一种链霉菌发酵三七皂苷制备20(S)-人参皂苷Rh₁的工艺的制作方法

专利名称：：一种链霉菌发酵三七皂苷制备20(S)-人参皂苷Rh₁的工艺的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物、医药
技术领域：
，涉及一种链霉菌发酵转化各种三七皂苷中的三醇组人参皂苷、制备20(5>人参皂苷RJn(6-(9-;5-D-吡喃葡萄糖基-20CS)-原人参三醇，以下简称Rh。的工艺。特别提供一株人工驯化的弗氏链霉菌(浙取o，cw/rac/^NTGA-334)菌株，以及用该菌株在发酵罐中发酵转化各种三七皂苷、分离提取Rln的工艺。
背景技术：
：人体代谢实验表明，人参皂苷口服后，在胃液、胆汁的作用下仅发生了轻微的氧化作用，不能被降解，只有在肠道菌的作用下，糖苷键才发生断裂，形成了一系列代谢产物。最新的药理学研究表明被吸收入血并发挥活性的不是人参皂苷本身，而是经肠道菌群代谢转化后的代谢产物(TawabMA，"aZ:Z>wgMeto&￡fepos，2003，31(8),1065-1071)。目前普遍认为Rhi是天然三醇组人参皂苷在体内代谢后的主要活性产物之一，而Rg!、Re和R,等可能是天然前体药物。近年来的体内体外试验研究发现，Rh！除了具有抗肿瘤活性外(KimYS,era/:Mcra&o/说ofec/wo/,2008,18(6),1109-1114;王毅，等^茵,资学染,泉2003,19(4)，248-252;陈声武，等^#乂学学叛「度学樹，2003,29(1),25-28.)，还具有抗炎、抗过敏(ShinYW，e〖a/:P/a"to2006,72(4)，376-378;ParkEK,Wa/:zlrc/z^//ergyT)mMw"o/,2003,133(2),113-120;ParkYC,Wa/:历ocAewMo/5/o//W，1996，40(4),751-757.)、免疫调节(王毅，等^房凍发学^11,2007,23(1)，46-52;王毅，等秀学学嚴2002,37(12)，927-929.)以及弱植物雌激素等药理活性(BaeEA，Wa/:历o//VzanwSw〃，2005，28(10)，1903-1908;LeeYJ,"a/:SferaW5!'oc/zemMo/￡/o/，2003，84(4)，463-468.)，因此对它的研究越来越受到重视。在制备小组分人参皂苷和人参皂苷代谢物的方法中，经典的化学法(化学合成、酸水解或碱裂解)不可避免地产生一些副反应，如差向异构化、水合和羟基化(HanBH,e〖a/:尸to"toA&c/,1982,44(3),146-149;ChenY，Wa/:C/^/wP/zar附1987，35(4)，1653-1655);通过酶转化三醇组人参皂苷来制备Rhi，具有转化率高和操作简便的优点(KoSR,Wa/:尸/awto2003,69(3)，285-286;KoSR,Wa/:C7zemi^ar附￡w//，2003，51(4)，404-408;KoSR，"a/:说osc/万/o"c/wo/历oc/jew,2000,64(12)，2739-2743.)，但价格昂贵，存在酶源不便、成本高的问题，因此应用受到限制。涉及链霉菌发酵转化各种三七皂苷中的三醇组人参皂苷、大批量制备RlM的研究，国内外尚未见文献报道。
发明内容为了简便、高效、规模化发酵制备Rh,，本发明提供的转化微生物是一株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的弗氏链霉菌(&w;tom少c"/ra&aeNTGA-334)菌株，菌株保藏编号为CGMCCNo.2074，保藏日期为2007年6月7日。该菌株已申请专利保护(专利申请号2007100660ll.X)。在本发明链霉菌发酵各种三七皂苷制备Rlu的方法中，弗氏链霉菌(5^卬/o;^c^/ra^fleNTGA-334)菌株经过长时间的驯化培养后对营养的要求不高，可在高氏一号、ISP2、腐质酸或天门冬酰胺培养基上生长。在本发明弗氏链霉菌(S加ptom3;c"/rad促NTGA-334)发酵各种三七皂苷制备Rh!的方法中，各种三七皂苷投料量比例为0.1~10%(w/v);发酵温度1850。C，通气比0.1~10(v/v)，搅拌速率10900r/min，发酵时间5h~200h。产物提取过程中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD~16或D101大孔吸附树脂，10900r/min，18~50°C处理1h~10h。在本发明弗氏链霉菌OS^e^owjcw戶a^"eNTGA-334)发酵各种三七皂苷制备Rh!的方法中，可以通过全自动发酵罐发酵各种三七皂苷产生Rln，经过柱层析分离后得到RlM的单体，测定其一维。H、13CNMR)和二维(HMQC、COSY、HMBC、ROESY和HMQC-TOCSY)核磁共振波谱、质谱(MS)。通过详细分析各种谱图数据，并与文献报道20(5)-人参皂苷Rh!的谱图数据相比较，确证本发明所得到的人参皂苷R1m结构与文献报道20(5)-人参皂苷Rhi(6-O-y-D-吡喃葡萄糖基-20(5)-原人参三醇)的结构一致，具有如下的结构式(式1),其具体的&、"CNMR化学位移见表1。21式1本发明中釆用的三七总皂苷中Rb,含量29.7%、Rg,含量28.5%;三醇组人参皂苷中Rg,含量为64.3%、Rh含量为9.50/。。表1RlH的核磁共振分析数据(溶剂吡啶~^)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>图1是20(5)-人参皂苷Rln的分子结构图。具体实施例方式在本发明实施例中所用的弗氏链霉菌0S加/^o/^c"々a力"eNTGA-334)发酵各种三七皂苷、制备Rlu的方法中，发酵步骤是:在发酵罐中接种培养5~24h后，调整通气比0.110(v/v);之后根据Rlu含量的动态监测，将发酵温度调整为18~50°C，pH2~8，搅拌速率10~900r/min。产物收集步骤为在发酵罐中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD16或DIOI大孔吸附树脂，18~50°C、10~900r/min处理1h~10h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇中超声提取lh24h。提取液减压蒸去乙醇，经正相与反相硅胶色谱分离、减压浓縮、真空干燥后获得RIm较高纯度产品。实施例1将弗氏链霉菌(S/re;to/^ces，acA'aeNTGA-334)从高氏1号斜面转接到含有1%(w/v)三七总皂苷的ISP2种子培养基中，28。C培养12h;然后接种到含有2500g三七总皂苷的60L腐质酸培养基中，在100L发酵罐中28。C进行发酵。36h后调整提高通气比为1:3(v/v),搅拌速率调整为400r/min。48h后调整发酵温度至42°C,5%(w/v)氨水动态调整pH=5.0。60h发酵结束，按5。/。(w/v)加入AmberiiteXAD16大孔吸附树脂，搅拌处理2h后放罐。发酵液经滤布过滤得湿重3912g沉淀物，用30L乙醇(95%)超声提取2h并滤布过滤，滤渣再用1L乙醇(95%)洗涤5次。乙醇提取液减压浓縮干后得粗提取物1416.6g，经过硅胶与反相硅胶柱层析分离、减压浓縮、真空干燥后获得Rhi白色粉末283.16g，经过HPLC检测纯度为74.01%，摩尔转化率70.76%。实施例2将弗氏链霉菌(^r印tom少c^,a^aeNTGA-334)从高氏1号斜面转接到含有1%(w/v)人参三醇组皂苷的ISP2培养基培养基中，28°C培养12h;然后接种到含有1000g人参三醇组皂苷的60L腐质酸培养基中，在100L发酵罐中28。C进行发酵。36h后调整提高通气比为1:2，搅拌速率调整为350r/min。48h后调整发酵温度至38°C，5%(w/v)氨水动态调整pH-5.0。60h发酵结束，按1%(w/v)加入AmberliteXAD16大孔吸附树脂，搅拌处理4h后放罐。发酵液经滤布过滤得湿重2023g沉淀物，用20L乙醇(95%)超声提取2h并滤布过滤，滤渣再用1L乙醇(95%)洗涤5次。乙醇提取液减压浓縮干后得粗提取758.4g，经过硅胶与反相硅胶柱层析分离、减压浓縮、真空干燥后获得R&白色粉末592.39g，经过HPLC检测R1m纯度为75.32%。摩尔转化率86.97%。权利要求1.一株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的弗氏链霉菌(StreptomycesfradiaeNTGA-334)菌株，菌株保藏编号为CGMCCNo.2074，保藏日期为2007年6月7日。2.—种用权利要求1所述菌株在发酵罐中发酵转化各种三七皂苷中的三醇组人参皂苷、制备20(S)-人参皂苷Rln(6-O-;8-D-吡喃葡萄糖基-20(5)-原人参三醇，式l)的方法21式l其特征在于(1)所述培养基为高氏一号、ISP2、腐质酸(HSG培养基)或天门冬酰胺培养基。(2)培养基中各种三七皂苷投料量比例为0.1~10%(w/v);发酵温度18~50°C，0.1~35%(w/v)氨水动态调节pH=2~8，通气比0.1-10(v/v)，搅拌速率10-900r/min，发酵时间5h~200h。(3)在产物提取过程中添加0.1~30%(w/v)的AmberliteXAD-16或D101大孔吸附树脂，10~900r/min，18-50°C处理1h~10h。发酵液经过固液分离所得菌丝体和大孔吸附树脂在乙醇中超声提取1h24h。(4)弗氏链霉菌(&reptomyces/ra&aeNTGA-334)菌株发酵各种三七皂苷(三七总皂苷及三醇组人参皂苷)，得到20(5)-人参皂苷Rln。全文摘要一株保藏编号为CGMCCNo.2074的弗氏链霉菌(StreptomycesfradiaeNTGA-334)菌株，以及用该菌株在发酵罐中发酵转化各种三七皂苷中的三醇组人参皂苷，制备20(S)-人参皂苷Rh₁(6-O-β-D-吡喃葡萄糖基-20(S)-原人参三醇)的方法。培养基选用高氏一号、ISP2、腐质酸(HSG培养基)以及天门冬酰胺培养基。在发酵过程中，各种三七皂苷投料量比例为0.1～10％(w/v)，发酵温度18～50℃，0.1～35％(w/v)氨水动态调节pH＝2～8，通气比0.1～10(v/v)，搅拌速率10～900r/min，发酵时间5h～200h，大孔吸附树脂0.1～30％(w/v)。本发明为规模化发酵转化各种三七皂苷、制备20(S)-人参皂苷Rh₁提供一株性状稳定、营养要求简单、生长良好的链霉菌菌株、实用简便的发酵罐发酵及分离提取工艺。用该菌株及该工艺来规模制备20(S)-人参皂苷Rh₁，生产成本低、杂质少，产物得率高。文档编号C12N1/20GK101508965SQ20081023348公开日2009年8月19日申请日期2008年10月27日优先权日2008年10月27日发明者(请求不公开姓名)申请人:昆明诺唯金参生物工程有限责任公司