
[0180] 在一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是BoNT/A、BoNT/C或BoNT/E蛋白酶，且优 选的SNARE基元（motif)是SNAP (例如SNAP 25)基元。
[0181] 在另一个实施方案中，非细胞毒性蛋白酶是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F或BoNT/G或 破伤风神经毒素（TeNT)蛋白酶，且优选的SNARE基元是VAMP基元。在另一个实施方案中， 非细胞毒性蛋白酶是B 0OTVC1蛋白酶，且优选的SNARE基元是突触融合蛋白基元。
[0182] 本发明的非细胞毒性蛋白酶识别不同的裂解位点序列且由此具有适度不同的裂 解特异性。
醇化是特别优选的。聚乙二醇化优选包括将PEG添加至蛋白酶成分的N-末端。作为实例， 蛋白酶的N-末端可以被一个或多个氨基酸（例如半胱氨酸）残基延伸，所述氨基酸残基可 以相同或不同。所述氨基酸残基的一个或多个可以具有与之连接（例如共价连接）的其自 身的PEG分子。这项技术的实例描述在W02007/104567中，将该文献完整地引入本文参考。
[0190] 易位结构域是能够使蛋白酶易位入靶细胞的分子，使得蛋白酶活性的功能性表达 出现在靶细胞的胞液内。任意的分子（例如蛋白质或肽）是否具有本发明必需的易位功能， 均可以通过众多常规测定法的任意一种证实。
[0191] 例如，Shone C. (1987)描述了使用用测试分子攻击的脂质体的体外测定法。必需 易位功能的存在通过可以易于监测的K+和/或标记的NAD从脂质体中释放得以证实[参 见 Shone C. (1987)Eur. J. Biochem ;第 167 卷（I):pp. 175-180]〇
[0192] 另一个实例由Blaustein R. (1987)提供，其描述使用平面磷脂双层膜的简单体外 测定法。用测试分子攻击所述膜并且根据通过所述膜的导电性增加证实必需的易位功能 [参见 Blaustein(1987)FEBS Letts ;第 226 卷，第 1 期：pp. 115-120]。
[0193] 适用于本发明的能够评价膜融合和由此的易位结构域鉴定的另外的方法由 Methods in Enzymology 第 220 和 221 卷，Membrane Fusion Techniques,第 A 和 B 部 分，Academic Press 1993 提供。
[0194] 本发明还包括变体易位结构域，只要该变体结构域仍然显示必需的易位活性。作 为实例，变体可以与参比易位结构域具有至少70%、优选至少80%、更优选至少90%且最 优选至少95%或至少98%的氨基酸序列同源性。术语片段在涉及易位结构域使用时是指 具有参比易位结构域的至少20个、优选至少40个、更优选至少80个且最优选至少100个 氨基酸残基的肽。在梭菌属易位结构域的情况中，片段优选具有参比易位结构域的至少100 个、优选至少150个、更优选至少200个且最优选至少250个氨基酸残基（例如Hn结构域）。 与TM '片段'成分（上述）一样，本发明的易位'片段'包括基于参比序列的变体易位结构 域的片段。
[0195] 易位结构域优选能够在低pH条件下在脂质膜中形成离子可渗透的孔。优选发现 仅使用能够在内体膜内形成孔的蛋白质分子的那些部分。
[0196] 易位结构域可以得自微生物蛋白质来源，特别是得自细菌或病毒蛋白来源。因此， 在一个实施方案中，易位结构域是酶例如细菌毒素或病毒蛋白的易位结构域。
[0197] 充分证明了的是细菌毒素分子的一些结构域能够形成这样的孔。还已知病毒表达 的膜融合蛋白的一些易位结构域能够形成这样的孔。这样的结构域可以用于本发明。
[0198]易位结构域可以具有梭菌属来源，例如Hn结构域（或其功能成分）。1^是指近似 等同于半个H-链的氨基-末端的梭菌神经毒素的H-链的部分或片段或相当于完整H-链 中的片段的结构域。在这方面，如果期望除去H e细胞结合功能，这可以通过使H ^或H 氨基 酸序列缺失进行（在DNA合成水平或合成后水平上，通过核酸酶或蛋白酶处理）。或者，可 以通过化学或生物学处理使H c功能失活。
[0199] 适合的（参比）易位结构域的实例包括：
[0200] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（449-871)
[0201] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（441-858)
[0202] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（442-866)
[0203] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（446-862)
[0204] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（423-845)
[0205] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（440-864)
[0206] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（442-863)
[0207] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（458-879)
[0208] 上述举出的参比序列应被视为指导原则，因为适度改变可以根据亚-血清型的不 同发生。作为实例，US 2007/0166332(将该文献引入本文参考）引述了适度不同的梭菌属 序列：
[0209] 肉毒菌毒素A型神经毒素-氨基酸残基（A449-K871)
[0210] 肉毒菌毒素B型神经毒素-氨基酸残基（A442-S858)
[0211] 肉毒菌毒素C型神经毒素-氨基酸残基（T450-N866)
[0212] 肉毒菌毒素D型神经毒素-氨基酸残基（D446-N862)
[0213] 肉毒菌毒素E型神经毒素-氨基酸残基（K423-K845)
[0214] 肉毒菌毒素F型神经毒素-氨基酸残基（A440-K864)
[0215] 肉毒菌毒素G型神经毒素-氨基酸残基（S447-S863)
[0216] 破伤风神经毒素 -氨基酸残基（S458-V879)
[0217] 适合的易位结构域的另外的实例详细描述在W02007/106115中，将该文献完整地 引入本文参考。
[0218] 在本发明的上下文中，包含易位结构域的各种梭菌属毒素Hn区可以用于本发明的 各方面，条件是这些活性片段可以有利于非细胞毒性蛋白酶（例如梭菌属的L-链）从胞内 囊泡中释放进入靶细胞的细胞质且由此参与执行全部细胞机制，借此梭菌属毒素以蛋白水 解方式裂解底物。来自梭菌属毒素的重链的Hn区约为410-430个氨基酸长度且包含易位结 构域。研究证实来自梭菌属毒素重链的Hn区的全长对于易位结构域的易位活性并非必要。 因此，该实施方案的各方面可以包括梭菌属毒素Hn区，其包含具有例如至少350个氨基酸、 至少375个氨基酸、至少400个氨基酸和至少425个氨基酸长度的易位结构域。该实施方 案的其它方面可以包括梭菌属毒素&区，其包含具有例如至多350个氨基酸、至多375个 氨基酸、至多400个氨基酸和至多425个氨基酸长度的易位结构域。
[0219] 对于有关肉毒梭菌（Clostridium botulinum)和破伤风梭菌（C. tetani)中 的毒素产生的遗传基础的另外的详细内容，我们参考Henderson等人（1997)的The Clostridia:Molecular Biology and Pathogenesis, Academic press (学术出版社）。
[0220] 术语Hn包括天然存在的神经毒素Hn蛋白质和具有天然不存在的氨基酸序列和/ 或合成氨基酸残基的修饰的Hn部分，只要修饰的H N部分仍然显示上述的易位功能。
[0221] 或者，易位结构域可以具有非梭菌属来源。非梭菌属（参比）易位结构域来 源的实例包括、但不限于白喉毒素的易位结构域[0 = Keefe等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1992)89,6202-6206;Silverman 等人，J.Biol. Chem. (1993)269,22524-22532; and London, E. (1992) Biochem. Biophys. Acta.，1112, pp. 25-51]、假单胞菌外毒素 A 型 易位结构域[Prior等人Biochemistry (1992) 31，3555-3559]、炭疽毒素的易位结构域 [Blanke 等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996) 93, 8437-8442]、易位功能的各种融合或 疏水性肽类[Plank 等人 J.Biol. Chem. (1994) 269, 12918-12924;和 Wagner 等人（1992) PNAS, 89, pp. 7934-7938]和两亲肽类[Murata 等人（1992) Biochem.，31，pp. 1986-1992]。易 位结构域可以反映以天然存在蛋白质形式存在的易位结构域或可以包括氨基酸变化形式， 只要这些变化形式不会破坏易位结构域的易位能力即可。
[0222] 适用于本发明的病毒（参比）易位结构域的具体实例包括病毒表达的膜融合蛋白 的一些易位结构域。例如，Wagner等人（1992)和Murata等人（1992)描述了来源于流感 病毒血细胞凝集素的N-末端区的许多融合和两亲肽类的易位（即膜融合和囊泡化）功能。 已知具有需要的易位活性的其它病毒表达的膜融合蛋白是西门利克森林病毒（SFV)融合 肽的易位结构域、水泡性口炎病毒（VSV)糖蛋白G的易位结构域、SER病毒F蛋白的易位结 构域和泡沫病毒包膜糖蛋白的易位结构域。病毒编码的Aspike蛋白在本发明上下文中具 有特别的应用，例如SFV的El蛋白和VSV的G蛋白的G蛋白。
[0223] 表（下）中列出的（参比）易位结构域的用途包括其序列变体的用途。变体可 以包含一种或多种保守核酸取代和/或核酸缺失或插入，条件是该变体具有必需的易位功 能。变体还可以包含一种或多种氨基酸取代和/或氨基酸缺失或插入，只要该变体具有必 需的易位功能。
[0226] 本发明的多肽类还可以包含有利于易位的结构域。所述结构域有利于将非细胞毒 性蛋白酶递送入靶细胞的胞液并且描述在例如W008/008803和W008/008805中，将这些文 献各自引入