[0023] 图3显示了 20mM二甲双胍：100μΜ黄酮联合用药下调ΡΙ3Κ蛋白表达水平；其中， A :药物处理24小时后，对照组、20mM二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用 药处理组ΡΙ3Κ蛋白表达，B :ΡΙ3Κ蛋白表达水平的量化数据；
[0024] 图4显示了 20mM二甲双胍：100 μΜ黄酮联合用药下调p-Akt蛋白表达水平；其中， A :药物处理24小时后，对照组、20mM二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用 药处理组p-Akt蛋白表达，B :p-Akt蛋白表达水平的量化数据；
[0025] 图5显示了 20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用药上调p53蛋白表达水平；其中， A :药物处理24小时后，对照组、20mM二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用 药处理组Ρ53蛋白表达，B :ρ53蛋白表达水平的量化数据；
[0026] 图6显示了 20mM二甲双胍：100 μΜ黄酮联合用药下调Bcl-2蛋白表达水平；其中， A :药物处理24小时后，对照组、20mM二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用 药处理组Bcl-2蛋白表达，B :Bcl-2蛋白表达水平的量化数据；
[0027] 图7显示了 20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用药上调Bax蛋白表达水平；其中， A :药物处理24小时后，对照组、20mM二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用 药处理组Bax蛋白表达，B :Bax蛋白表达水平的量化数据。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0029] 材料与仪器：
[0032] 体外存活率实验：
[0033] 人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于96孔板，接种数量约8000个/孔，接种16小时 后，细胞分别用IOmM二甲双胍、IOmM二甲双胍：100 μM黄酮、IOmM二甲双胍：200 μM黄酮、 20mM二甲双胍、20mM二甲双胍：100 μ M黄酮和20mM二甲双胍：200 μ M黄酮处理24小时， 然后加入MTT (3-(4, 5-二甲基噻唑-2) -2, 5-二苯基四氮唑溴盐），37°C培养箱孵育4小时， 移除孔内培养液，加入150 μ 1DMS0，摇床摇晃20分钟，使用酶标仪检测吸光度。吸光度数值 反应了细胞活力。对照组不加任何药物干预。
[0034] 由表1和图1可以得出：用IOmM二甲双胍、IOmM二甲双胍：100 μM黄酮以及 IOmM二甲双胍：200 μ M黄酮处理24小时后，与对照组相比，乳腺癌细胞的存活率分别为 84. 3±0. 2%，75. 7±1. 5%和75. 1±1. 5%。与二甲双胍单独处理组相比，联合用药组显著 抑制了乳腺癌细胞的增殖（Ρ〈〇.〇5);用20mM二甲双胍、20mM二甲双胍：100μΜ黄酮以及 20mM二甲双胍：200 μ M黄酮处理24小时后，相比于对照组，乳腺癌细胞的存活率分别为 75. 4±2. 5%，66. 0±1. 9%和63. 2±1. 4%，联合用药组相比于二甲双胍单独处理组，显著 抑制了乳腺癌细胞的增殖（Ρ〈〇. 05)。这些数据显示：20mM二甲双胍：100 μΜ黄酮和20mM 二甲双胍：200 μΜ黄酮两个联合用药组对乳腺癌细胞的增殖有显著的抑制作用。由于添加 200 μ M黄酮与添加100 μ M黄酮相比并没有显著差别，基于降低给药浓度的原则，我们选择 20mM二甲双胍：100 μ M黄酮药物组合进行后续的实验。
[0035] 通过表1和图1的实验，我们获得了二甲双胍与黄酮联合用药的优选浓度，即20mM 二甲双胍：100 μ M黄酮，在之后的实验中，联合用药组均是使用这一优选浓度。
[0036] 表1.二甲双胍单独处理及二甲双胍与黄酮联合用药后，乳腺癌细胞的存活率
[0038] 人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞接种于6孔板，接种16小时后，加入20mM二甲双 胍，或20mM二甲双胍：100 μ M黄酮的联合药物。药物处理24小时后，使用荧光染料Hoechst 33342和碘化丙啶（Propidium Iodide，PI)染色细胞，避光，4°C孵育20分钟。使用荧光显 微镜检测凋亡细胞，正常细胞显弱蓝色荧光和弱红色荧光，凋亡细胞显亮蓝色荧光和弱红 色荧光，坏死细胞显亮蓝色荧光和亮红色荧光。计数细胞，计算凋亡率。图2中，A、B、C为细 胞凋亡照片，D为细胞凋亡率的量化统计。对照组、二甲双胍处理组、20mM二甲双胍：100 μΜ 黄酮联合用药处理组的凋亡率分别为4. 23±0. 90%、6. 43±0. 78%和9. 96±0. 94。与黄酮 的联合用药增强了二甲双胍诱导乳腺癌细胞凋亡的作用，显示了二甲双胍与黄酮联合用药 在诱导癌细胞凋亡方面发挥有益效果。
[0039] 人乳腺癌MDA-MB-231细胞被20mM二甲双胍，或20mM二甲双胍：100 μ M黄酮的联 合药物处理24小时，使用含蛋白酶抑制剂的WB-IP细胞蛋白裂解液裂解细胞，提取蛋白。电 泳，80V，30分钟，转至110V，电泳90分钟，分离蛋白。转膜至PVDF膜，60分钟。使用5%脱 脂奶粉封闭1小时。4°C，一抗（0-&(^111、？131(、？4肚、？53、8(31-2和8 &1)孵育过夜，然后 室温孵育60分钟。TBST洗膜三次，每次10分钟。二抗室温孵育90分钟。TBST洗膜三次， 每次15分钟。使用ECL化学发光液检测蛋白表达水平。
[0040] 由图3-图7得出：20mM二甲双胍：100 μ M黄酮联合用药显著增强了二甲双胍对 Bcl-2、PI3K、p-Akt的下调作用，以及对p53、Bax的上调作用。这些数据表明，二甲双胍与 黄酮联合用药涉及两个分子机制，即PI3K/Akt/p53信号通路和调控Bcl-2家族。
[0041] 上述虽然结合附图对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护范 围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不 需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种治疗乳腺癌的组合物，其特征是：以二甲双胍和黄酮为主要活性成分。2. 如权利要求1所述的组合物，其特征是：二甲双胍与黄酮的浓度比例为10mM: 200μM_20mM: 100μM。3. 如权利要求1所述的组合物，其特征是：二甲双胍与黄酮的浓度比例为 10mM: 100μM、10mM: 200μΜ或 20mM: 200μΜ。4. 如权利要求1所述的组合物，其特征是：二甲双胍与黄酮的浓度比例为 20mM: 100μΜ。5. 权利要求1-4任一所述的组合物在制备治疗乳腺癌药物中的应用。6. -种治疗乳腺癌的制剂，其特征是：由如权利要求1、2、3或4所述的组合物和药学 上可接受的辅料组成。7. 如权利要求6所述的治疗乳腺癌的制剂，其特征是：所述中药制剂的剂型为注射剂、 丸剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂。
【专利摘要】本发明公开了二甲双胍联合黄酮治疗乳腺癌的应用及其产品，本发明提供了以二甲双胍作为抗癌药物的过程中使用天然产物黄酮作为辅助剂的药物组合方式。通过加入辅助剂黄酮，降低二甲双胍发挥抗癌作用的浓度或时间，为发展二甲双胍作为抗癌药物提供新途径。所述方法为，在使用浓度为20mM的二甲双胍处理体外培养的乳腺癌细胞过程中，加入浓度为100μM的黄酮，可通过调控PI3K/Akt/p53信号通路及Bcl-2家族蛋白，进而提高二甲双胍抑制乳腺癌细胞增殖和诱导凋亡的能力。
【IPC分类】A61P15/14, A61P35/00, A61K31/352, A61K36/00, A61K31/155
【公开号】CN105267250
【申请号】CN201510776567
【发明人】李国荣, 郑兆娣, 朱文振
【申请人】山东师范大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年11月12日