部。 测试周期持续2地。为了试验结果的准确、可信和科学，在测试期间志愿者按照要求，不能摘 掉斑试器，亦不可使受试部位接触水。24h后去除斑试器，静置30min后，等待压痕消失，观 察皮肤的反应。如果试验结果为阴性，则需要在斑贴试验后24h和4化分别再观察一次。
[0051] 3、试验结果：
[0052] 斑贴试验结果如下表1所示： 阳化引其中，阴性反应；
[0054]一级不良反应："±"=可疑反应：仅有微弱红斑； 阳化5] 二级不良反应："+"=弱阳性反应（红斑反应）：红斑、浸润、水肿、可有丘疹；
[0056] S级不良反应："++"=强阳性反应（瘤疹反应）：红斑、浸润、水肿、丘疹、瘤疹，反 应可超出受试区；
[0057]四级不良反应："+++"=极强阳性反应（融合性瘤疹反应）：明显红斑、严重浸润、 水肿、融合性瘤疹，反应超出受试区。
[005引根据化妆品卫生规范2007,人体斑贴试验判断标准为：30例受试者中出现1级皮 肤不良反应的人数多于5例，或二级皮肤不良反应的人数多于2例，或出现任何1例=级或 S级W上皮肤不良反应时，则判定受试物对人体有不良反应，反之，则视为对人体无不良反 应。
[0059] 从表1中可W看出：实施例1得到的人参发酵原浆均未产生可疑反应，说明本发明 提供的人参发酵物均具有安全性，不会给人体带来不良反应。
[0060] 表1、实施例1获得的人参发酵原浆的斑贴试验结果
[0061]
[0063] 二、人参发酵原浆的分子量大小检测：
[0064] 分子量大小是检验是否能够进行皮肤渗透的重要因素。本发明通过高效液相色谱 (HPLC)测定实施例1制备的人参发酵原浆的分子量大小。具体步骤如下： W65] 1、试验的试剂和溶液的制备：
[0066] (1)流动相：乙腊冰氣乙酸=30 :70 :0. 1 (v/v/v)。
[0067] 似样品制备：W流动相为溶剂配制浓度为5mg/ml的样品，再在用微孔膜 (0. 45ym)过滤后供进样。
[0068] (3)标准样品制备：将牛血清蛋白（Mw67000)、维生素Bi2(Mw1335)、氧化型谷脫 甘肤（Mw614)配成混标，每种物质的浓度均为5mg/ml。
[0069] 2、试验方法：
[0070] 将立种已知分子量的标准品：牛血清白蛋白（Mw67000)，维生素Bi2(Mw133W和 氧化型谷脫甘肤（Mw614)通过高效液相色谱仪（Waters公司）参照文献"王成忠等.蛋白 酶酶解麦胚蛋白及酶解液中多肤分子量分布的研究.粮食加工，2012:37 (2)"中的方法进 行HPLC分析，绘制分子量对数与洗脱时间的标准曲线。根据凝胶柱渗透层析原理，多肤分 子量大的物质先被洗脱出来，洗脱时间与分子量的对数呈线性关系。再按照同样的方法将 实施例1中制备的人参发酵原浆进行HPLC分析，得到相应峰的洗脱时间，将洗脱时间代入 标准曲线，即可得到实施例1制备的人参发酵原浆的分子量大小。 W71]色谱条件：色谱柱：TsKgel2000SWXL300mmX7. 8mm;检测波长：UV280nm;流 速：lml/min;柱溫：30°C。
[0072] 3、试验结果：
[0073] 标准物质的分子量与洗脱时间的如表2所示，根据分子量的对数和洗脱时间做图 得到标准曲线：y= -2. 4738X+17. 656，R2= 0. 9998。其中y为洗脱时间（min) ;x为分子量 对数。
[0074] 表2、标准物质的分子量与洗脱时间 阳0巧]
阳076] 实验组1制备的人参发酵原浆的HPLC图谱如图1所示：从图1中可W看出，人参 发酵原浆的图谱中主要包括1个组分峰，洗脱时间为11. 60min，将洗脱时间代入标准曲线：y= -2. 4738X+17. 656,计算出峰的分子量为280. 84化，并且根据峰面积计算人参发酵原浆 占98. 71 %。一般认为分子量500Da左右活性肤成分更易被皮肤吸收，所W人参发酵物中存 在容易被吸收的活性多肤。
[0077]=、人参发酵原浆的抗氧化性能检测：
[0078] DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氨能力，它在有 机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在517nm处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时， DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过 测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
[0079] 取不同量的实施例1制备得到的人参发酵原浆溶于去离子水中，制得0.63%、 1. 25%、2. 5%、5%和10%体积百分含量的人参发酵原浆待测液。
[0080] DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
[0081] (1)取等体积（一般为3mL)的待测液与2X10 4mol/L的DPPH溶液混匀（Ai管）； 阳0間 似取等体积的无水乙醇（待测物溶剂）与2X10 4mol/L的DPPH溶液混匀（Az 管）； 阳〇8引 做取等体积的无水乙醇与待测液混匀（As管）；
[0084] (4)反应30min后，在517nm下测Ai、Az、As管吸光度值。
[0085] 清除率计算公式为：清除率（％ ) = [(A2+A3)-Ai]/A2
[0086] W人参发酵原浆待测液的体积百分含量为横坐标，清除率为纵坐标，做出人参发 酵原浆对DPPH自由基清除作用曲线，见附图2。
[0087] 由图2可知，实施例1所得人参发酵原浆对DPPH清除作用的IC50 = 9. 9%，说明 人参发酵原浆具有较强的抗氧化能力可清除自由基，促进细胞代谢，增强细胞活力，改善机 体的结构和功能，提高机体生命力，从而延缓细胞老化，发挥其抗衰老的作用。
【主权项】
1. 一种人参发酵原浆制备方法，包括如下步骤：将人参干粉、水和双歧杆菌混合得到 初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到人参发酵原浆化妆品。2. 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述双歧杆菌、所述人参干粉和水的配 比为（20-40)ml :(2-10) g :500g，所述双歧杆菌浓度为 IO6-IO9CFlVml。3. 如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵培养的温度为27-41°C， 时间为20-38h ; 所述双歧杆菌为两歧双歧杆菌Bifidobacterium bifidum。4. 如权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述人参干粉取自干燥人 参。5. 如权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述人参干粉的目数为 20-50 目。6. 如权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于：上述制备方法中，还包括对 所述发酵培养后所得发酵液依次进行灭菌、离心、取上清液的步骤。7. 如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述灭菌的条件如下：灭菌温度为 110-121 °C，灭菌时间为 15-30min ; 所述离心的条件如下：离心转速为3500-4500r/min，离心时间为18_25min，离心半径 为 9cm〇8. 权利要求1-7中任一项所述的制备方法而得到的人参发酵原浆。9. 权利要求8所述的人参发酵原浆在制备具有下述至少一种功能的化妆品中的应用 或在直接作为具有下述至少一种功能的化妆品中的应用： 1)抗衰老；3)清除DPPH自由基。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述化妆品为面膜、精华液或爽肤水。
【专利摘要】本发明公开了一种人参发酵原浆及其制备方法与应用。其制备方法包括如下步骤：将人参干粉、水和两歧双歧杆菌混合得到初始体系，并对初始体系进行发酵培养，得到人参发酵原浆。人参发酵原浆不含任何化学成分，且不需要添加酶等外来物质，不仅节约生产成本，而且最大化的简化了生产步骤，使该发酵技术能够实现大量生产、工业化生产，并能够充分保证产品质量的稳定性。同时，可以直接作为面膜或精华液或爽肤水的成品使用，比现有市面上的其他产品更加天然，不会给肌肤造成任何负作用；与普通提取方法相比，本发明能获得更小的成分，更易让皮肤充分吸收。能广泛用于制备具有抗衰老和/或清除DPPH自由基的产品中。
【IPC分类】A61K8/99, A61Q19/08, A61K8/97
【公开号】CN105147588
【申请号】CN201510639647
【发明人】王昌涛, 李萌, 方国忠, 方晓薇, 赵丹, 张佳婵, 王冬冬
【申请人】上海全丽生物科技有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月30日