一种降糖活性组分的制备方法及医疗用图
【技术领域】
[0001 ] 本发明是涉及刺五加醇提物降糖活性组分的制备方法。经多次体外蛋白酪氨酸磷 酸酯酶IB抑制实验表明，该活性组分具有明显的抑制PTPlB活性，可在制备糖尿病、肥胖症 及并发症药物应用。
【背景技术】
[0002] 目前临床上常将糖尿病分为胰岛素依赖型（IDDM，I型糖尿病）和非胰岛素依赖型 (NIDDM，II型糖尿病)两类，其中II型糖尿病在糖尿病中占90%。WHO预计，由于人口老龄化、 肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式，到2025年，糖尿病患者的数目将由1995年 的1. 35亿上升为3亿。
[0003] II型糖尿病的特征是胰岛素敏感组织如骨骼肌、肝、脂肪组织对胰岛素作用的抵 抗。虽然其具体机制尚不清楚，但胰岛素信号在其传导通路中的减弱甚至阻断必定是直接 关系。PTPases在胰岛素信号通路中多个环节起作用，如将自身磷酸活化的IR去磷酸化，从 而降低受体激酶活性；或将IRS_l、IRS-2、Shc等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基至去 磷酸化，从而负调控胰岛素作用受体后通路。特定PTPases和胰岛素通路中的酪氨酸激酶 间的酶活性不平衡可能是引起II型糖尿病胰岛素抵抗的原因。因此，通过寻找选择性作用 于该通路中PTPases的抑制剂抑制其活性，加强和延长胰岛素信号，成为越来越受重视的 治疗II型糖尿病的新途径。
[0004] PTPlB选择性抑制剂的研究取得了一定的进展，但大多研究局限于肽类和类 肽化合物，例比如根据PTPlB去磷酸化的底物序列设计的抑制剂EEDE (F2PMP)M、 Glu-F2PMP-F2PMP，虽然这些肽类化合物具有较高的选择性和较强的抑制活性，但它们不易 穿透细胞膜和其肽类磷酸结构使其很难成为药物候选化合物。最近，在非肽类PTPlB抑制 剂的报道中2-羧甲氧基苯甲酸类化合物对PTPlB有很强的抑制作用，更重要的是，其中 (2S) -2- [4?2-苄基-苯并呋喃）-3-联苯-4-氧]-3-苯基-丙酸化合物不仅对PTPlB有 很强的选择抑制性，还对降低〇b/ob小鼠血浆中的葡萄糖和胰岛素水平有显著作用。这是 第一例从药理学上直接证明PTPlB抑制剂具有抗糖尿病活性的证据[Malamas，M. S. et al. J. Med. Chem. 2000，43，1293-1310]。
[0005] 本发明涉及的刺五加（Tfei/ix JcafliAojDiMaci1S 属于五加科五加属， 主要生长在山坡林中及路旁灌丛中；药圃常有栽培。分布于华中、华东、华南和西南。主要 用于抗肿瘤、抗疲劳、降低全血粘度、防止动脉粥样硬化形成等作用。
[0006] 经检索未见用刺五加醇提物制备降血糖活性组分的相关文献报道。
【发明内容】
[0007] 本发明提供以刺五加活性组分为降血糖活性组分，其目的是用于治疗糖尿病、高 血糖及并发症疾病。
[0008] 本发明的另一个目的是提供如上限定的刺五加降血糖活性组分在生产用于抑制 蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB (PTPlB)的抑制剂和胰岛素增敏剂、治疗各种糖尿病、肥胖症及其 它由此引发的并发症。
[0009] 本发明公开刺五加降糖活性组分及其制备方法。
[0010] 本发明所述的刺五加降糖活性组分制备方法，包括以下步骤： (1) 称取刺五加干燥品300g，加入1-2倍量的75%乙醇浸泡1小时，利用超声波提取1 至3小时，抽滤并收集滤液； (2) 滤液用旋转蒸发仪浓缩，收集浓缩液，放凉，加入2-3倍量水并搅拌，常温静置24小 时，析出沉淀，过滤或离心取沉淀，沉淀物置于表面皿中加热，除去乙醇和水，直至无醇味， 即得刺五加醇提物； (3) 将刺五加醇提物经过150μπι反相色谱，用以甲醇/水（V/V，0:10-10:0)为流动相 进行梯度洗脱，收集的分离组分利用反相薄层层析检测，成份相同的分离组分合并、浓缩后 得到F 1至F1〇十个分离组分； (4) 将F2组分经ΗΡ-20大孔色谱，用以甲醇/水（V/V，0:10-10:0)为流动相进行梯度 洗脱，收集乙醇/水（V/V，3:7)的分离组分、浓缩后得到刺五加降血糖活性组分。
[0011] 将本发明刺五加降糖活性组分中加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂 混合，根据给药途径制成多种药物剂型。
[0012] 药理学研究表明，本发明的刺五加活性组分具有明显地抑制PTPlB活性和降血糖 作用。因此，本发明刺五加降糖活性组分的PTPlB抑制活性及降血糖作用显著优于刺五加 醇粗提取物的降血糖效果。
【附图说明】
[0013] 图1 :为本发明刺五加降糖活性组分分别对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影 响。
[0014] 以下试验例表明本发明刺五加活性组分的药理活性： 试验例1 本发明刺五加降糖活性组分抑制PTPIB，VHR和PPl活性试验 实验方法：用于筛选的蛋白酪氨酸磷酸酯酶ΡΤΡ1Β，是从大肠杆菌中表达并纯化的GST 融合蛋白。采用紫外底物ΡΝΡΡ，观察不同浓度对重组酶的活性抑制，以初步评价化合物的 药用效果。PTPlB水解底物^NPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收。因此可以 直接检测410nm处光吸收的变化以观察酶的活性变化以及刺五加活性组分对其的抑制情 况。阳性对照正钒酸钠的IC 5。为2. 0 uM。刺五加降糖活性组分抑制VHR和PPl活性实验 原理同PTP1B。实验结果如下：
实验结果显示，当本发明活性组分的浓度为15. 3 μ g/ml时，对PTPlB活性有50%抑制 作用（IC5。），并且实验数据显示本发明活性组分对PTPlB有高选择性。
[0015] 试验例2 本发明刺五加活性组分对STZ致高血糖大鼠降血糖实验 以昆明大鼠60只（雄性)，随机分组成空白组、模型组（Diabetic control)、实验组、消 渴丸对照组（XKW)。除空白组外，各组禁食不禁水I d，以STZ (在4°C冰浴中用0. 05 mol/ ml梓檬酸pH4. 5溶液配制，立即使用）腹腔注射60 mg/kg，造糖尿病模型。注射后72 h断 尾取血测定血糖(测前禁食12 h)，血糖值高于11. I mmol/L用于实验。
[0016] 实验组分别以本发明刺五加活性组分灌胃（100、200、300 mg/kg);XKW组以消渴丸 灌胃（250 mg/kg);空白组、模型组灌胃等体积生理盐水。给药30 d，每天给药一次并称重。 末次给药后，断尾取血测宙口服血糖倌（测前禁食12 h)。实脍结果如下：
实验结果显示，本发明活性组分的低、中、高剂量组与模型组比较，均有显著的降糖效 果，其中活性组分300mg/kg组的降糖效果与消渴丸对照组相当。因此，通过以上数据得到 本发明活性组分有效降血糖剂量为300mg/kg。
[0017] 试验例3 : 本发明活性组分别对STZ致高血糖大鼠胰岛素敏感性的影响 实验组分别以本发明活性组分灌胃（200 mg/kg);模型组灌胃等体积生理盐水。给药 30 d，每天称重、给药一次。以上各组在给药30 d内，每天腹腔注射长效人胰岛素 I IU/kg。 30 d后，各组大鼠四天内每天分别腹腔注射速效人胰岛素0.05、0.5、1.0、2.5 IU/kg，测定 给速效人胰岛素前后的血糖，计算比值。实验结果如图1。
[0018] 实验结果显