，HS578T细胞14天后，检测平板成克隆和琼脂糖成 克隆的数量。
[0069] 图6为PI-273在移植瘤模型中的抗肿瘤作用；
[0070] a.肿瘤生长曲线。MCF-7细胞移植到BALB/c裸鼠4天后连续16天腹腔注射25mg/ kg/day PI-273 ;
[0071] b.肿瘤重量；
[0072] c.小鼠体重变化；
[0073] d. MCF-7移植瘤的组织切片TUNEL染色；
[0074] e. MCF-7移植瘤的组织切片Ki-67染色；
[0075] f. PI-273对MCF-7移植瘤磷酸化AKT蛋白水平和PI4P含量的影响。
【具体实施方式】
[0076] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0077] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0078] 下述实施例细胞在DMEM营养混合物（Kaighn' s改进）中培养，该营养混合物含有 10%胎小牛血清（Hycloe)、硫酸链霉素（100ug/ml)和氨节青霉素（100单位/ml)。按照制 造商的使用说明，通过使用阳离子型脂质如Lipofectamine 2000 (invitrogen)，在6孔或 6-cm板中进行转染（30% -60%汇合）。转染之后6小时细胞换液。
[0079] 下述实施例PI4KII α蛋白通过如下方法制备：
[0080] 表达ΡΙ4ΚΙΙ α和GST的重组载体为将序列2所示的ΡΙ4ΚΙΙ α蛋白编码基因插入 PGEX-6P-1载体的EcoR I和Xho I酶切位点得到的重组载体；再将表达ΡΙ4ΚΙΙ α和GST的 重组载体在Ε. coli BL21菌株中表达。菌株在37°C生长到0D600达到I. 0左右后加入0. 3mM IPTG 在 16°C诱导表达 18h。收菌后用含 50mM H印es，lM NaCl，2mM DTT，20mM MgC12，lmM PMSF，lmg/ml溶菌酶的溶液重悬。用高压破碎仪在30000psi破碎细菌。4°C转速12000g下 离心40min，取上清用GST亲和柱继续纯化。GST标签用PreScission蛋白酶在4°C含50mM !fepes, 300mM NaCl, 0· 1% Triton X-100 和 2mM MgC12 的溶液中酶切过夜，获得 PI4KII α 蛋白
[0081] 下述实施例ΡΙ4ΚΙΙ α激酶活性通过ADP-Glo激酶试剂盒（出售公司：Promega, 产品目录号：V9102)检测ADP的产生，具体如下：
[0082] 将不同量的PMKIIa蛋白溶解在反应溶液中得到PMKIIa蛋白溶液，不同量的 底物磷脂酰肌醇（出售公司：Sigma，产品目录号：Ρ6636)用反应溶液重悬超声30分钟，得 到PI溶液；再将1 μ I PI4KII α蛋白溶液、7 μ 1反应溶液和10 μ I PI溶液混合，加入2 μ 1 ATP(出售公司：Promega，产品目录号：V9102)在室温下反应Imin ;再加入20 μ I ADP-Glo 试剂（ADP-Glo激酶试剂盒中自带）终止反应，室温孵育60分钟；再加入40 μ 1激酶检测试 剂（ADP-Glo激酶试剂盒中自带），室温继续孵育60分钟后，用Promega Glomax发光检测仪 在整合时间1秒记录化学发光信号值。
[0083] 反应溶液由 50mM H印es、300mM NaClUmM EDTA、20mM MgCl2和水组成。
[0084] 产物ADP的生成量与读取化学发光信号值的函数式：Y = 〇.〇〇〇〇〇〇431269X，Y表 示产物ADP的生成量（ηΜ)，X表示读取的化学发光信号值。
[0085] 下述实施例ΡΙ4Ρ含量检测方法如下：
[0086] 用5 μ 1的CHCl3: MeOH: Η20 (1:2:0. 8)混合液重悬样品，冰水浴超声5分钟后将点 样到ΡΙ4Ρ膜上；用含3% BSA的PBS-T溶液封闭1小时后加入5mL ΡΙ4Ρ检测溶液（出售 公司：Echelon Biosciences,产品目录号：K-4000)，室温孵育1小时；用PBS-T溶液（IOmM 磷酸盐，2. 7mM氯化钾，137mM氯化钠，0. 1 % Tween-20, pH 7. 4)清洗3次每次5分钟；加 入5mL PI4P二抗检测溶液（出售公司：Echelon Biosciences,产品目录号：K-4000)，室温 孵育1小时；用PBS-T溶液清洗3次每次5分钟；检测化学发光信号。
[0087] 上述CHCl3: MeOH: H20 (1:2:0. 8)混合液为将CHCl3、MeOH和H20按照体积比为 1:2:0. 8混合，得到的混合液。
[0088] 下述实施例动物研究的方法如下：
[0089] 按照食品与药物管理局的非临床实验室研究的良好实验室规范（GLP条例）和根 据作为立法基础的德国动物保护法进行体内实验。八周大小的雄性BALB/c裸鼠在SPF条 件下保养，皮下注射MCF-7细胞，接种4天后，按剂量25mg/kg/day腹腔注射PI-27315天后 处死小鼠。期间用游标卡尺每周测三次肿瘤大小并计算肿瘤体积[(最小直径） 2X最大直 径]/2。
[0090] 实施例1、PI4KII α的小分子抑制剂PI-273的筛选
[0091] ΡΙ4ΚΙΙ α的氨基酸序列为序列1。
[0092] 基于ΡΙ4ΚΙΙ α结构从SPECS化合物库中虚拟筛选潜在的小分子抑制剂，最终选 择了 142个化合物。检测了这些化合物在100 μ M时对PMKIIa抑制效果，进一步确定化 合物对ΡΙ4ΚΙΙ α的半数抑制浓度。其中ΡΙ-93表现最好的抑制效果。根据ΡΙ-93化学结 构选择了 53个候选化合物，其中ΡΙ-273在体外酶活实验中IC5。为0. 47 μ Μ，显著抑制3种 乳腺癌MCF-7，Hs 578Τ，T-47D细胞系的生长。ΡΙ-273处理MCF-7细胞后，ΡΙ4Ρ含量降低。 PI-273是PI4KII α潜在的激酶活性抑制剂。
[0093] ΡΙ_273(结构式为式1)的筛选见图1所示，其中，a、PI-273和ΡΙ-69的化学结构 式；b、用PI4K激酶活性检测方法检测不同化合物对PI4KII α体外酶活抑制效果，化合物 对乳腺癌细胞MCF-7, Hs 578Τ，T-47D细胞系处理3天后检测对细胞增殖能力的抑制效果； c.用1 μ M和3 μ M PI-273处理MCF-7细胞2天后收取细胞检测PI4P的含量变化。
[0094] PI-273的化学结构式如下式1所示：
[0096] 实施例2、PI-273抑制PI4KII α酶活性
[0097] 一、PI-273直接结合ΡΙ4ΚΙΙ α并可逆的抑制ΡΙ4ΚΙΙ α
[0098] 检测PI-273及其类似物ΡΙ-69、ΡΙ-277、ΡΙ-282与ΡΙ4ΚΙΙα是否有相互作用，下 面的化合物分别为ΡΙ-273、ΡΙ-69、ΡΙ-277和ΡΙ-282。具体如下：
[0099] ΡΙ-69结构式为式2所示：
[0101] ΡΙ-277结构式为式3所示：
[0102]
[0103] PI-282结构式为式4所示：
[0105] 1)表面等离子共振实验
[0106] 表面等离子共振实验在GE公司的Biacore T200进行。PMKIIa蛋白与CM5芯片 共价固定，芯片在含 IOmM HEPES(pH 7. 4)，150mM NaCl, 3mM EDTA, 0· 05% (v/v)表面活性剂 P20, 0· 1% (v/v)DMS0 的 HBS-EP 溶液中平衡；
[0107] PI-273、PI-69、PI-277和PI-282分别等梯度稀释后与芯片结合解离各120秒；根 据Biacore T200分析软件计算检测化合物与蛋白的结合解离常数。
[0108] 测得的PI-273结合解离常数为9. 49 μ M (图2a)，PI-277结合解离常数为 9. 59 μ M，PI-282结合解离常数为5. 91 μ M。
[0109] 上述结果表明，ΡΙ-273、ΡΙ-69、ΡΙ-277和PI-282均能与ΡΙ4ΚΙΙ α蛋白相互作用。
[0110] 2)蛋白热稳定性
[0111] 蛋白热稳定性实验在ABI公司的7500快速实时荧光定量PCR仪中进行。在含有 5 μΜ PMKIIa蛋白、5XSYPRO orange试剂（出售公司：Sigma,产品目录号：S5692)和化 合物的20 μ 1反应溶液从25°C加热到95°C，通过蛋白热稳定性软件计算溶解温度值。
[0112] 上述化合物分别为 5 μΜ PI-273U0 μΜ PI-273U5 μΜ ΡΙ-273、20 μΜ PI-273、 25 μΜ ΡΙ-273、40μΜ ΡΙ-273、50μΜ PI-273 或 40 μΜ PI-69。
[0113] 蛋白热稳定性分析结果如图2b所示，表明ΡΙ-273能剂量依赖的增大ΡΙ4ΚΙΙ α的 溶解温度，而对PMKIIa无抑制效果的ΡΙ-69却不会增大PMKIIa的溶解温度。
[0114] 3)细胞热转移分析实验
[0115] MCF-7 细胞（购自 ATCC，ATCC 编号iVTCC1? HTB-22?)在含有 1 μ M PI-273 的细胞 培养基中培养96小时后，收取细胞。液氮反复冻融3次，20000g离心30分钟，取上清50ul 每管分装在不同温度梯度下加热3分钟后室温冷却3分钟；加热后的裂解液20000g离心30 分钟，取上清，为ΙμΜ PI-273处理MCF-7细胞产物，上样电泳，免疫印迹分析PMKIIa蛋 白量。以DMSO为对照。
[0116] MCF-7细胞液氮反复冻融3次，20000g离心30分钟，取上清50ul每管分装在不同 温度梯度下加热3分钟后室温冷却3分钟；获得MCF-7细胞裂解液，向MCF-7细胞裂解液中 加入终浓度20 μ M PI-273,静置30分钟后在不同温度梯度下加热3分钟后室温冷却3分 钟，20000g离心30分钟，取上清，为细胞裂解液用20 μ M ΡΙ-273处理30分钟产物，上样电 泳，免疫印迹分析PMKIIa蛋白量。
[0117] 结果如图2c所示，用1 μΜ ΡΙ-273处理MCF-7细胞96小时（273体内）和细胞裂解 液用20 μΜ ΡΙ-273处理30分钟（273体外）都会显著的改变ΡΙ4ΚΙΙ a的溶解曲线。对照 处理中，50% PMKIIa蛋白降解发生在60°C，而PI-273处理后，降解温度增大到72°C (细 胞）和80°C (细胞裂解液）。
[0118] 4)反应初速率
[0119] A、PI_273与PI4KII a孵育时间的影响
[0120] 将lug PI