实施方式】
[0044] 下面，参照附图对本发明的第1实施方式的造影剂1及其制造方法进行说明。
[0045] 如图1所示，本实施方式的造影剂1具备：能进行超声波造影的基材2、以及修饰 在该基材2的表面的至少1个分子探针3~5和至少1个光学探针6。
[0046] 基材2由在内部内包有全氟己烷、表面进行了聚乙二醇化的脂质体构成。全氟己 烷为不溶于水的物质，其具有如下性质：通过以某一阈值以上的强度照射超声波而相变为 气体。即，通过相变为气体，可发挥超声波造影功能。
[0047] 分子探针3~5包括标记于基材2的表面的偶联用的第1分子探针3、标记于光学 探针6上的第2分子探针4、以及标记第1分子探针3的靶向用的第3分子探针5。
[0048] 作为第1分子探针3,例如使用生物素。
[0049] 作为第2分子探针4,例如使用链亲和素。
[0050] 作为第3分子探针5，例如使用CCA1抗体。
[0051] 作为光学探针6,例如使用AlexaFluor(AF)647。
[0052] 下面，对如此构成的本实施方式的造影剂1的制造方法进行说明。
[0053] 如图2所示，本实施方式的造影剂1的制造方法包括下述步骤：第1步骤S1，将第 1分子探针3标记于基材2的表面，生成第1溶液；第2步骤S2,将光学探针6标记于第2 分子探针4上，生成第2溶液；第3步骤S3,将第3分子探针5标记于第1分子探针3上， 生成第3溶液；第4步骤S4,将第2步骤中生成的第2溶液与第3步骤中生成的第3溶液 混合，生成第4溶液；第5步骤S5,将第4步骤S4中生成的第4溶液混合到第1步骤S1中 生成的第1溶液中，进行反应；以及第6步骤S6,对该第5步骤S5中生成的混合液进行离 心分离。
[0054] 即，在第1步骤S1中，生成第1溶液，该第1溶液包含在基材2的表面标记有生物 素3的生物素化纳米液滴；在第2步骤S2中，将AF6476标记于链亲和素4上，生成第2溶 液；在第3步骤S3中，将生物素3标记于CCA1抗体5上，生成包含生物素化CCA1抗体的第 3溶液。
[0055] 然后，在第4步骤S4中，将第2溶液（例如，0?4 yM)与第3溶液（例如，0?4 yM) 混合，静置15分钟使其复合化，由此生成第4溶液。并且，在第5步骤S5中，将第1溶液的 稀释（例如，稀释至20倍）液（例如，50 y L)与第4溶液（例如，50 y L)混合，例如在4°C 下反应30分钟。由此，将CCA1抗体和AF6476同时修饰于造影剂的基材2的表面。
[0056] 进而，在第6步骤S6中，将第5步骤S5中生成的混合液在例如3000G下进行5分 钟离心分离，由此制造本实施方式的造影剂1。在本步骤中，将未修饰于造影剂1上的游离 的复合物与造影剂分离并去除。
[0057] 此处，重要的是：在第4步骤S4之前进行第3步骤S3 ;在第4步骤S4中，将第2 溶液与第3溶液以摩尔比1:1进行混合；以及在第5步骤S5中，将第1溶液稀释至10倍以 上后与第4溶液混合。
[0058] 第2溶液的浓度例如可利用吸光测定法进行估算。另外，第3溶液的浓度例如可 使用吸光测定法和考马斯亮蓝法（Bradford法）精确地测定。
[0059] 下面，对如此制造的本实施方式的造影剂1的作用进行说明。
[0060] 使用本实施方式的造影剂1，考察了其对在培养皿上培养的大肠癌细胞（DLD-1) 的特异性结合特性。
[0061] 此时，除去在第6步骤S6中离心分离出的上清，将沉淀物再悬浮于PBS(例如 100 y L)中，将所得到的溶液撒到细胞中，静置30分钟后利用培养液清洗表面。
[0062] 关于特异性结合特性，利用共聚焦荧光显微镜和流式细胞仪进行确认。
[0063] 在图3(a)、（d)、图4(a)、（d)中示出了共聚焦荧光显微镜图像，在图3(b)、（e)和 图4(b)、（e)中示出了显微镜亮视野像，并在图3(c)、（f)、图4(c)、（f)中示出了它们的重 叠图像。另外，在图5(a)~（d)中示出了流式细胞仪的分析结果。
[0064] 图5 (a)示出了（0)未处理（intact)、（1)仅相变纳米液滴（PCND)、⑵无CCA1抗 体、（3)本实施方式的造影剂1的细胞内纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，图5(b)示 出了（a)的各情况下的平均荧光量。另外，图5(c)示出了使用了与（a)的内包成分的不同 的相变纳米液滴的情况下的（〇)未处理（intact)、（2)无CCA1抗体、（3)本实施方式的造 影剂1的细胞内纳入所带来的荧光量与细胞数的关系，图5(d)示出了（c)的各情况下的平 均荧光量。
[0065] 根据这些图显示出，由于本实施方式的造影剂1标记有作为第3分子探针5的 CCA1抗体，因而在细胞中的蓄积性高。另外，由于本实施方式的造影剂1能够以纳米尺寸制 作，因而显示出若培养时间短则结合在细胞表面、若培养时间延长则造影剂进入到细胞内 部的现象（内化）。其结果，随着施与到生物体后的时间的推移，能够对不同的功能进行成 像。并且，该效果不依赖于内包成分。
[0066] 另外，本实施方式的造影剂1在内部内包有作为不溶于水的物质的全氟己烷。该 全氟己烷为通过以某一阈值以上的强度照射超声波而相变为气体的物质。此处，对于标记 有抗体和色素的本实施方式的造影剂1，使用图6和图7,对为了进行作为超声波用造影剂 的功能评价而测定了从液体向气体的相变所得到的结果的一例进行说明。
[0067]图6为示出用于进行超声波照射和摄像的实验系统的图。图中，符号7为水槽、符 号8为聚焦超声波换能器、符号9为诊断用超声波探头、符号10为放大器、符号11为波形 发生装置、符号12为超声波诊断装置。另外，符号A为试样、符号B为脱气水。以下对实验 程序进行说明。
[0068] 首先，在水槽7中充满37°C的脱气水B。
[0069] 并且，在水槽7内设置在8%丙烯酰胺凝胶中按照全氟戊烷换算浓度为0. 02mg/mL 的方式含有本实施方式的造影剂的体模（试样A)，使用聚焦超声波换能器8向其照射1秒 3MHz的脉冲超声波（占空比0. 01、1000循环）。
[0070] 超声波换能器8利用波形发生装置11和放大器10进行驱动。使用与超声波诊断 装置12连接的诊断用超声波探头12,获取由超声波换能器8照射超声波中的体模A的超声 波图像。
[0071] 图7(a)、（b)示出了照射在超声波图像上产生亮度变化所需要的超声波强度（阈 值：相当于生成诊断用的微米尺寸气泡所需要的超声波强度）以上的超声波前后的肿瘤的 超声波图像（参照图7(b)中的箭头）。此时，由于诊断用的超声波以低于相变阈值的方式 进行了设定，因此表示，利用诊断用的超声波得到的回声信号为来自于已经气泡化而成的 气泡的散射波。
[0072] 需要说明的是，在将由聚焦超声波换能器8照射超声波的条件变化为9MHz的情况 下，通过对强度、循环数、照射时间进行优化，也能够得到与图7同等的结果。根据此处所示 的结果，本实施方式这样的内包有伴随着从液体向气体的相变的不溶于水的物质的造影剂 1的效果可通过超声波诊断像中的亮度变化来明确。
[0073]需要说明的是，利用低沸点的不溶于水的物质与高沸点的不溶于水的物质组合而 成的造影剂也同样地得到了与本实施方式同样的效果。
[0074] 另外还确认到，即使像这样在基材2的表面搭载有光学探针6和CCA1抗体等分子 探针5,也能够进行气相化。
[0075] 另外，在并非为本实施方式的制造方法的顺序的情况下、例如在设定为图8(a)所 示的步骤顺序的情况下，如图8(b)、（c)所示，造影剂发生凝聚，难以产生与靶分子特异性 结合的功能。在图8 (a)所示的步骤顺序中，在上述的第1步骤S1和第2步骤S2之后将第 1溶液与第2溶液混合，在所生成的溶液中混合含有将生物素标记于CCA1抗体上而得到的 生物素化CCA1抗体的溶液。
[0076] 图8 (b)为将在生物素化相变纳米液滴上修饰有AF647修饰链亲和素的溶液应用 于细胞的情况下的显微镜照片，图8(c)为将在（b)的溶液中修饰有生物素化CCA1抗体的 溶液应用于细胞的情况下的显微镜照片。
[0077] 另外，在第5步骤S5中，在将第1步骤S1中生成的第1溶液以原液的形式直接使 用的情况下，如图9 (a)所示，造影剂也发生凝聚，也难以产生与靶分子特异性结合的功能。
[0078] 如此，根据本实施方式的造影剂1及其制造方法，具有如下优点：造影剂1之间不 会发生凝聚，能够利用第3分子探针5仅与生物体（细胞）的靶分子特异性结合。另外还 具有如下优点：能够利用施与到生物体后的经过时间，通过光和超声波对生物体侧的不同 状态（功能）进行成像。
[0079] 其结果，能够使用本实施方式的造影剂1的荧光成像，预先掌握对细胞的内化时 机等本实施方式的造影剂1的细胞行为。另外，能够在实时观测荧光的同时以最佳的时间 照射超声波。
[0080] 即，通过在能够进行超声波造影的基