可至成熟。
[0038] 在本发明中优先选用的神经胶质瘤抗原多肽是由FAT10154 162、FAT10155 163、和 FAT1049 57表位肽基因重组表达载体的复合物，FAT10 154 162表位肽、FAT10 155 163表位肽、 FAT1049 57表位肽的摩尔比为1 :1 :1。
[0039] 其中，FAT10154 162表位肽由表位FAT10 154 162、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留 信号序列DELK和接头序列组成，表位FAT10154 162的氨基酸序列为NLLLGSKIL。FAT10 155 163表位肽是由表位FAT10155 163、穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序 列组成，表位FAT10155 163的氨基酸序列为LLFLACYCI。FAT10 49 57表位肽是由表位FAT10 49 57、 穿膜序列HIV-Tat40-48、内质网滞留信号序列DELK和接头序列组成，表位FAT1049 57的氨基 酸序列为VLLLGSKIL。FAT10154 162表位肽、FAT10 155 163表位肽和FAT10 49 57表位肽中，穿膜序 列均位于氨基端，内质网滞留信号序列均位于羧基端，表位与穿膜序列或内质网滞留信号 序列之间均以接头序列连接，接头序列为丙氨酸-丙氨酸-酪氨酸。
[0040] 神经胶质瘤抗原多肽的合成在AB I 431A型固相多肽合成仪（美国PE公司）上 进行，方法采用标准芴甲氧羰基（Fmoc)方案，精氨酸采用两次偶联。具体过程为：
[0041] 起始选用0. 125mmol对羟甲基苯氧甲基聚苯乙烯树脂（HMP树脂），按照多肽序列 使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，每种氨基酸（即FAT10154 162表位肽、FAT10 155 163表位肽 和FAT1049 57表位肽）的用量为0. 5mmol，与HMP树脂的摩尔比为4:1。各种氨基酸的α-氨 基为Fmoc保护，其余侧链保护基团分别为：Lys(Boc)、Ser(tBu)、Glu(OtBu)、Arg(Pmc)、 His(Trt)、Thr(tBu)和Tyr(tBu)。第一个氨基酸连接到HMP树脂上用4-二甲氨基吡啶 (DMAP)，氨基酸的活化用1-羟基苯并三唑（HOBt)和二环己基碳二亚胺（DCC)，偶联后用体 积分数为20%的哌啶水溶液去除Fmoc保护基。多肽合成后，将树脂-粗肽产品在冰浴条件 下混合于l〇ml切割液A (由结晶苯酸0. 75g、l, 2-乙二硫醇即EDTO. 25ml、苯甲硫醚0. 5ml、 去离子水0. 25ml和三氟乙酸即TFAlOml组成）中，待切割液温度上升至室温后，搅拌反应2 小时，使肽链从树脂上裂解下来，同时去除多种保护基团。将反应混合液经G4玻砂漏斗过 滤以去除树脂，先后用lml TFA、5~10ml二氯甲烧反复冲洗反应瓶、树脂和漏斗。将滤液 在常温低压下蒸发至1~2ml，加入50ml预冷乙醚沉淀多肽，4°C放置过夜，G6玻砂漏斗过 滤，真空抽干，即得多肽粗品，_20°C保存备用。
[0042] 将多肽粗品用二甲基亚砜（DMS0)溶解制成浓度为20mg/ml的溶液，经孔径为 0· 45um的微孔滤膜过滤后，在AKTA explorer 100型中压液相色谱仪（瑞典Amerssham Bioscienc公司）上用SOURCE凝胶进行纯化。流动相A由体积百分含量为10%的乙醇和 体积百分含量为〇. 1 %的TFA组成；洗脱梯度为：先用流动相A 1. 5个柱体积洗脱，再用流 动相A和流动相B的混合液（流动相B占混合液的体积分数在8个柱体积内由0%逐渐增 加至80 % )洗脱，再用流动相A和流动相B的混合液（流动相B占混合液的体积分数在0. 5 个柱体积内由80%逐渐增加至100% )洗脱，在主峰处收集多肽溶液，冷冻干燥，即得神经 胶质瘤抗原多肽纯品，用DMS0溶解，-20°C保存备用。
[0043] 将多肽纯品用Delta600型高压液相色谱仪（美国Waters公司）鉴定纯度，采用 Symmetry Shield? C18柱，流动相由体积百分含量为10%~60%的乙腈和体积百分含量 为0. 1%的TFA组成，梯度洗脱，流速为lml/min。结果显示，合成多肽的纯度均达到90%以 上，多肽纯度越高，DC负载的抗原量越高。同时，将多肽纯品用API 2000LC/MS型电喷雾离 子化质谱仪测定分子量。结果显示，合成多肽的分子量均与理论值相符。
[0044] 在步骤（3)中，由于白介素和脂多糖功能均具有促进DC细胞成熟的功能，因此在 该步骤中采用其中一种即可。由于DC细胞成熟后会分泌白介素-1，因此，在该步骤中，优 先采用白介素-1来促进DC细胞的成熟，起到反馈诱导的作用。白介素-1由活化的巨噬细 胞所产生，机体免疫细胞受抗原刺激后产生；而肿瘤坏死因子-α由体内免疫细胞（如T淋 巴细胞、Τ细胞杂交瘤、Τ淋巴样细胞系以ΝΚ细胞等）分泌的一种单核因子，由于白介素-1 和肿瘤坏死因子-α由不同细胞产生，因此，同时添加白介素-1和肿瘤坏死因子-α对未 成熟DC的刺激作用较强，能够提高神经胶质瘤抗原多肽的负载率，并且能够稳定DC的抗原 提呈性的同时促进DC成熟；优选地，肿瘤坏死因子-α在培养基中的终浓度为l-10ng/ml、 白介素-1在培养基中的终浓度为5-15ng/ml、脂多糖在培养基中的终浓度为l-10ng/ml。
[0045] 成熟DC表达的MHC-II类分子、共刺激分子、黏附分子的水平较非成熟DC高，故其 抗原提呈能力相对非成熟DC较强，可提高机体免疫反应。
【具体实施方式】 [0046] 为：
[0047] 实施例1
[0048] 基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗，其制备方法包括以下步骤：
[0049] 1)取20ml人外周血，用Ficon淋巴细胞分离液分离出CD14+单核细胞，用PBS溶 液洗涤后按2. 5-5xl〇73ml/孔接种于六孔板中，并用RPMI-1640培养基在37°C，5% C02的培养箱中放置培养90分钟，收集贴壁细胞，即CD14+单核细胞。
[0050] 2)将⑶14+单核细胞接种到含有800U/mL粒-巨噬细胞因子和1000U/mL白介素-4 的RPMI-1640培养基中并在37°C，C02浓度为5%的培养箱中诱导3-5天后，半量换液，补充 粒-巨噬细胞因子和白介素-4,维持粒-巨噬细胞因子和白介素-4浓度不变，获得未成熟 DC ；
[0051 ] 3)用PBS溶液（PH = 7. 4)将未成熟DC细胞液浓度调节至1 X 105个/ml，取10uL 未成熟 DC 细胞液和 100 μ L、1000 μ g/mL 由 FAT10154 162、FAT10155 163和 FAT10 49 57表位肽基因 重组表达载体的神经胶质瘤抗原多肽共培养7天；
[0052] 4)再加入5ng/ml肿瘤坏死因子-α和8ng/ml白介素-1继续培养7天至DC成熟 且负载上神经胶质瘤抗原多肽。
[0053] 实施例2
[0054] 与本发明提供的实施例1的不同之处在于，在本实施例中肿瘤坏死因子-α的浓 度为10ng/ml、白介素-1的浓度为5ng/ml。
[0055] 实施例3
[0056] 与本发明提供的实施例1的不同之处在于，在本实施例中肿瘤坏死因子-α的浓 度为lng/ml、白介素-1的浓度为15ng/ml。
[0057] 为进一步验证本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗（下简称"DC疫苗"） 的显著效果，设置以下实验进行检测验证。
[0058] 在验证本发明提供的基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗的免疫效果前，首先通过 以下实验验证通过本发明提供的方法获得了已负载神经胶质瘤抗原多肽的DC疫苗。
[0059] 验证DC成功负载神经胶质瘤抗原多肽：收集实施例1中共培育负载抗原的成熟 DC，和未加入神经胶质瘤抗原共培育的成熟DC细胞进行转染，培养36h，western blot (蛋 白质印迹法）检测。
[0060] 检测结果：如图1所示，图1中，A为HLA-A2、B为β -actin ; β -actin为细胞均 表达的普通蛋白，HLA-A2为负载抗原后DC细胞表达的蛋白，而抗原负载的DC有一条目的 蛋白HLA-A2的表达，说明基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗构建成功。
[0061] 以下为验证基于DC的神经胶质瘤治疗性疫苗免疫