48. 03 (s)，140. 7 7 (s), 136. 56 (s), 134. 97 (s), 131. 61 (s), 128. 86 (s), 119. 35 (s), 69. 37 (s), 54. 95 (s), 54. 5 2 (s), 45. 97 (s), 45. 84 (s), 37. 68 (s), 33. 82 (s), 26. 51 (s), 25. 61 (s), 25. 25 (s), 23. 65 (s), 23. 41(s), 22. 99 (s).
[0029] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcdforC26H37N203:425. 2804 ；found:425. 2801 〇
[0030]
[0031] 实施例4SalviskinoneA的0-(1Η-四氮唑基）乙基衍生物（IV)的合成
[0032] 将化合物II(209mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈当中，向其中加入无水碳酸钾 (345mg，2. 5mmol)，鹏化钟（84mg，0· 5mmol)和 1H-四氣唑（1401mg，20mmol)，混合物加热 回流l〇h。反应结束后将反应液倒入25mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有机 相。依次用水和饱和食盐水洗涤合并之后的有机相，再用无水硫酸钠干燥，减压浓缩去除 溶剂得到产物粗品。因为互变异构作用，在反应条件下会生成1H-四氮唑基和2H-四氮唑 基两种取代产物。产物粗品用硅胶柱层析纯化（流动相为：石油醚/丙酮=100:1，v/V)， 收集黄色集中洗脱带，再将洗脱带浓缩，用硅胶柱层析纯化（流动相为：石油醚/丙酮= 100:0. 5,v/v)，依次收集两个淡黄色的洗脱带，浓缩前1个洗脱带即得到化合物IV的黄色 粉末（85.7mg，42% )。
[0033] 4NMR(500MHz，Chloroform-dl)δ10.21(s，1H)，6.53(d，J=95.4Hz，1H)，6.31(s ,1H), 5. 73(s,1H), 4. 41(t,J=7. 8Hz, 4H), 4. 04(s,1H), 2. 09(s,1H), 1. 98(s,1H), 1. 85(s, 1H),1. 59(s,1H),1. 33(s,3H),1. 02(s,6H),0. 93(s,6H).
[0034]13CNMR(125MHz,DMS0-d6)δ188. 01 (s)，183. 52 (s)，154. 09 (s)，147. 15 (s)，144. 6 0(s), 140. 11 (s), 136. 23 (s), 134. 42 (s), 130. 84 (s), 127. 86 (s), 118. 73 (s), 66. 79 (s), 46. 45 (s), 45. 42 (s), 37. 35 (s), 33. 27 (s), 25. 74 (s), 24. 62 (s), 24. 60 (s), 23. 32 (s), 22. 86 (s) ,22. 22 (s).
[0035]HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcdforC23H29N403:409 . 2 2 40 ;found:409. 2245。
[0036]
[0037] 实施例5组合物抗急性痛风炎症实验
[0038] 1、溶液配制
[0039] 5g尿酸加1000ml蒸馏水煮沸，加5%NaOH溶液调PH7. 4,搅拌，冷却析晶制成尿 酸钠结晶（MSU)。将制好的MSU10mg高压灭菌，加不含血清的DMEM培养液10ml，研磨配成 lmg/ml的DMEM溶液。实验时，此溶液再加DMEM培养液配成不同浓度DMEM的MSU溶液。
[0040] 组合物的制备：将研磨之后过200目网的15mg化合物III的粉末和研磨之后过 200目网的85mg化合物IV的粉末装入带盖的小管中并用涡轮搅拌仪混合即得到100mg组 合物，使用时用水溶解这l〇〇mg的组合物即得到组合物的溶液。
[0041] 组合物、化合物III或者化合物IV2. 5mg，用二甲基亚砜（DMS0)溶解，DMS0终浓 度〈0. 02 %，再加无血清的DMEM培养液，配制成浓度25ug/ml。
[0042] 2、血管内皮细胞的体外培养
[0043] 人脐静脉血管内皮细胞HUVEC株由南京中医药大学基础医学院提供，细胞经支原 体检测，无支原体污染，细胞经0. 25 %胰蛋白酶消化，含10 %小牛血清的DMEM培养液中和， 离心（100()以1^11\61^11)，去上清液，加含1()%小牛血清的01^1培养液，移入细胞培养瓶 中，放37 °C、5 %C02培养箱中传代培养。
[0044]3、对MSU刺激HUVEC活力的影响
[0045]HUVEC在培养瓶中培养，待生长至70 %~80 %融合时，以0.25 %胰蛋白酶消化、离 心，10 %小牛血清DMEM培养液洗涤3次，用10 %小牛血清DMEM培养液调成4X104/ml细胞 悬液，植入96孔板（每孔200ul)，培养24小时后轻吸出原培养液，进行以下实验，每组各8 孔，具体分组及加液如下：对照组（200ulDMEM培养液）、模型组（100ug/mlMSU溶液）、干 预组（100ug/mlMSU溶液+25ug/ml的组合物或者化合物），加液后继续放37°C、5% 0)2培 养箱中培养24小时，收集上清液，剩余的HUVEC用于测定细胞活性，每孔再加5mg/mlMTT 液20ul，继续放37°C、5%C02培养箱中培养4小时后，弃MTT液，加入二甲基亚砜200ul溶 解，震荡，于酶标仪读取吸光度值，波长490nm。
[0046] 数据统计学处理，细胞活力（％)=实验组吸光度值/对照组吸光度值X100%， 结果见表1。
[0047] 与对照组相比，模型组细胞活力显著减小（Ρ〈0·05)，组合物干预后细胞活力显著 提高（Ρ〈0.05)，并强于对照组，而化合物III和化合物IV无此活性。
[0048] 表1组合物对MSU刺激的血管内皮细胞活力的影响（Υ)
[0049]
[0050] 注：与模型组相比，*Ρ〈0. 05;与对照组相比，ΛΡ〈0. 05
[0051] 4对ICAM-1表达影响
[0052] 将处于对数生长期的HUVEC用0. 25%的胰蛋白酶消化，轻轻吹打，制成细胞悬液， 调整细胞密度为5X109/L，接种于细胞培养瓶中。待细胞长满后（约24h)，弃去上清液，分 为下列组：对照组、模型组（l〇〇ug/mlMSU溶液）、干预组（100ug/mlMSU溶液+25ug/ml组 合物或者化合物），继续培养24小时，PBS收集细胞，离心去上清，加入CD54单克隆抗体， 30min后，PBS洗涤，重悬细胞，应用流式细胞仪检测其阳性细胞百分率（η=10000)，重复3 次，结果见表2。
[0053] 表2组合物对MSU刺激的血管内皮细胞ICAM-1表达的影响< 7 )
[0054]
[0055] 注：与模型组相比，*Ρ〈0. 05 ;与对照组相比，ΛΡ〈0. 05
[0056] 结果显示，空白组HUVEC几乎无ICAM-1表达，模型组ICAM-1的表达最高，与模型 组相比，组合物对ICAM-1的表达有显著的抑制作用，而化合物III和化合物IV无显著的抑 制作用。
[0057] 结论：用MSU致HUVEC损伤的急性痛风模型评价显示，组合物可保护MSU致HUVEC 损伤，减少细胞凋亡，提高细胞活性，抑制ICAM-1表达，具有抗急性痛风炎症的活性，组合 物可用于制备治疗急性痛风炎症药物。而化合物III和化合物IV不能保护MSU致HUVEC 损伤，不能减少细胞凋亡，不能提高细胞活性，不能抑制ICAM-1表达，不具有抗急性痛风炎 症的活性，不能用于制备治疗急性痛风炎症药物。
[0058] 实施例6本发明所涉及组合物片剂的制备
[0059] 取2克组合物，加入制备片剂的常规辅料18克，混匀，常规压片机制成100片。
[0060] 实施例7本发明所涉及组合物胶囊的制备
[0061] 取2克组合物，加入制备胶囊剂的常规辅料如淀粉18克，混匀，装胶囊制成100 粒。
【主权项】
1. 一种组合物，其特征为该组合物由化合物III和化合物IV组成，该组合物中化合物 III和化合物IV的质量百分数分别为15%和85%，2. 如权利要求1所述的组合物的制备方法，其特征为：将化合物III的粉末和化合物 IV的粉末按照质量百分数分别为15%和85%充分混合。3. 如权利要求1所述的一种组合物在治疗急性痛风药物中的应用。4. 如权利要求3所述的组合物在治疗急性痛风药物中的应用，其特征为：所述急性痛 风是由尿酸钠诱导的。5. 如权利要求3所述的组合物在治疗急性痛风药物中的应用，其特征为：组合物减少
【专利摘要】本发明涉及有机合成和药物化学领域，具体涉及组合物、制备方法及其在制备抗急性痛风药物上的用途。本发明公开了一种组合物及其制备方法。药理学实验表明，本发明的组合物具有抗急性痛风的作用，具有开发抗急性痛风药物的价值。
【IPC分类】A61P19/06, A61K31/41, A61K31/495
【公开号】CN105250297
【申请号】CN201510740756
【发明人】王卓婷
【申请人】南京赋海澳赛医药科技有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月4日