泊马度胺在制备减轻多发性硬化症的药物中的应用

泊马度胺在制备减轻多发性硬化症的药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属制药领域，涉及化学药物泊马度胺在制备减轻多发性硬化症的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]多发性硬化症(Mutiple Sclerosis)是一种以中枢神经系统白质区域炎性脱髓鞘为主要病理特点的自身免疫病。大多数患者表现为反复发作的神经功能障碍。多发性硬化症好发于青壮年，在女性中发病率比男性中高。多发性硬化症高发于北欧和北美的人群，发病率为50~100/10，0000，在中国的发病率也有逐年上涨的趋势。多发性硬化症具有病程进展快、复发缓解型、治疗效果差、预后不良等特点，对患者的生存质量造成了严重影响。实验室中模拟多发性硬化症的动物模型为实验性变态反应性脑脊髓炎模型(ExperimentAllergic Encephalomyelitis model)，简称 EAE 模型。
[0003]目前对实验性变态反应性脑脊髓炎小鼠模型(EAE)的研究中，最为广泛熟知的能对EAE有加重作用的细胞因子有IFN- γ、TNF - a、IL-1 β。这些致炎性因子能使中枢神经系统少突胶质细胞损伤、髓鞘丢失，进而加速EAE的发展进程。
[0004]临床上用于治疗多发性硬化症的药物主要是基于抗炎和免疫调节而发挥作用:皮治疗法治疗周期不长且容易发生高血糖、高血压、骨质疏松等较为严重的副作用；免疫调节剂如β -干扰素、格拉默治疗EAE和MS的具体机制尚不清楚，存在导致肝功能异常的风险，且二者只能注射给药，刺激性较强。因此，开发新型的抗炎、促髓鞘修复的神经保护剂，对多发性硬化症的预防和治疗非常有现实意义。
[0005]泊马度胺(Pomalidomide)，化学名为3_氨基_N_(2，6_ 二氧代_3_哌啶基)邻苯二甲酰亚胺，分子式C13H11N3O4,其分子量为273.2441。泊马度胺于2013年获得FDA获准上市，临床上主要用于多发性骨髓瘤(MM)。泊马度胺是继沙利度胺和来那度胺后的新一代免疫调节剂的代表药物。目前有报道指出，泊马度胺可以抑制肿瘤坏死因子(TNF-α )，IL_12，IL-6，IL-1 β等炎性因子。这些炎症因子可进一步抑制效应T细胞和效应B细胞，减轻免疫效应；而多发性硬化症是一种自发免疫性反应，至今尚没有泊马度胺对多发性硬化症保护作用方面的报道。

【发明内容】

[0006]本发明的目的是提供一种泊马度胺在制备减轻多发性硬化症的药物中的应用，泊马度胺(Pomalidomide)，化学名3-氨基-N-(2，6-二氧代-3-哌啶基)邻苯二甲酰亚胺，分子式C13H11N3O4，分子量为273.2441，泊马度胺的效用剂量为30 mg/kg-300 mg/kg。
[0007]所述泊马度胺在体内EAE造模小鼠剂量为30 mg/kg、100 mg/kg、300 mg/kg，每天一次，灌胃造模后第8天(EAE模型小鼠症状出现当日)即开始给药，连续给药21天。
[0008]所述药物由泊马度胺与药学上可接受的辅料制成，制剂形式为凝胶剂、软胶囊剂、口服制剂、注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。药物的使用频率为每天一次。
[0009]本发明经体内、夕卜实验研究证明，泊马度胺对M.Tuberculosis (4 mg/ml)、MOG35 55(2 mg/ml)、Pertussis toxin (200 ng per mouse)所诱导的炎性脱髓鞘的EAE小鼠有显著的保护效果。泊马度胺可以用于减轻EAE小鼠的临床症状，改善中枢神经系统的炎性损伤，促进C57BL/6小鼠在EAE造模后的髓鞘修复功能。本发明通过泊马度胺给药后达到减轻EAE小鼠炎性脱髓鞘的药物的目的。本发明的意义在于提供了一种有效的抗炎、促髓鞘再生修复的保护剂，从而扩大泊马度胺对多发性硬化症的的临床应用范围，减轻多发性硬化症患者临床症状和脱髓鞘损伤。
[0010]本发明提供了一种预防治疗多发性硬化症，减轻炎性损伤、保护髓鞘的新思路。
【附图说明】
[0011]图1为泊马度胺(Pomalidomide)30 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠临床症状的缓解作用。
[0012]图2为泊马度胺(Pomalidomide)30 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠体重下降的保护作用。
[0013]图3为泊马度胺(Pomalidomide) 100 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠临床症状的缓解作用。
[0014]图4为泊马度胺(Pomalidomide) 100 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠体重下降的保护作用。
[0015]图5为泊马度胺(Pomalidomide) 300 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠临床症状的缓解作用。
[0016]图6为泊马度胺(Pomalidomide) 300 mg/kg对MOG35 55诱导的EAE小鼠体重下降的保护作用。
[0017]图7为利用免疫荧光染色染小胶质细胞标记物Ibal，检测泊马度胺(Pomalidomide)对EAE小鼠炎症的抑制作用。
[0018]图8为利用苏木精-伊红染色，检测泊马度胺对EAE小鼠炎症的抑制作用。
[0019]图9为利用荧光实时定量PCR (RT-PCR)，泊马度胺(Pomalidomide)可上调脊髓中的抑炎因子IL-4，IL-10和TGF-β。
[0020]图10为利用荧光实时定量PCR (RT-PCR)，泊马度胺(Pomalidomide)可下调促炎因子 IL-6，IFN- γ 和 TNF- α。
[0021]图11为利用坚牢蓝染色，考察泊马度胺(Pomalidomide)对EAE小鼠脱髓鞘的再修复作用的效果图。
【具体实施方式】
[0022]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0023]实施例1:
50只C57BL/6成年雌性小鼠造EAE模型，首先将小鼠随机分成6组，空白对照组、EAE模型组、EAE模型组+泊马度胺低剂量给药组、EAE模型组+泊马度胺中剂量给药组和EAE模型组+泊马度胺高剂量给药组，每组各10只。造EAE模型:先将MOG35 55溶于无菌I X PBS中，配制浓度为2 mg/ ml，将结核杆菌(Myc0.Tuberculosis )溶于完全弗氏佐剂(CFA )中，配制浓度为4 mg/ ml，涡旋混匀。随后通过针筒来回抽推将二者混匀，制备均匀分散的免疫抗原。最后在小鼠颈部皮下注射免疫抗原100 μ 1，小鼠左右后肢各皮下注射免疫抗原50 μ 1，同时尾静脉注射百日咳毒素(Pertussis Toxin ) 200 ng/只。造模第二天再次尾静脉注射百日咳毒素(Pertussis Toxin )200 ng/只。EAE模拟临床多发性硬化症症状评分标准为:0分，无症状；1分，尾巴无力；2分，尾巴无力且部分肢体无力；3分，一侧后肢瘫痪；4分；两侧后肢瘫痪；5分，垂死或死亡。造模当天记为Day 0，造模后第8天，即有约20%小鼠出现轻度尾巴无力症状时，给予泊马度胺30 mg/ kg，100 mg/ kg, 300 mg/ kg,每天称量小鼠体重并记录小鼠EAE情况，连续给药20天。EAE造模Day 8，Day 16，Day 21脱颈椎处死小鼠，分别摘取小鼠大脑、脊髓、脾脏，用4%多聚甲醛固定，用于冰冻包埋和石蜡包埋。大脑横切、脊髓横切分别观察胼胝体区域及白质区域髓鞘丢失、修复情况以及星形胶质细胞和小胶质细胞激活情况；脊髓纵切观察炎性症状；提取造模给药后16天的脊髓中RNA, RT-PCR检测各促炎因子与抑炎因子转录水平的变化。
[0024]实施例2:
取Day 16各组别的脊髓，冰冻切片，免疫荧光。⑴将冰冻切片取出晾干20min ;(2) I XPBS洗 3 次，每次 5 分钟!?Blocking ( IXPBS + 5%NGS + 0.3% Triton-100 ) Ih ;⑷一抗室温孵育2-3h (用blocking buffer配制)；(5) IXPBS洗3次，每次5分钟；(6)二抗室温避光孵育Ih (用blocking buffer配制)；(7) DAPI室温染色5分钟(避光)；(8) IXPBS洗3次，每次5分钟(避光)；(9)用抗淬灭剂封片，避光保存。
[0025]实施例3:
石蜡包埋脊髓并横切脊髓，切片厚度为3 μπι，然进行苏木精-伊红染色(Hematoxylin-Eosin staining)。⑴将石錯切片经环保透明剂I脱錯15min和环保透明剂II脱錯12min !⑵放入100%、95%、90%、80%等各级乙醇中脱水，约5min ;⑶蒸馈水中5min ；(4)苏木精中染色约2.5min，自来水冲洗约15min ;(5)切片放入0.5%的盐酸乙醇中分色，见切片变红，颜色较浅即可；(6)水洗5min，氨水返蓝；(7)梯度脱水，70%乙醇2min，80%乙醇2min，90%乙醇2min，90%乙醇2min ；95%乙醇2min;⑶用0.5伊红乙醇对比染色2s ;(9)无水乙醇I 3min，无水乙醇II 5min ;(10)环保透明剂透明完成后封片。
[0026]实施例4:
冰冻横切大脑，切片厚度为12 μm，然进行坚牢蓝染色(Luxol Fast Blue staining)。⑴取出冰冻切片，晾干15min !⑵蒸馏水中水化15min ；(3) 0.1% LFB (95%乙醇配置，并加冰醋酸使其终浓度为10%)，56°(:水浴311 ;⑷冷却到室温;(5)95%乙醇冲洗；(6) milliQ冲洗;
(7)0.05%碳酸锂分化；(8) 70%乙醇终止分化；(9)蒸馏水冲洗；(10)重复(7)~(9)直至白质区和灰质区分界明显，最后乙醇梯度脱水，封片保存。
[0027]实验结果:
参见图1，EAE造模小鼠给予泊马度胺30 mg/kg后可以缓解其EAE症状，存在显著性差升。
[0028]参见图2，C57BL/6小鼠EAE造模后体重显著下降，泊马度胺30 mg/kg可以改善并提高EAE小鼠的体重下降。
[0029]参见图3，EAE造模小鼠给予泊马度胺100 mg/kg后可以缓解其EAE症状，存在显著性差异。
[0030]参见图4，C57BL/6小鼠EAE造模后体重显著下降，泊马度胺100 mg/kg可以改善并提高EAE小鼠的体重下降。
[0031]参见图5，EAE造模小鼠给予泊马度胺300 mg/kg后可以缓解其EAE症状。
[0032]参见图6，C57BL/6小鼠EAE造模后体重显著下降，泊马度胺300 mg/kg可以在前期改善并提高EAE小鼠的体重下降。
[0033]参见图7，EAE造模小鼠给予泊马度胺(100 mg/kg)后可以抑制脊髓中小胶质细胞的过度激活。
[0034]参见图8，EAE造模小鼠给予泊马度胺100 mg/kg后，可以缓解病灶部位的炎性症状。
[0035]参见图9，泊马度胺100 mg/kg可上调脊髓中的抑炎因子IL_4，IL-10和TGF-β。
[0036]参见图10，泊马度胺100 mg/kg可下调脊髓中的促炎因子IL-6，IFN-γ和TNF- α。
[0037]参见图ll，C57BL/6小鼠EAE造模后，泊马度胺100 mg/kg可以缓解大脑胼胝体的脱髓鞘症状。
【主权项】
1.一种泊马度胺在制备减轻多发性硬化症的药物中的应用，泊马度胺(Pomalidomide)，化学名3-氨基-N-(2，6-二氧代-3-呢啶基)邻苯二甲酰亚胺，分子式C13H11N3O4,分子量为273.2441，泊马度胺的校用剂量为30 mg/kg-300 mg/kg。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的使用频率为每天一次。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物由泊马度胺与药学上可接受的辅料制备，所述药物制剂形式为固体制剂和液体制剂，包括凝胶剂、软胶囊剂、口服制剂、注射液、冻干粉针剂或大输液剂型。
【专利摘要】本发明涉及一种用于治疗多发性硬化症的药物，它是沙利度胺的衍生物泊马度胺，目前临床上主要用于复发性难治性多发性骨髓瘤。非临床研究证明，泊马度胺对M.Tuberculosis(4mg/ml)、MOG35-55？(2mg/ml)、Pertussis？toxin（200ng？per？mouse）所诱导的炎性脱髓鞘的EAE小鼠有显著的保护效果，能应用于多发性硬化症的治疗。
【IPC分类】A61P25/00, A61P37/02, A61K31/454
【公开号】CN105213392
【申请号】CN201510632259
【发明人】翁勤洁, 胡燕, 王静, 谭笔琴, 王佳佳, 赵梦婷, 张卉, 盛荣, 杨波, 何俏军
【申请人】浙江大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日